葛寧 姜媛媛 潘中平 萬杰

基金項(xiàng)目：河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃聯(lián)合共建項(xiàng)目（LHGJ20200761）

摘要：目的? 探討叉頭框M1（FOXM1）調(diào)控環(huán)狀RNA circ_NOTCH1對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及耐藥性的影響。方法? 采用Western blot、實(shí)時熒光定量PCR分別檢測胃癌及癌旁組織、人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞系MGC-803、HGC-27、BGC-823中FOXM1蛋白及circ_NOTCH1表達(dá)。將BGC-823細(xì)胞分為對照組、短發(fā)夾RNA FOXM1（sh-FOXM1）及陰性對照（sh-NC）組、小干擾RNA circ_NOTCH1（si-circ_NOTCH1）及陰性對照（si-NC）組、sh-FOXM1+circ_NOTCH1過表達(dá)質(zhì)粒（sh-FOXM1+pcDNA-circ_NOTCH1）及sh-FOXM1+陰性對照（sh-FOXM1+pcDNA）組，采用CCK-8法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖，Transwell檢測細(xì)胞侵襲。各組細(xì)胞分別加入1.0 mg/L阿霉素處理48 h后分析細(xì)胞耐藥性，Western blot檢測FOXM1、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、Bax、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）、多藥耐藥基因1（MDR1）的表達(dá)，RNA下拉和RNA免疫沉淀檢測FOXM1蛋白與circ_NOTCH1結(jié)合情況。結(jié)果? 與癌旁組織比較，胃癌組織FOXM1蛋白、circ_NOTCH1表達(dá)水平顯著升高（P均<0.001）；與GES-1細(xì)胞比較，MGC-803、HGC-27、BGC-823細(xì)胞FOXM1蛋白、circ_NOTCH1表達(dá)水平顯著升高（P均<0.001）。與對照組和sh-NC組比較，sh-FOXM1組BGC-823細(xì)胞FOXM1蛋白、circ_NOTCH1、吸光度值、克隆形成率、細(xì)胞侵襲數(shù)量、細(xì)胞活力及PCNA、MRP1、MDR1蛋白表達(dá)顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高（P均<0.001）；與對照組和si-NC組比較，si-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞circ_NOTCH1、吸光度值、克隆形成率、細(xì)胞侵襲數(shù)量、細(xì)胞活力及PCNA、MRP1、MDR1蛋白表達(dá)顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高（P均<0.001）。與sh-FOXM1組和sh-FOXM1+pcDNA組比較，sh-FOXM1+pcDNA-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞circ_NOTCH1、吸光度值、克隆形成率、細(xì)胞侵襲數(shù)量、細(xì)胞活力及PCNA、MRP1、MDR1蛋白表達(dá)顯著升高，Bax蛋白表達(dá)顯著降低（P均<0.001）。FOXM1蛋白可與circ_NOTCH1相互作用。結(jié)論? 干擾FOXM1可能通過下調(diào)circ_NOTCH1表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及耐藥性。

關(guān)鍵詞：叉頭框M1；circ_NOTCH1；胃癌；增殖；耐藥性

中圖分類號： R735.2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）05-0713-08

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15584

Forkhead Box M1 Regulates the Proliferation，Invasion，and Drug Resistance of Gastric Cancer Cells via circ_NOTCH1

GE Ning1，JIANG Yuanyuan2，PAN Zhongping1，WAN Jie1

1Department of Anorectal Surgery，2Department of Gastroenterology，Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China

Corresponding author：GE Ning? Tel：0371-61310882，E-mail：drninger@163.com

ABSTRACT：Objective? To investigate the impacts of forkhead box M1（FOXM1）on the proliferation，invasion，and drug resistance of gastric cancer cells by regulating the circular RNA circ_NOTCH1.Methods? Western blotting and real-time quantitative PCR were performed to determine the expression of FOXM1 protein and circ_NOTCH1，respectively，in the gastric cancer tissue，para-carcinoma tissue，human normal gastric mucosa epithelial cell line GES-1 and gastric cancer cell lines MGC-803，HGC-27，and BGC-823.BGC-823 cells were classified into the following groups：control，short hairpin RNA FOXM1（sh-FOXM1）and negative control（sh-NC），small interfering RNA circ_NOTCH1（si-circ_NOTCH1）and negative control（si-NC），and sh-FOXM1+circ_NOTCH1 overexpression plasmid（sh-FOXM1+pcDNA-circ_NOTCH1）and sh-FOXM1+negative control（sh-FOXM1+pcDNA）.CCK-8 assay and clone formation assay were employed to measure the cell proliferation，and Transwell assay to measure cell invasion.After treatment with 1.0 mg/L adriamycin for 48 h，the cell resistance in each group was analyzed.Western blotting was employed to determine the expression levels of FOXM1，proliferating cell nuclear antigen（PCNA），Bax，multi-drug resistance-associated protein 1（MRP1），and multi-drug resistance gene 1（MDR1）.RNA pull-down and RNA immunoprecipitation were employed to examine the binding of circ_NOTCH1 to FOXM1 protein.Results? Compared with those in the para-carcinoma tissue，the expression levels of FOXM1 protein and circ_NOTCH1 in the gastric cancer tissue were up-regulated（all P<0.001）.Compared with GES-1 cells，MGC-803，HGC-27，and BGC-823 cells showed up-regulated expression levels of FOXM1 protein and circ_NOTCH1（all P<0.001）.Compared with the control group and sh-NC group，the sh-FOXM1 group with down-regulated expression of FOXM1 protein and circ_NOTCH1 showed decreased optical density value，clone formation rate，cell invasion number，and cell viability，down-regulated expression of PCNA，MRP1，and MDR1，and up-regulated expression of Bax protein in BGC-823 cells（all P<0.001）.Compared with the control group and the si-NC group，the si-circ_NOTCH1 group with down-regulated expression of circ_NOTCH1 showed decreased optical density value，clone formation rate，cell invasion number，and cell viability，down-regulated expression of PCNA，MRP1，and MDR1，and up-regulated expression of Bax protein in BGC-823 cells（all P<0.001）.Compared with sh-FOXM1 group and sh-FOXM1+pcDNA group，the sh-FOXM1+pcDNA-circ_NOTCH1 group with up-regulated expression of circ_NOTCH1 showed increased optical density value，clone formation rate，cell invasion number，and cell viability，up-regulated expression of PCNA，MRP1，and MDR1，and down-regulated expression of Bax protein（all P<0.001）.FOXM1 protein was able to interact with circ_NOTCH1.Conclusion? Interference with FOXM1 may inhibit the proliferation，invasion，and drug resistance of gastric cancer cells by silencing circ_NOTCH1 expression.

Key words：forkhead box M1；circ_NOTCH1；gastric cancer；proliferation；drug resistance

Acta Acad Med Sin，2023，45（5）：713-720

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，也是一個全球性的健康問題［1］。盡管隨著醫(yī)療實(shí)踐和技術(shù)的發(fā)展，胃癌的發(fā)病率有所下降，但由于我國胃癌患者就診較晚，其死亡率仍然很高，五年生存率低于30%［2］。此外，耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重影響胃癌患者的預(yù)后生存率［3］。因此，需要進(jìn)一步探索胃癌發(fā)生和耐藥的潛在機(jī)制。叉頭框M1（forkhead box M1，F(xiàn)OXM1）是叉頭框家族的成員之一，具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，細(xì)胞增殖、分化和侵襲等作用［4］。據(jù)報道，過表達(dá)FOXM1可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長和侵襲，且可參與腫瘤耐藥過程［5-6］。此外，相關(guān)研究顯示，環(huán)狀RNA circ_NOTCH1在胃癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默circ_NOTCH1可抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲［7］，但目前尚不清楚FOXM1和circ_NOTCH1通路對胃癌細(xì)胞的調(diào)控作用。因此，本研究探究FOXM1調(diào)控circ_NOTCH1對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及耐藥性的影響，旨在為胃癌治療提供新策略。

材料和方法

材料? 收集2019年5月至2022年5月鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院手術(shù)切除的40例胃癌患者的癌組織及距離癌灶4 cm處的癌旁組織。其中男23例，女17例，平均年齡（57.45±11.36）歲，平均體重指數(shù)（23.06±3.01）kg/m2。排除標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)前接受化療或放療；合并其他惡性腫瘤。本研究通過鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批編號：201902），所有患者簽署知情同意書。人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞系MGC-803、HGC-27、BGC-823均購自上海通蔚生物科技有限公司。阿霉素（貨號：QN0097-BWD）購自北京百奧萊博科技有限公司，CCK-8試劑盒（貨號：FN-EM1859）購自武漢菲恩生物科技有限公司，兔源一抗FOXM1（貨號：ab207298）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（貨號：ab29）、Bax蛋白（貨號：ab32503）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistance related protein 1，MRP1）（貨號：ab260038）、多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）（貨號：ab170904）、GAPDH（貨號：ab8245）及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（貨號：ab289875）均購自英國Abcam公司。pSilencer 2.1-U6-Neo質(zhì)粒購自上海柯雷生物科技有限公司。短發(fā)夾RNA FOXM1（short hairpin RNA FOXM1，sh-FOXM1）及其陰性對照（negative control short hairpin RNA，sh-NC）、小干擾RNA circ_NOTCH1（small interfering RNA circ_NOTCH1，si-circ_NOTCH1）及其陰性對照（negative control small interfering RNA，si-NC）、circ_NOTCH1過表達(dá)質(zhì)粒（circ_NOTCH1 overexpressed plasmid，pcDNA-circ_NOTCH1）及其陰性對照（pcDNA）均由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。

細(xì)胞培養(yǎng)及分組? GES-1、MGC-803、HGC-27、BGC-823細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞，分為對照組（正常培養(yǎng)的BGC-823細(xì)胞）、sh-FOXM1組及sh-NC組、si-circ_NOTCH1組及si-NC組、sh-FOXM1+pcDNA-circ_NOTCH1組及sh-FOXM1+pcDNA組。按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，將各組細(xì)胞以5×104個/孔的密度接種于24孔板中，并分別加入0、100、300、500、700、900 mg/L 新霉素G418，培養(yǎng)7 d后，選取能導(dǎo)致對照組BGC-823細(xì)胞完全死亡的G418濃度（500 mg/L）作為篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的最佳濃度，采用500 mg/L G418維持培養(yǎng)各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞直至獲得穩(wěn)定存活的細(xì)胞株，收集各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)時熒光定量PCR檢測組織和細(xì)胞circ_NOTCH1表達(dá)? 采用TRIzol試劑從組織勻漿和細(xì)胞中分離總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測circ_NOTCH1的相對表達(dá)量。以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算circ_NOTCH1的相對表達(dá)量。引物序列：circ_NOTCH1正向引物：5′-TATTTTACACAGAAACACTGCCT-3′，反向引物：5′-CGG- TGAACTGACCTGTACCC-3′；U6正向引物：5′-ATTGGAA- CGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

CCK-8法檢測細(xì)胞活力? 收集對照及轉(zhuǎn)染后的各組BGC-823細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，于37 ℃孵育2 h。采用酶標(biāo)儀測定各孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度（optical density，OD）值。此外，將各組細(xì)胞分別加入1 mg/L 阿霉素避光處理48 h［8］，再加入10 μl CCK-8溶液孵育4 h，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值，并計(jì)算細(xì)胞活力。

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)? 將對照及轉(zhuǎn)染后的各組BGC-823細(xì)胞以300個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)14 d后，加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min，觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲? 將懸浮在無血清DMEM培養(yǎng)基中的各組BGC-823細(xì)胞以1×104個/ml的密度接種于涂有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell的上室內(nèi)，另將含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑加入下室，培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞侵襲情況并統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞的數(shù)目。

Western blot檢測FOXM1、PCNA、Bax、MRP1、MDR1蛋白表達(dá)? 使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取組織和細(xì)胞的總蛋白。采用BCA法對蛋白進(jìn)行定量后，取50 μg的蛋白在12% SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳分離，然后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗FOXM1（1∶3000）、PCNA（1∶4000）、Bax（1∶3000）、MRP1（1∶3000）、MDR1（1∶3000）、GAPDH（1∶5000）4 ℃孵育過夜，然后與二抗（1∶4000）在常溫下孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯色，使用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

RNA下拉實(shí)驗(yàn)檢測FOXM1蛋白與circ_NOTCH1的相互作用? 將生物素化的陰性對照和circ_NOTCH1轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞中，孵育48 h后，將細(xì)胞裂解物與鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠混合形成含磁珠的蛋白質(zhì)-RNA-復(fù)合物，經(jīng)高鹽洗脫后除去磁珠得到蛋白質(zhì)-RNA-復(fù)合物。以input為陽性對照，采用Western blot檢測蛋白質(zhì)-RNA-復(fù)合物中FOXM1蛋白的水平。

RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀檢測FOXM1蛋白與circ_NOTCH1的結(jié)合? 采用RNA免疫沉淀裂解緩沖液裂解細(xì)胞，通過蛋白A/G磁珠對FOXM1蛋白進(jìn)行免疫沉淀，用磁鐵固定與復(fù)合物結(jié)合的磁珠并洗掉未結(jié)合的部分，采用實(shí)時熒光定量PCR分析復(fù)合物RNA中circ_NOTCH1的表達(dá)，以IgG蛋白作為對照。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理? 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，定量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。采用Pearson檢驗(yàn)分析胃癌組織FOXM1蛋白與circ_NOTCH1表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

FOXM1蛋白、circ_NOTCH1在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)? 與癌旁組織比較，胃癌組織FOXM1蛋白（1.18±0.12比0.23±0.01；t=49.896，P<0.001）、circ_NOTCH1（2.33±0.17比1.00±0.00；t=49.480，P<0.001）表達(dá)水平顯著升高，且胃癌組織FOXM1蛋白與circ_NOTCH1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.723，P<0.001）（圖1）；與GES-1細(xì)胞比較，MGC-803（0.62±0.05比0.21±0.02；t=18.649，P<0.001和1.29±0.11比1.00±0.00；t=6.458，P<0.001）、HGC-27（0.83±0.07比0.21±0.02；t=20.861，P<0.001和1.83±0.12比1.00±0.00；t=16.942，P<0.001）、BGC-823細(xì)胞（1.36±0.12比0.21±0.02；t=23.155，P<0.001和2.17±0.14比1.00±0.00；t=20.471，P<0.001）FOXM1蛋白、circ_NOTCH1表達(dá)水平顯著升高，且BGC-823細(xì)胞FOXM1蛋白和circ_NOTCH1表達(dá)量最高（圖2）。

干擾FOXM1或circ_NOTCH1對BGC-823細(xì)胞FOXM1蛋白、circ_NOTCH1表達(dá)的影響? 與對照組和sh-NC組比較，sh-FOXM1組BGC-823細(xì)胞FOXM1蛋白（0.39±0.03比1.35±0.12；q=25.149，P<0.001和0.39±0.03比1.34±0.13；q=24.887，P<0.001）、circ_NOTCH1（0.27±0.02比1.00±0.00；q=75.756，P<0.001和0.27±0.02比1.02±0.01；q=77.831，P<0.001）表達(dá)水平顯著降低；與對照組和si-NC組比較，si-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞FOXM1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.35±0.11比1.35±0.12；q=0.000，P>0.999和1.35±0.11比1.36±0.12；q=0.262，P>0.999），circ_NOTCH1表達(dá)水平顯著降低（0.18±0.01比1.00±0.00；q=85.095，P<0.001和0.18±0.01比1.01±0.02；q=86.133，P<0.001）；與sh-FOXM1組和sh-FOXM1+pcDNA組比較，sh-FOXM1+pcDNA-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞FOXM1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.41±0.03比0.39±0.03；q=0.524，P>0.999和0.41±0.03比0.40±0.04；q=0.262，P>0.999）（圖3），circ_NOTCH1表達(dá)水平顯著升高（0.67±0.05比0.27±0.02；q=41.510，P<0.001和0.67±0.05比0.29±0.02；q=39.434，P<0.001）。

干擾FOXM1或circ_NOTCH1對BGC-823細(xì)胞增殖能力的影響? 與對照組和sh-NC組比較，sh-FOXM1組BGC-823細(xì)胞OD值（0.33±0.02比0.96±0.08；q=25.224，P<0.001和0.33±0.02比0.97±0.09；q=25.624，P<0.001）、克隆形成率［（28.33±1.23）%比（76.68±3.17）%；q=49.256，P<0.001和（28.33±1.23）%比（75.59±3.20）%；q=48.145，P<0.001］顯著降低；與對照組和si-NC組比較，si-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞OD值（0.28±0.02比0.96±0.08；sh-NC：短發(fā)夾RNA陰性對照；sh-FOXM1：短發(fā)夾RNA FOXM1；si-NC：小干擾RNA陰性對照；si-circ_NOTCH1：小干擾RNA circ_NOTCH1；pcDNA：circ_NOTCH1過表達(dá)物陰性對照q=27.226，P<0.001和0.28±0.02比0.95±0.08；q=26.826，P<0.001）、克隆形成率［（24.45±1.18）%比（76.68±3.17）%；q=53.208，P<0.001和（24.45±1.18）%比（74.67±3.09）%；q=51.161，P<0.001］顯著降低；與sh-FOXM1組和sh-FOXM1+pcDNA組比較，sh-FOXM1+pcDNA-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞OD值（0.76±0.06比0.33±0.02；q=17.216，P<0.001和0.76±0.06比0.35±0.03；q=16.416，P<0.001）、克隆形成率［（58.82±2.43）%比（28.33±1.23）%；q=31.061，P<0.001和（58.82±2.43）%比（30.11±1.35）%；q=29.248，P<0.001］顯著升高（圖4）。

干擾FOXM1或circ_NOTCH1對BGC-823細(xì)胞侵襲能力的影響? 與對照組和sh-NC組比較，sh-FOXM1組BGC-823細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著降低［（25.58±1.16）個比（73.34±3.08）個；q=49.611，P<0.001和（25.58±1.16）個比（73.29±3.21）個；q=49.559，P<0.001］；與對照組和si-NC組比較，si-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著降低［（22.93±1.20）個比（73.34±3.08）個；q=52.363，P<0.001和（22.93±1.20）個比（72.93±3.04）個；q=51.937，P<0.001］；與sh-FOXM1組和sh-FOXM1+pcDNA組比較，sh-FOXM1+pcDNA-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著升高［（49.35±2.36）個比（25.58±1.16）個；q=24.691，P<0.001和（49.35±2.36）個比（26.13±1.24）個；q=24.120，P<0.001］（圖5）。

干擾FOXM1或circ_NOTCH1對BGC-823細(xì)胞耐藥性的影響? 加入阿霉素處理后，與對照組和sh-NC組比較，sh-FOXM1組BGC-823細(xì)胞活力顯著降低［（27.73±1.29）%比（68.83±3.45）%；q=40.870，P<0.001和（27.73±1.29）%比（67.75±3.24）%；q=39.796，P<0.001］；與對照組和si-NC組比較，si-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞活力顯著降低［（21.18±1.31）%比（68.83±3.45）%；q=47.383，P<0.001和（21.18±1.31）%比（68.27±3.06）%；q=46.827，P<0.001］；與sh-FOXM1組和sh-FOXM1+pcDNA組比較，sh-FOXM1+pcDNA-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞活力顯著升高［（43.46±2.28）%比（27.73±1.29）%；q=15.642，P<0.001和（43.46±2.28）%比（28.32±1.46）%；q=15.055，P<0.001］。

干擾FOXM1或circ_NOTCH1對BGC-823細(xì)胞PCNA、Bax、MRP1、MDR1蛋白表達(dá)的影響? 與對照組和sh-NC組比較，sh-FOXM1組BGC-823細(xì)胞PCNA（0.68±0.06比1.52±0.11；q=22.355，P<0.001和0.68±0.06比1.53±0.12；q=22.261，P<0.001）、MRP1（0.23±0.02比0.89±0.08；q=25.983，P<0.001和0.23±0.02比0.88±0.07；q=25.589，P<0.001）、MDR1蛋白（0.45±0.05比1.07±0.12；q=17.404，P<0.001和0.45±0.05比1.08±0.11；q=17.685，P<0.001）表達(dá)顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高（1.13±0.09比0.22±0.02；q=31.523，P<0.001和1.13±0.09比0.24±0.02；q=30.831，P<0.001）；與對照組和si-NC組比較，si-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞PCNA（0.53±0.05比1.52±0.11；q=26.347，P<0.001和0.53±0.05比1.51±0.13；q=26.081，P<0.001）、MRP1（0.14±0.01比0.89±0.08；q=29.526，P<0.001和0.14±0.01比0.90±0.10；q=29.919，P<0.001）、MDR1蛋白（0.40±0.04比1.07±0.12；q=18.808，P<0.001和0.40±0.04比1.09±0.13；q=19.369，P<0.001）表達(dá)顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高（1.32±0.11比0.22±0.02；q=38.105，P<0.001和1.32±0.11比0.23±0.02；q=37.759，P<0.001）；與sh-FOXM1組和sh-FOXM1+pcDNA組比較，sh-FOXM1+pcDNA-circ_NOTCH1組BGC-823細(xì)胞PCNA（0.86±0.07比0.68±0.06；q=4.790，P=0.027和0.86±0.07比0.69±0.07；q=4.524，P=0.042）、MRP1（0.67±0.07比0.23±0.02；q=17.322，P<0.001和0.67±0.07比0.24±0.02；q=10.106，P<0.001）、MDR1蛋白（0.82±0.07比0.45±0.05；q=10.386，P<0.001和0.82±0.07比0.46±0.03；q=26.081，P<0.001）表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)顯著降低（0.71±0.06比1.13±0.09；q=14.549，P<0.001和0.71±0.06比1.12±0.10；q=14.203，P<0.001）（圖6）。

FOXM1蛋白與circ_NOTCH1的相互作用? RNA下拉實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1蛋白能與circ_NOTCH1相互作用。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FOXM1蛋白可與circ_NOTCH1結(jié)合（圖7）。

討論

胃癌作為一種在世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤，其治療方法主要取決于腫瘤的發(fā)展階段。據(jù)報道，當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)移至周圍組織時，化療可以顯著提高晚期胃癌患者的生存率［9］。阿霉素是一種常用的化療藥物，然而，長期接受阿霉素治療的胃癌患者容易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致其臨床療效受到限制，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和預(yù)后［10］。因此，探究調(diào)控胃癌進(jìn)展及耐藥性相關(guān)的分子機(jī)制對于改善胃癌患者的預(yù)后具有重要意義。

FOXM1是一種調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的癌基因［11］。據(jù)報道，沉默F(xiàn)OXM1基因可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［12］；敲減FOXM1基因可抑制食管鱗癌的進(jìn)展［13］；FOXM1基因也可介導(dǎo)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞產(chǎn)生阿霉素耐藥性［14］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1蛋白在胃癌組織和MGC-803、HGC-27、BGC-823細(xì)胞中呈高表達(dá)，且在BGC-823細(xì)胞中表達(dá)量最高，因此，選取BGC-823細(xì)胞為研究對象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn)干擾FOXM1基因可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲及耐藥性。PCNA作為增殖相關(guān)蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用［15］；Bax蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡能力成正比，可作為評估細(xì)胞凋亡的指標(biāo)［16］；MRP1蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)以介導(dǎo)替莫唑胺的耐藥性［17］；MDR1蛋白上調(diào)增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞對阿霉素的耐藥性［18］。本研究結(jié)果顯示，干擾FOXM1基因可抑制胃癌BGC-823細(xì)胞PCNA、MRP1、MDR1蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，從蛋白水平上證實(shí)了干擾FOXM1基因可抑制胃癌的進(jìn)展及耐藥性，提示FOXM1可能成為治療胃癌的潛在靶點(diǎn)。然而干擾FOXM1基因如何調(diào)控PCNA、MRP1、MDR1蛋白來抑制胃癌的進(jìn)展及耐藥性還有待進(jìn)一步探究。

研究發(fā)現(xiàn)circANKHD1/FOXM1軸可促進(jìn)膀胱浸潤性尿路上皮癌的發(fā)生［19］，提示FOXM1蛋白與環(huán)狀RNA之間的相互作用可能在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。大量研究證實(shí)環(huán)狀RNA在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，例如過表達(dá)circ_NOTCH1可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲性［20］，敲減circ_NOTCH1可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［21］。本研究結(jié)果顯示，circ_NOTCH1在胃癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默circ_NOTCH1可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲及耐藥性。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1蛋白可與circ_NOTCH1相互作用，干擾FOXM1基因可抑制胃癌BGC-823細(xì)胞circ_NOTCH1的表達(dá)，提示干擾FOXM1基因可能通過沉默circ_NOTCH1表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及耐藥性。因此，本研究在干擾FOXM1基因基礎(chǔ)上增加pcDNA-circ_NOTCH1干預(yù)胃癌BGC-823細(xì)胞，結(jié)果顯示，pcDNA-circ_NOTCH1減弱了干擾FOXM1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖、侵襲及耐藥性的抑制作用。但本研究缺少體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，后期將結(jié)合動物模型進(jìn)一步探討機(jī)制。

綜上，本研究結(jié)果顯示，干擾FOXM1基因可能通過沉默circ_NOTCH1表達(dá)抑制胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖、侵襲及耐藥性。

參考文獻(xiàn)

［1］Guo Q，Xu J，Huang Z，et al.ADMA mediates gastric cancer cell migration and invasion via Wnt/β-catenin signaling pathway[J].Clin Transl Oncol，2021，23（2）：325-334.DOI：10.1007/s12094-020-02422-7.

［2］Guo Y，Wang Y，Ma Y，et al.Upregulation of lncRNA SUMO1P3 promotes proliferation，invasion and drug resistance in gastric cancer through interacting with the CNBP protein[J].RSC Adv，2020，10（10）：6006-6016.DOI：10.1039/c9ra09497k.

［3］Ou W，Lin L，Chen R，et al.Circ_0081143 contributes to gastric cancer malignant development and doxorubicin resistance by elevating the expression of YES1 by targeting miR-129-2-3p[J].Gut Liver，2022，16（6）：861-874.DOI：10.5009/gnl210354.

［4］Xing S，Tian Z，Zheng W，et al.Hypoxia downregulated miR-4521 suppresses gastric carcinoma progression through regulation of IGF2 and FOXM1[J].Mol Cancer，2021，20（1）：9.DOI：10.1186/s12943-020-01295-2.

［5］林志金，張長青，陳新琦，等.miR-149-3p靶向FOXM1抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901生長和遷移[J].中國免疫學(xué)雜志，2020，36（10）：1212-1216.DOI：10.3969/j.issn.1000-484X.2020.10.012.

［6］宋莉平，王宇.轉(zhuǎn)錄因子FoxM1在腫瘤耐藥中的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2019，27（22）：4107-4111.DOI：10.3969/j.issn.1672-4992.2019.22.039.

［7］Zhao X，Zhong Q，Cheng X，et al.miR-449c-5p availability is antagonized by circ_NOTCH1 for MYC-induced NOTCH1 upregulation as well as tumor metastasis and stemness in gastric cancer[J].J Cell Biochem，2020，121（10）：4052-4063.DOI：10.1002/jcb.29575.

［8］劉源，倪漸鳳芳，劉麗娜，等.丹參酮IIA抑制胃癌細(xì)胞的阿霉素耐藥[J].中國病理生理雜志，2019，35（12）：2208-2214.DOI：10.3969/j.issn.1000-4718.2019.12.015.

［9］Hu X，Lou T，Yuan C，et al.Effects of lncRNA ANRIL-knockdown on the proliferation，apoptosis and cell cycle of gastric cancer cells[J].Oncol Lett，2021，22（2）：621.DOI：10.3892/ol.2021.12882.

［10］劉子倩，李哲，王胤，等.基于阿霉素治療的胃癌中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的微陣列分析[J].青島大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2021，34（4）：16-22，29.DOI：10.3969/j.issn.1006-1037.2021.11.04.

［11］Zhang Y，Chen L，Ye X，et al.Expression and mechanism of exosome-mediated a FOXM1 related long noncoding RNA in gastric cancer[J].J Nanobiotechnology，2021，19（1）：133.DOI：10.1186/s12951-021-00873-w.

［12］Lee NR，Kim DY，Jin H，et al.Inactivation of the Akt/FOXM1 signaling pathway by panobinostat suppresses the proliferation and metastasis of gastric cancer cells[J].Int J Mol Sci，2021，22（11）：5955.DOI：10.3390/ijms22115955.

［13］Su M，Tang J，Zhang B，et al.LncRNA GACAT3 promotes esophageal squamous cell carcinoma progression through regulation of miR-149/FOXM1[J].Cancer Cell Int，2021，21（1）：478.DOI：10.1186/s12935-021-02192-4.

［14］張瑞，羅彬，劉安貴，等.FOXM1通過影響PI3K-AKT通路介導(dǎo)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤阿霉素耐藥的產(chǎn)生[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2022，39（7）：1039-1046.DOI：10.16190/j.cnki.45-1211/r.2022.07.003.

［15］Li Y，Lv M，Wang J，et al.LINC00641 inhibits the proliferation and invasion of ovarian cancer cells by targeting miR-320a[J].Transl Cancer Res，2021，10（11）：4894-4904.DOI：10.21037/tcr-21-2314.

［16］Wang Z，Chen X，Liu N，et al.A nuclear long non-coding RNA LINC00618 accelerates ferroptosis in a manner dependent upon apoptosis[J].Mol Ther，2021，29（1）：263-274.DOI：10.1016/j.ymthe.2020.09.024.

［17］Xu J，Song J，Xiao M，et al.RUNX1（RUNX family transcription factor 1），a target of microRNA miR-128-3p，promotes temozolomide resistance in glioblastoma multiform by upregulating multidrug resistance-associated protein 1（MRP1）[J].Bioengineered，2021，12（2）：11768-11781.DOI：10.1080/21655979.2021.2009976.

［18］Shao M，Shi R，Gao ZX，et al.Crizotinib and doxorubicin cooperatively reduces drug resistance by mitigating MDR1 to increase hepatocellular carcinoma cells death[J].Front Oncol，2021，11：650052.DOI：10.3389/fonc.2021.650052.

［19］Wei WS，Wang N，Deng MH，et al.LRPPRC regulates redox homeostasis via the circANKHD1/FOXM1 axis to enhance bladder urothelial carcinoma tumorigenesis[J].Redox Biol，2021，48：102201.DOI：10.1016/j.redox.2021.102201.

［20］Guan E，Xu X，Xue F.circ_NOTCH1 acts as a sponge of miR-637 and affects the expression of its target gene Apelin to regulate gastric cancer cell growth[J].Biochem Cell Biol，2020，98（2）：164-170.DOI：10.1139/bcb-2019-0079.

［21］Huang W，Song W，Jiang Y，et al.c-Myc-induced circ_NOTCH1 promotes aggressive phenotypes of nasopharyngeal carcinoma cells by regulating the miR-34c-5p/c-Myc axis[J].Cell Biol Int，2021，45（7）：1436-1447.DOI：10.1002/cbin.11582.

（收稿日期：2023-03-17）