曹華盛，李 堂,2，熊 亮，王福軍，李曙光，顧海永，何 高，羅文永，梁世胡

(1 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所,廣東 廣州 510640；2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)

水稻OryzasativaL.是我國(guó)最重要的糧食作物之一，它以占全國(guó) 28.1%的糧食播種面積，生產(chǎn)出全國(guó) 40.2%的糧食[1]，對(duì)保障我國(guó)的糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有舉足輕重的意義。自20世紀(jì)50年代以來(lái)，經(jīng)過(guò)幾代育種家的不懈努力，水稻單產(chǎn)實(shí)現(xiàn)了3次質(zhì)的飛躍，徹底解決了14億中國(guó)人的溫飽問(wèn)題[2]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)稻米的品質(zhì)要求也越來(lái)越高，產(chǎn)量高而米質(zhì)不理想的“稻強(qiáng)米弱”現(xiàn)象顯得愈發(fā)突出，因此“產(chǎn)量和品質(zhì)協(xié)同提升”取代“產(chǎn)量?jī)?yōu)先”及“產(chǎn)量為先兼顧品質(zhì)”，日益成為水稻育種家重視的課題。

隨著飲食結(jié)構(gòu)的精細(xì)化以及生活水平的不斷提高，人們對(duì)大米的外觀(guān)品質(zhì)、適口性及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的要求都不斷提高。脂類(lèi)作為稻米主要的儲(chǔ)藏物質(zhì)之一，不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且對(duì)稻米品質(zhì)尤其是蒸煮食味品質(zhì)也具有較大影響[3-7]。脂類(lèi)主要以貯藏脂肪形式存在于稻米中。水稻種子在開(kāi)花后5～12 d 迅速積累貯藏油脂，其主要成分是三酰甘油(Triacylglycerol,TAG)，由脂肪酸與甘油脫水縮合生成。溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAT)催化溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)sn-2位?；纬闪字?Phosphatidic acid,PA)，是油脂從頭合成中的關(guān)鍵限速酶之一[8]。目前，研究人員已從多種植物中分離得到LPAT基因，包括擬南芥Arabidopsis[9-10]、棉花Gossypium[11-12]、玉米Zeamays[13]、花生Araxhis hypogaea[14]、蓖麻Ricinuscommunis[15]等。擬南芥基因組中存在 5個(gè)LPAT基因，廣泛參與了擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)生物學(xué)過(guò)程。其中，AtLPAT1參與葉綠體中的磷脂合成，它的缺失將導(dǎo)致胚胎致死現(xiàn)象的發(fā)生[16]；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的AtLPAT2參與了磷脂的從頭合成途徑，在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段起著重要的作用，而且它能通過(guò)刺激磷脂的合成而參與擬南芥對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)[17-19]；AtLPAT4和AtLPAT5參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中磷脂的合成，從而正調(diào)控?cái)M南芥對(duì)低氮脅迫的響應(yīng)[20]。另外，有研究顯示水稻LPAT2及其產(chǎn)物PA通過(guò)介導(dǎo)脫落酸(Abscisic acid,ABA)信號(hào)正調(diào)控水稻對(duì)高滲脅迫的響應(yīng)[21]。除參與磷脂合成外，LPAT基因家族成員也參與了油菜Brassicanapus、棉花、花生和蓖麻等作物種子中油脂TAG的合成。研究表明，超表達(dá)BnLPAT2和BnLPAT5分別通過(guò)促進(jìn)二?；视偷暮铣杉傲字岬暮铣啥@著提高油菜種子的含油量[22]；在擬南芥中超表達(dá)花生AhLPAT2，能顯著提高超表達(dá)材料種子中的含油量[23]；在蓖麻中超表達(dá)RcLPAT2不僅能提高總含油量，還能提高油脂TAG中的不飽和脂肪酸含量[24]。

到目前為止，關(guān)于水稻LPAT基因家族在水稻籽粒油脂合成中的功能鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，研究LPAT家族在籽粒油脂合成中的作用，挖掘LPAT家族各成員的可用遺傳變異，對(duì)于高油性品質(zhì)水稻品種的遺傳改良和培育具有重要意義。LPAT家族在水稻基因組中存在5個(gè)成員，但目前僅有LPAT2被報(bào)道與高滲脅迫響應(yīng)相關(guān)，其在水稻籽粒油脂合成中的功能鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)生物信息學(xué)、比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等方法對(duì)水稻LPAT基因家族成員的可能功能進(jìn)行分析，以期為深入解析該基因家族成員在水稻生長(zhǎng)發(fā)育及籽粒油脂合成中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用水稻品種為‘廣8B’(G8B)和‘象牙香占’(XYXZ)，兩者均系廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所培育的優(yōu)質(zhì)水稻品種。其中‘廣8B’為廣東省大面積推廣三系不育系‘廣8A’對(duì)應(yīng)的保持系，其飯味具有油性好、松軟彈滑的特征[25]。

1.2 試驗(yàn)處理及樣品準(zhǔn)備

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組分析 1)樣品準(zhǔn)備：種植水稻品種‘廣8B’和‘象牙香占’分別在灌漿初期(授粉后10 d，10 DAF)、灌漿中期(授粉后20 d，20 DAF)、灌漿后期(授粉后30 d，30 DAF)取水稻種子樣品；2)樣品前處理：與葉片組織相比，水稻胚乳(種子)含有大量的淀粉，故抽提 RNA 時(shí)主要注意除去淀粉且防止 RNA 被淀粉粒包裹后一同沉降，抽提緩沖液的高濃度鹽離子有助于達(dá)到這一目的。提取Buffer 為：4 mol 尿素，4 mol 鹽酸胍，3 mmol EDTA，10 mmol HEPES(pH7.0)，提取方法與 Trizol法類(lèi)似；提取完成后檢測(cè) RNA 質(zhì)量，將質(zhì)量合格的RNA 送至武漢邁維代謝有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；3)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：采用 Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，其程序主要包括 RNA 樣品檢測(cè)，富集mRNA，合成雙鏈 cDNA，文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)檢測(cè)和Illumina HiSeq 平臺(tái)測(cè)序；4) 結(jié)果分析：根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)差異。

1.2.2 脂質(zhì)代謝組分析 種植水稻品種‘廣8B’和‘象牙香占’，分別在灌漿初期(10 DAF)、灌漿中期(20 DAF)、灌漿后期(30 DAF)取水稻種子樣品；將稻米搗碎，稱(chēng)取米粉約 200 mg，加入內(nèi)標(biāo)(0.1 mg/mL，10 μL)，再用正己烷 3 mL 超聲提取 1 h，取上清，再加入異丙醇 3 mL 再次提取 30 min，合并兩次上清，氮吹儀吹干，用異丙醇復(fù)溶至 1 mL，5 000 r/min離心 10 min，過(guò) 0.22 μmol 濾器；用UPLC-Qtof 法測(cè)定脂質(zhì)成分及含量，其色譜系統(tǒng)為shimadzu UPLC LC-30AD，色譜柱為Phenomenex Kinete C18 column(100 ?×2.1 mm，2.6 μm)，進(jìn)樣量10μL，流速0.4 mL/min，柱溫60 ℃，樣品室溫度4 ℃。A 相：H2O∶MeOH∶ACN(含 5 mmol NH4Ac)體積比為1∶1∶1；B 相：IPA∶乙腈(含 5 mmol NH4Ac) 體積比為5∶1。梯度洗脫條件：0.5 min，體積分?jǐn)?shù)(φ)為20%的B相；1.5 min，φ為40%的B相；3 min，φ為60%的B相；13 min，φ為98%的B相；13.1 min，φ為20%的B相；17 min，φ為20%的B相。質(zhì)譜系統(tǒng)：ABSciex TripleTOF? 6 600，ESI 離子源，正模式，質(zhì)譜采集的質(zhì)量數(shù)范圍為m/z100～1 200，質(zhì)譜條件：Curtain Gas：35.000 psi；Ion Source Gas1：50.000 psi；Ion Source Gas2：50.000 psi；IonSpray Voltage：5 500.00 V；Temperature: 600 ℃。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 同源基因查找 在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org)中下載擬南芥LPAT蛋白序列(At4g30580、At3g57650、At1g51260、At1g75020和At3g18850,)，通過(guò)NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST比對(duì)同源基因，得到候選水稻LPAT家族成員，同時(shí)，在Ensemble plant 水稻數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/Oryza_sativa/Info/Index)中搜索關(guān)鍵詞Lysophosphatidic acid acyltransferase，比較2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的搜索結(jié)果，最終確認(rèn)水稻LPAT基因家族成員，并利用Expasy在線(xiàn)網(wǎng)站(http://www.expasy.org)分析相關(guān)蛋白的氨基酸長(zhǎng)度、分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、水溶指數(shù)等。

1.3.2 保守結(jié)構(gòu)域分析 分別通過(guò)Interproscan(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)及SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)數(shù)據(jù)庫(kù)分析水稻LPAT家族成員的保守結(jié)構(gòu)域；保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析：利用MEME在線(xiàn)網(wǎng)站(https://memesuite.org/meme/tools/meme)對(duì)LPAT家族成員進(jìn)行基序分析，利用GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)分析OsLPAT家族成員基因結(jié)構(gòu)，并使用TBtools軟件進(jìn)行可視化。

1.3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 為了進(jìn)一步了解LPAT在植物系統(tǒng)中的進(jìn)化關(guān)系，本研究收集了水稻、擬南芥、雷蒙德氏棉Gossypiumraimondii、蓖麻、大豆Glycinemax、二穗短柄草Brachypodium distachyon、小麥Triticumaestivum、高粱Sorghum bicolor、花生、亞麻薺Camelinasativa、歐洲油菜Brassicanapus等11種作物的LPAT蛋白序列注釋文件，利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，建樹(shù)完成后在Itol(https://itol.embl.de/tree/)網(wǎng)站進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的進(jìn)一步美化。

1.3.4 順式作用元件分析 利用plantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant care/html/)對(duì)水稻LPAT家族成員起始密碼子上游2 kb序列進(jìn)行順式作用元件分析，以期揭示OsLPAT可能的生物學(xué)功能。

1.3.5 時(shí)空表達(dá)譜、激素和逆境表達(dá)譜分析 利用RAP-DB(https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)數(shù)據(jù)庫(kù)分析水稻LPAT基因家族在水稻生長(zhǎng)發(fā)育不同階段組織中的表達(dá)量，以及在不同激素處理及非生物脅迫條件下的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻LPAT家族成員鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

通過(guò)比對(duì)NCBI中BLASTP及Ensemble plant中關(guān)鍵詞搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水稻LAPT基因家族共有5個(gè)成員，分別為Os10g0497100 (OsLPAT1)、Os11g0637800 (OsLPAT2)、Os04g0625200(OsLPAT3)、Os05g0502200 (OsLPAT4)和Os01g0782500 (OsLPAT5)。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，sLPAT基因家族成員編碼蛋白的氨基酸數(shù)量在292～399，相對(duì)分子質(zhì)量在32 317.06～45 773.74,等電點(diǎn)大于8.5，亞細(xì)胞預(yù)測(cè)均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(表1)。

表1 水稻LPAT基因鑒定及其編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析Table 1 Identification of rice LPAT genes and physicochemical properties analyses of encoded proteins

2.2 保守結(jié)構(gòu)域分析

Interproscan數(shù)據(jù)庫(kù)中的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，通過(guò)同源搜索得到的5個(gè)OsLPAT均具有PF01553(Acyltransferase C-terminus)這一保守結(jié)構(gòu)域；另外，SMART數(shù)據(jù)庫(kù)中的分析結(jié)果顯示，OsLPAT家族成員均具有PlsC(Phosohate acyltransferases)保守結(jié)構(gòu)域。除此之外，OsLPAT2、OsLPAT4、OsLPAT5均含Acyltransf_C端結(jié)構(gòu)域(圖1)，上述結(jié)果表明，通過(guò)生物信息學(xué)分析得到的5個(gè)OsLPAT可能具有?；D(zhuǎn)移酶活性，推測(cè)其在催化溶血磷脂酸向磷脂酸轉(zhuǎn)化的過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖1 OsLPAT家族保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Conservative structural domain analysis of OsLPAT family

2.3 保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析是分析基因間同源性高低的重要手段。MEME分析結(jié)果顯示，水稻LPAT家族成員之間保守基序數(shù)量存在較大差異(圖2)。其中OsLPAT1和OsLPAT3僅分別存在1個(gè)保守的Motif(Motif 2和Motif 8)，而OsLPAT4和OsLPAT5則存在8個(gè)同樣的保守基序(Motif 1～Motif 8)，這個(gè)結(jié)果表明，水稻LPAT家族成員之間功能可能存在分化，而OsLPAT4和OsLPAT5同源性較高，功能上可能存在冗余。另外，我們還分析了水稻LPAT基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)(圖3)。結(jié)果顯示OsLPAT1、OsLPAT3、OsLPAT4和OsLPAT6分別具有4～6個(gè)外顯子，而OsLPAT2基因則由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成。這個(gè)結(jié)果預(yù)示著OsLPAT1、OsLPAT3、OsLPAT4和OsLPAT6在進(jìn)化上是比較保守的，而OsLPAT2在進(jìn)化中可能經(jīng)歷了選擇性剪接或基因復(fù)制事件。

圖2 水稻LPAT家族蛋白保守基序分析Fig.2 The conserved motif analysis of rice LPAT family proteins

圖3 水稻LPAT家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Gene stucture analysis of rice LPAT family

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為了進(jìn)一步了解LPAT在植物系統(tǒng)中的進(jìn)化關(guān)系，本研究獲取水稻、擬南芥、玉米、大豆、小麥、高粱等6種作物的LPAT蛋白序列注釋文件，然后利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。建樹(shù)完成后，在Itol網(wǎng)站進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的進(jìn)一步美化。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，與擬南芥相比，水稻中LPAT蛋白家族同樣存在5個(gè)成員，分別命名為OsLPAT1～OsLPAT5，而且OsLPAT2和OsLPAT3同源性較高，而OsLPAT4則與OsLPAT5同源性較高，這與我們利用MEME分析得到的結(jié)果是一致的。我們還發(fā)現(xiàn)除大豆外，其他植物中LPAT蛋白家族均可分為5個(gè)亞家族(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ)(圖4)。我們的結(jié)果還顯示，OsLPAT1、OsLPAT2、OsLPAT3和OsLPAT5與高粱、玉米的家族基因在進(jìn)化分支上聚為同一類(lèi)。表明同為L(zhǎng)PAT基因在單子葉植物中是較為保守的，可能具有類(lèi)似的生物學(xué)功能。

圖4 植物L(fēng)PAT家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic analysis of LPAT family in plant

2.5 順式作用元件分析

啟動(dòng)子區(qū)域的順式調(diào)控元件不僅可能影響基因的時(shí)空表達(dá)模式，而且還會(huì)影響基因?qū)ν饨绛h(huán)境(如激素和逆境脅迫)的響應(yīng)過(guò)程。為了了解水稻LPAT家族成員的表達(dá)特性，我們將OsLPAT1～OsLPAT5這5個(gè)基因起始密碼子上游2 kb序列進(jìn)行了順式作用元件分析。結(jié)果顯示，OsLPAT3啟動(dòng)子區(qū)存在生長(zhǎng)素響應(yīng)、茉莉酸甲酯和赤霉素信號(hào)響應(yīng)元件，OsLPAT4啟動(dòng)子區(qū)存在生長(zhǎng)素響應(yīng)元件，另外，在OsLPAT1、OsLPAT2、OsLPAT5啟動(dòng)子區(qū)均發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)元件，而在OsLPAT2啟動(dòng)子區(qū)則發(fā)現(xiàn)存在厭氧誘導(dǎo)元件(圖5)。上述結(jié)果表明，OsLPAT家族成員可能參與了水稻對(duì)眾多植物激素及逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程。

圖5 水稻LPAT基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-acting elements in promoters of rice LPAT gene family

2.6 組織表達(dá)譜、激素和逆境表達(dá)譜分析

為了了解水稻LPAT家族基因的表達(dá)特性，我們利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)提取了水稻LPAT基因在水稻葉片、葉鞘、根和莖，3～4 mm的幼穗以及授粉后7、14、28和42 d胚胎的表達(dá)量(圖6)。結(jié)果顯示：OsLPAT2和OsLPAT5在水稻整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá)，其中OsLPAT2在根、莖、3～4 mm的幼穗和葉鞘、7 d的胚中表達(dá)量較高；OsLPAT4在胚、莖和3～4 mm的幼穗中呈現(xiàn)出較高表達(dá)量；OsLPAT3在葉鞘中表達(dá)量較高；而OsLPAT1各生長(zhǎng)發(fā)育階段表達(dá)量均較低。上述結(jié)果表明，水稻LPAT基因家族成員可能存在功能分化，分別參與了對(duì)水稻不同生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。另外，為了進(jìn)一步探討水稻LPAT基因家族成員是否參與了水稻對(duì)激素及非生物逆境的響應(yīng)，我們利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)信息分析了LPAT基因家族各成員在ABA、油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroids，BR)、生長(zhǎng)素(Auxin，IAA)、赤霉素(Gibberellin，GA)、茉莉酸(Jasmonic acid，JA)、細(xì)胞分裂素(Cytokinin，CTK)處理?xiàng)l件下的表達(dá)量，結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，OsLPAT2受到了各種激素及逆境脅迫的誘導(dǎo)，包括ABA、BR、CK、N-、P-的誘導(dǎo)。OsLPAT1、OsLPAT3和OsLPAT5受到ABA處理的誘導(dǎo)，其中OsLPAT3的表達(dá)量在ABA處理3 h后上升了將近100倍，而OsLPAT3的表達(dá)量特異性地受到了氧化脅迫的誘導(dǎo)(圖7)。上述結(jié)果表明，水稻LPAT基因家族成員廣泛參與了植物對(duì)激素和逆境脅迫的響應(yīng)。

圖6 水稻LPAT基因家族組織表達(dá)譜分析Fig.6 Tissue expression profile analysis of rice LPAT gene family

圖7 水稻LPAT基因家族激素和逆境表達(dá)譜分析Fig.7 Hormone and stress expression profiles of rice LPAT gene family

2.7 OsLPAT家族成員在水稻籽粒油脂合成中的作用分析

為了進(jìn)一步分析OsLPAT家族成員在水稻籽粒油脂合成中的作用，我們測(cè)定了水稻品種‘象牙香占’和‘廣8B’抽穗30 d后籽粒中的油脂含量(圖8A)，測(cè)定結(jié)果顯示‘廣8B’(G8B)籽粒中的油脂含量(22 234 nmol/g)顯著高于‘象牙香占’(XYXZ)籽粒中的油脂含量(17 058 nmol/g)。油脂TAG組分分析顯示‘廣8B’油脂各TAG組分顯著高于‘象牙香占’，特別是TAG (50∶2)、TAG (54∶2)、TAG (56∶3)、TAG (54∶4)、TAG (54∶5)和TAG (54∶6)等富含不飽和脂肪酸的油脂組分(圖8B)。為了進(jìn)一步分析造成2個(gè)品種水稻籽粒油脂含量差異的原因，我們對(duì)這2個(gè)材料不同時(shí)期的籽粒樣品(分別于抽穗后10、20和30 d取樣)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序，并對(duì)其中影響籽粒油脂代謝的相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了比較分析(圖9)。通過(guò)分析‘廣8B’與‘象牙香占’籽粒不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)油脂代謝通路相關(guān)基因在籽粒發(fā)育的不同階段(前/中/后期)發(fā)揮作用，2個(gè)品種籽粒中油脂含量的差異可能是受多基因共同調(diào)控的結(jié)果。其中，在‘廣8B’籽粒發(fā)育前期(授粉后10 d,10 DAF)，OsLPAT5/OsPLDα6/OsPLDα8/OsPLDδ3基因的表達(dá)量顯著高于其在‘象牙香占’相同發(fā)育時(shí)期籽粒中的表達(dá)量；在‘廣8B’籽粒發(fā)育中期(授粉后20 d,20DAF)，OsGPAT3/OsGPAT8/OsLPAT2/OsPLDδ1/OsPLDκ/OsNPC1/OsNPC3/OsWSD/DGAT-3的表達(dá)量顯著高于其在‘象牙香占’相同發(fā)育時(shí)期籽粒中的表達(dá)量；而到了籽粒發(fā)育后期(授粉后30 d，30 DAF)，我們同樣觀(guān)察到OsLPAT3/OsLPAT4/OsPLDα2/OsPLDβ1/OsPLDδ1/OsPLDδ2/OsDGAT2-2/OsWSD/OsDGAT-2在‘象牙香占’中的表達(dá)量顯著低于其在‘廣8B’相同時(shí)期籽粒中的表達(dá)量(圖9、圖10)。上述結(jié)果表明，在籽粒發(fā)育的不同時(shí)期，‘廣8B’和‘象牙香占’油脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)存在顯著差異，預(yù)示著這些基因表達(dá)差異可能是形成兩者籽粒中油脂含量差異的根本原因。

圖9 水稻品種‘象牙香占’和‘廣8B’籽粒油脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量分析Fig.9 Expression analyses of genes related to grain oil metabolism in rice varieties ‘Xiangya Xiangzhan’ and ‘Guang 8B’

圖10 水稻品種‘象牙香占’和‘廣8B’籽粒油脂代謝相關(guān)基因差異表達(dá)分析Fig.10 Differential expression of genes related to grain oil metabolism between rice varieties ‘Xiangya Xiangzhan’ and‘Guang 8B’

3 討論與結(jié)論

溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAT; EC 2.3.1.51)催化溶血磷脂酸(LPA)sn-2位置上?；磻?yīng)形成磷脂酸(PA)。越來(lái)越多的證據(jù)表明磷脂酸PA作為一個(gè)重要的信號(hào)分子在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，廣泛參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境響應(yīng)等眾多生物學(xué)過(guò)程[26-27]?，F(xiàn)有研究表明，PA的信號(hào)功能是通過(guò)其與靶標(biāo)蛋白的互作實(shí)現(xiàn)的。在動(dòng)物細(xì)胞中，人們最初認(rèn)為 PA 的作用依賴(lài)于其去磷酸化后的產(chǎn)物二?；视?，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)，PA通過(guò)直接與靶標(biāo)蛋白結(jié)合來(lái)發(fā)揮其功能。隨著對(duì) PA 信號(hào)研究的深入，不斷有新的PA靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)，包括一系列轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶和蛋白磷酸酶等。研究表明，PA對(duì)生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)對(duì)靶標(biāo)蛋白的調(diào)控(增強(qiáng)/減弱其活性、影響其亞細(xì)胞定位等)而得以實(shí)現(xiàn)。在ABA信號(hào)響應(yīng)中，PA和脫落酸鈍感蛋白1(Abscisic acid insensitive 1，ABI1)互作將ABI1錨定在質(zhì)膜上，阻止ABI1進(jìn)入細(xì)胞核，從而阻斷ABI1激活A(yù)BA信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)因子ATHB6的效應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)PA對(duì)ABA 信號(hào)的正調(diào)控作用[26]；此外，在擬南芥根中，PA能直接與轉(zhuǎn)錄因子Werewolf (WER) 互作并介導(dǎo)其入核發(fā)揮功能，從而調(diào)控根毛的生長(zhǎng)[27]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)OsLPAT3基因啟動(dòng)子區(qū)存在茉莉酸甲酯信號(hào)響應(yīng)元件，OsLPAT4基因啟動(dòng)子區(qū)存在生長(zhǎng)素信號(hào)響應(yīng)元件，而OsLPAT5基因啟動(dòng)子區(qū)則同時(shí)存在生長(zhǎng)素信號(hào)響應(yīng)與茉莉酸甲酯信號(hào)響應(yīng)元件，這些結(jié)果預(yù)示著水稻OsLPAT可能參與水稻對(duì)眾多激素的響應(yīng)過(guò)程。另外，在OsLPAT1、OsLPAT2及OsLPAT5基因啟動(dòng)子區(qū)還存在著低溫響應(yīng)元件及厭氧誘導(dǎo)元件等，暗示這些基因可能在水稻低溫響應(yīng)及厭氧條件下的生長(zhǎng)發(fā)育中起作用。此外，我們的分析結(jié)果還顯示，OsLPAT2和OsLPAT3受到了ABA處理的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，特別是OsLPAT2，其表達(dá)水平在ABA處理?xiàng)l件下比對(duì)照增加了100倍。上述結(jié)果暗示水稻OsLPAT可能通過(guò)介導(dǎo)磷脂酸PA的合成及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而參與了水稻對(duì)各種激素信號(hào)及逆境脅迫的響應(yīng)。但其具體功能及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

油脂(主要是三酰基甘油TAG)及其衍生物不僅是植物體內(nèi)重要的儲(chǔ)能物質(zhì)，同時(shí)也是植物中角質(zhì)等生物聚合物的不可或缺的成分[28-29]，在種子萌發(fā)和植物有性生殖等方面也發(fā)揮著重要的作用[30]?，F(xiàn)有的研究表明，溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶LPAT是油脂合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，其產(chǎn)物磷脂酸PA不僅具有脂質(zhì)第2信使的功能，還是植物合成各種磷脂和油脂的重要中間產(chǎn)物，在提高種子含油量及改良種子油性品質(zhì)等方面發(fā)揮著重要的作用。因此，LPAT與含油量的關(guān)系是前人研究LPAT功能的主要出發(fā)點(diǎn)。研究表明，在擬南芥中異位表達(dá)2個(gè)油菜LAPT異構(gòu)酶，均能通過(guò)增加含油量和增加粒重的方式提高產(chǎn)量[10]；研究人員通過(guò)研究油菜種子發(fā)育過(guò)程中Kennedy途徑的各種酶的活性變化,發(fā)現(xiàn)LPAT活性最高,且高含油量品系中LPAT活性高于低含油量品系[31]。另外，有研究表明，花生種子含油量的積累速率與溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶LPAT的表達(dá)量相對(duì)比，其變化是一致的[14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)水稻LPAT家族成員在籽粒發(fā)育的不同時(shí)期發(fā)揮著主導(dǎo)作用。在籽粒發(fā)育前期(抽穗后10 d)，高含油量的水稻籽?！畯V8B’中LPAT5的表達(dá)量顯著高于其在低含油量水稻籽?！笱老阏肌械谋磉_(dá)量；在籽粒發(fā)育中期(抽穗后20 d)，LPAT2在‘廣8B’籽粒中的表達(dá)量顯著高于其在‘象牙香占’中的表達(dá)量；而在籽粒發(fā)育后期(抽穗后30 d)，LPAT3和LPAT4的表達(dá)量在不同含油量水稻品種籽粒中存在顯著差異。上述結(jié)果表明，水稻LPAT基因家族各成員在籽粒發(fā)育的不同階段發(fā)揮其磷脂酸PA合成的作用，其表達(dá)差異可能是形成高含油量與低含油量水稻品種籽粒中油脂含量差異的重要原因。目前為止，水稻中關(guān)于LPAT基因家族功能的報(bào)道較少，而關(guān)于該家族各成員在油脂合成中的作用更是鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究對(duì)水稻LPAT基因家族詳細(xì)的生物信息學(xué)分析及其在水稻籽粒油脂合成中的作用初探，將為進(jìn)一步開(kāi)展該家族基因功能的研究打下基礎(chǔ)。