王勝濤 朱浩然 徐淑娟 貴鵬 陳明洲 李朝旭

基金項目：廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點培育學(xué)科建設(shè)項目（桂衛(wèi)教科發(fā)〔2022〕4號）

摘要：目的? 通過分析不同骨肉瘤患者腫瘤組織的細(xì)胞組成，探究與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞亞群及特征。方法? 下載不同患者骨肉瘤單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)及bulk測序數(shù)據(jù)，提取細(xì)胞樣本信息進(jìn)行降維、注釋、細(xì)胞功能分析，明確與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞種類，鑒定骨肉瘤預(yù)后相關(guān)細(xì)胞特征。分析具有預(yù)后意義的巨噬細(xì)胞發(fā)育軌跡，根據(jù)分化空間差異基因構(gòu)建骨肉瘤預(yù)后模型。結(jié)果? 不同骨肉瘤患者的細(xì)胞組成存在異質(zhì)性。骨肉瘤中浸潤的單核巨噬細(xì)胞具有顯著預(yù)后意義（P=0.003）。4類巨噬細(xì)胞組成關(guān)鍵預(yù)后單核巨噬細(xì)胞亞群，其特征性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子包括RUNX3（+）、ETS1（+）、HOXD11（+）、ZNF281（+）、PRRX1（+）。巨噬細(xì)胞亞群的預(yù)后能力隨骨肉瘤的惡性進(jìn)展而增強，其中Prog_Macro2及Prog_Macro4亞群巨噬細(xì)胞位于發(fā)育軌跡終端?；诰奘杉?xì)胞分化差異基因的預(yù)后模型能夠有效區(qū)分不同風(fēng)險骨肉瘤患者的生存率（P<0.001）。結(jié)論? 巨噬細(xì)胞亞群與骨肉瘤預(yù)后密切相關(guān)，可作為骨肉瘤免疫治療的關(guān)鍵靶細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：骨肉瘤；單細(xì)胞測序；單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)；巨噬細(xì)胞；預(yù)后

中圖分類號： R738.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）05-0773-10

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15573

Characterization of Cell Subsets Associated With Prognosis of Osteosarcoma Based on Single-Cell Sequencing Data

WANG Shengtao1，ZHU Haoran2，XU Shujuan3，GUI Peng4，CHEN Mingzhou1，LI Zhaoxu1

1Department of Joint Surgery and Sports Medicine，Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guilin，Guangxi 541002，China

2Zonglian College，Xian Jiaotong University，Xian 710061，China

3Department of Hematology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin，Guangxi 541001，China

4Department of Trauma and Hand Surgery，Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guilin，Guangxi 541002，China[JZ）]

Corresponding author：LI Zhaoxu? Tel：0773-3830680，E-mail：lzxpds@126.com

ABSTRACT：Objective? To explore the cell subsets and characteristics related to the prognosis of osteosarcoma by analyzing the cellular composition of tumor tissue samples from different osteosarcoma patients.Methods? The single-cell sequencing data and bulk sequencing data of different osteosarcoma patients were downloaded.We extracted the information of cell samples for dimensionality reduction，annotation，and cell function analysis，so as to identify the cell subsets and clarify the cell characteristics related to the prognosis of osteosarcoma.The development trajectory of macrophages with prognostic significance was analyzed，and the prognostic model of osteosarcoma was established based on the differentially expressed genes of macrophage differentiation.Results? The cellular composition presented heterogeneity in the patients with osteosarcoma.The infiltration of mononuclear phagocytes in osteosarcoma had prognostic significance（P=0.003）.Four macrophage subsets were associated with prognosis，and their signature transcription factors included RUNX3（+），ETS1（+），HOXD11（+），ZNF281（+），and PRRX1（+）.Prog_Macro2 and Prog_Macro4 were located at the end of the developmental trajectory，and the prognostic ability of macrophage subsets increased with the progression of osteosarcoma.The prognostic model established based on the differentially expressed genes involved in macrophage differentiation can distinguish the survival rate of osteosarcoma patients with different risks（P<0.001）.Conclusion? Macrophage subsets are closely related to the prognosis of osteosarcoma and can be used as the key target cells for the immunotherapy of osteosarcoma.

Key words：osteosarcoma；single-cell sequencing；mononuclear phagocyte system；macrophage；prognosis

Acta Acad Med Sin，2023，45（5）：773-782

骨肉瘤多起源于四肢長骨，是兒童和青少年群體最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤［1］。不同病理亞型骨肉瘤的治療方式及預(yù)后完全不同［2］，了解骨肉瘤組織細(xì)胞組成特征及其特異性功能是臨床防治工作開展的重要基礎(chǔ)。骨肉瘤組織中的腫瘤細(xì)胞、各類免疫細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)共同形成骨肉瘤微環(huán)境，參與癌變后免疫機制以及骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，并直接影響患者的診斷治療及預(yù)后［3］。單細(xì)胞測序技術(shù)能夠?qū)Π┘?xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面且精準(zhǔn)的分析［4］，已應(yīng)用于胃癌［5］、肺癌［6］、乳腺癌［7］等多種腫瘤中。結(jié)合R語言等生物信息學(xué)分析技術(shù)，單細(xì)胞測序技術(shù)能夠捕獲不同腫瘤的細(xì)胞組成，揭示腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性［8］。然而，目前缺乏單細(xì)胞水平的關(guān)于骨肉瘤浸潤細(xì)胞及特征的相關(guān)研究。本研究旨在利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄測序數(shù)據(jù)，對骨肉瘤浸潤細(xì)胞中具有預(yù)后意義的細(xì)胞群體進(jìn)行鑒定與分析，以期為臨床骨肉瘤防治工作的開展提供理論依據(jù)。

資料和方法

資料來源? 骨肉瘤單細(xì)胞數(shù)據(jù)集來源于GSE152048［9］，共計納入11例樣本。骨肉瘤bulk RNA測序數(shù)據(jù)集從TARGET數(shù)據(jù)庫（https：//ocg.cancer.gov/programs/target）下載，使用R軟件TCGAbiolinks包進(jìn)行分析處理。骨肉瘤樣本生存數(shù)據(jù)從UCSC Xena數(shù)據(jù)庫（http：//xena.ucsc.edu/）下載。

數(shù)據(jù)處理? 使用R軟件Seurat包［10］篩選出骨肉瘤單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中線粒體基因比例<20%的細(xì)胞，為避免骨肉瘤中癌變細(xì)胞的差異在數(shù)據(jù)整合中被消除，分析過程并未去除樣本的批次效應(yīng)。

降維聚類? 使用RunPCA函數(shù)及RunUMAP函數(shù)對細(xì)胞進(jìn)行降維聚類，設(shè)置dims為1∶50。

細(xì)胞注釋? 結(jié)合CellTypist數(shù)據(jù)庫（https：//www.celltypist.org/）及R軟件SingleR包［11］對篩選后的細(xì)胞群進(jìn)行注釋。

R軟件工具包? 調(diào)用R軟件Scissor包［12］整合骨肉瘤的bulk測序數(shù)據(jù)、對應(yīng)的生存數(shù)據(jù)以及單細(xì)胞數(shù)據(jù)，檢測單細(xì)胞樣本中對預(yù)后具有影響的細(xì)胞。調(diào)用R軟件BayesPrism包［13］，將單細(xì)胞數(shù)據(jù)投射到bulk測序數(shù)據(jù)中以觀測每一個bulk測序樣本中細(xì)胞的組成以及比例差異，同時調(diào)用R軟件Survival包結(jié)合bulk測序樣本的細(xì)胞比例以及生存數(shù)據(jù)分析具有預(yù)后意義的細(xì)胞群。調(diào)用R軟件pyscenic包［14］分析不同巨噬細(xì)胞亞群中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的富集差異，從而確定具有顯著預(yù)后意義的巨噬細(xì)胞亞群所具有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子富集特征。Monocle3［15］和CytoTRACE包［16］被用來探究骨肉瘤中巨噬細(xì)胞的發(fā)育軌跡及在細(xì)胞發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的基因。

預(yù)后模型的構(gòu)建? 提取Monocle3計算的在巨噬細(xì)胞的UMAP降維圖中按照莫蘭指數(shù)排位前40的基因，采用LASSO回歸法構(gòu)建風(fēng)險預(yù)后模型。將TARGET數(shù)據(jù)庫的85例骨肉瘤組織的bulk測序數(shù)據(jù)分為訓(xùn)練集（n=43）和測試集（n=42），基于風(fēng)險得分將患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，采用Log-rank檢驗比較高低風(fēng)險組患者的生存差異，受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線可視化風(fēng)險模型對患者生存的預(yù)測效能。

結(jié)果

骨肉瘤單細(xì)胞樣本中細(xì)胞的分布與特征? 11例骨肉瘤單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控、整合、歸一化處理后對篩選細(xì)胞進(jìn)行降維聚類，結(jié)果顯示不同骨肉瘤患者的腫瘤組織中存在多種細(xì)胞群，不同細(xì)胞群位置離散（圖1A）；不同骨肉瘤單細(xì)胞樣本中細(xì)胞的組成及比例有著較大差異（圖1B）。11例骨肉瘤樣本中共鑒定出16種細(xì)胞類型（圖1C），主要包括成骨細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等（圖1D）。使用R軟件Scissor包對單細(xì)胞數(shù)據(jù)和bulk測序數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，將具有預(yù)后意義的細(xì)胞標(biāo)注在UMAP降維圖中，結(jié)果顯示具有較差預(yù)后意義的細(xì)胞多為癌變的成骨細(xì)胞，而具有較好預(yù)后意義的細(xì)胞多為單核巨噬細(xì)胞（圖1E）。

骨肉瘤組織中預(yù)后相關(guān)細(xì)胞群的鑒定? 采用R軟件BayesPrism包將單細(xì)胞的注釋結(jié)果投射到bulk測序數(shù)據(jù)中，顯示不同bulk測序樣本中系細(xì)胞比例（圖2A）。采用R軟件survival包分析不同占比細(xì)胞的預(yù)后差異，篩選骨肉瘤微環(huán)境中具有預(yù)后意義的細(xì)胞群，生存分析結(jié)果顯示高浸潤比例的單核巨噬細(xì)胞（P=0.003）、周細(xì)胞（P=0.003）與增殖性成骨細(xì)胞（P=0.014）與較好的預(yù)后相關(guān)（圖2B～2D）。

骨肉瘤單核巨噬細(xì)胞亞群的組成及鑒定? 將單核巨噬細(xì)胞降維聚類分為9個亞群（圖3A），根據(jù)已知單核巨噬細(xì)胞marker鑒定細(xì)胞亞群類別，氣泡圖注釋浸潤單核巨噬細(xì)胞亞群標(biāo)志基因的表達(dá)水平（圖3B）。調(diào)用R軟件Scissor包分析單核巨噬細(xì)胞群中具有預(yù)后意義的細(xì)胞，結(jié)果顯示除背景細(xì)胞外單核巨噬細(xì)胞均具有較好預(yù)后意義（圖3C），其中具有較強預(yù)后意義的細(xì)胞亞群主要為巨噬細(xì)胞，以0、1、2、6亞群最為顯著（圖3D）。對巨噬細(xì)胞0、1、2、6亞群重新進(jìn)行降維聚類，采用Prog_Macro1～4命名（圖3E），結(jié)果顯示Prog_Macro1亞群的特征基因為CTSK、MMP9、CCL2；Prog_Macro2亞群的特征基因為HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1；Prog_Macro3亞群的特征基因為RNASE1、TREM2、AP1S2；Prog_Macro4的特征基因為MT-ND5、PTGDS、FCGBP（圖3F）。

不同巨噬細(xì)胞亞群中特征轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子富集分析? 采用pyscenic算法對巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進(jìn)行富集分析（圖4A），在每種巨噬細(xì)胞亞群中，挑選出差異富集程度排位前5的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子作為該細(xì)胞亞群的特征轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（圖4B）。具有較強預(yù)后意義的1、2、6巨噬細(xì)胞亞群（Prog_Macro2～4）均差異富集RUNX3（+）和ETS1（+），而0亞群（Prog_Macro1）則差異富集ZNF281（+），同時，可采用PRRX1（+）和HOXD11（+）將0亞群和無預(yù)后意義的9亞群區(qū)分開（圖4C～4E）。

骨肉瘤浸潤巨噬細(xì)胞亞群的發(fā)育軌跡? CytoTRACE預(yù)測結(jié)果顯示，骨肉瘤中無預(yù)后意義的巨噬細(xì)胞亞群的分化潛能大于有預(yù)后意義的巨噬細(xì)胞亞群，其中Prog_Macro4分化潛能最低（圖5A、5B）。Monocle3計算結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞群可能由無預(yù)后意義的細(xì)胞群開始分化，并逐漸形成有預(yù)后意義的細(xì)胞群。同時，代表Prog_Macro2和Prog_Macro4的細(xì)胞亞群位于發(fā)育軌跡的終端，與CytoTRACE的預(yù)測結(jié)果一致（圖5C、5D）。

基于巨噬細(xì)胞分化空間差異基因的預(yù)后模型構(gòu)建? 基于最小絕對收縮和選擇算子Cox回歸算法篩選出的7個特征基因構(gòu)建風(fēng)險評估模型，公式為風(fēng)險評分=PLIN2×（-1.448）+FTL×（-1.274）+HAPLN1×（-0.584）+SLAMF9×0.895+ACKR3×0.516+RPS20×2.777+VEGFA×0.826，生存曲線顯示高風(fēng)險患者的預(yù)后更差（P均<0.01）（圖6A），模型對1、3和5年患者生存率具有較好的區(qū)分度，曲線下面積大于0.75（圖6B）。

討論

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，具有惡性度高、生長迅速、早期轉(zhuǎn)移等特點［17］，其預(yù)后是患者及臨床醫(yī)生的關(guān)注焦點。然而目前缺乏有效指標(biāo)預(yù)測骨肉瘤的預(yù)后進(jìn)展。本研究基于單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，從單細(xì)胞水平對骨肉瘤組織浸潤細(xì)胞的組成與特征展開探究，揭示骨肉瘤預(yù)后相關(guān)細(xì)胞亞群，為臨床治療提供新的思路。

本研究所采用的測序數(shù)據(jù)來源于TARGET和GEO數(shù)據(jù)庫。11例樣本數(shù)據(jù)降維分析結(jié)果顯示，不同骨肉瘤患者組織浸潤的細(xì)胞類型包括成骨細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞、T細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、周細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，不同患者腫瘤組織浸潤細(xì)胞異質(zhì)性較高。其中，成骨細(xì)胞亞群種類較多，包括MT1X/MT1G+、PCP4+、IBSP+、PTGDS/EGFL6+等不同標(biāo)志亞群，提示成骨細(xì)胞在骨肉瘤中的廣泛分化與特異性作用?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道骨肉瘤中成骨細(xì)胞的分化與臨床進(jìn)展密切相關(guān)［18］，研究顯示骨鈣素是目前成骨細(xì)胞較好的特異性標(biāo)志物，高表達(dá)骨鈣素的骨肉瘤患者生存率較高［19］。本研究更詳盡地描述了骨肉瘤中成骨細(xì)胞的分化特征，并確定了MT1X/MT1G、PCP4、IBSP、PTGDS/EGFL6等基因為其主要的差異表達(dá)基因。

免疫治療是目前腫瘤臨床治療的新型手段。研究表明增強人體的免疫功能可能改善骨肉瘤患者的預(yù)后［20］。

通常免疫系統(tǒng)能夠識別人體癌變的組織和細(xì)胞［21］，然而腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機制使免疫系統(tǒng)失靈，因此，腫瘤免疫治療旨在通過激活體內(nèi)失效的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的［22］。CD8+和CD4+ T細(xì)胞是殺傷腫瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞，也是針對腫瘤微環(huán)境進(jìn)行免疫治療的主要細(xì)胞靶點［23］。然而，本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中雖然有大量T細(xì)胞浸潤，然而其表達(dá)水平與預(yù)后無相關(guān)性。但骨肉瘤組織中浸潤的單核巨噬細(xì)胞以及周細(xì)胞和增殖性成骨細(xì)胞與患者預(yù)后呈顯著正相關(guān)。為進(jìn)一步探究單核巨噬細(xì)胞在骨肉瘤中的重要作用，本研究根據(jù)細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)差異將單核巨噬細(xì)胞分為9個不同亞群，其中巨噬細(xì)胞與預(yù)后關(guān)聯(lián)最顯著。研究表明腫瘤浸潤的單核巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中既承擔(dān)主要抗原提呈細(xì)胞的功能，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［24］。雖然多項靶向單核巨噬細(xì)胞的治療策略已經(jīng)進(jìn)入臨床前試驗階段［25-26］，然而由于缺乏對腫瘤微環(huán)境復(fù)雜性的了解，單核巨噬細(xì)胞在腫瘤中的關(guān)鍵作用機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在骨肉瘤預(yù)后中的關(guān)鍵作用，并對其特征進(jìn)行了進(jìn)一步標(biāo)注。9種單核巨噬細(xì)胞亞群中，3、7亞群細(xì)胞經(jīng)鑒定為樹突狀細(xì)胞和未知細(xì)胞，0、1、2、6亞群細(xì)胞為不同特征的巨噬細(xì)胞（命名為Prog_Macro1～4），且均能提示較好的骨肉瘤預(yù)后。本文通過分析上述細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對細(xì)胞進(jìn)行鑒別標(biāo)志。結(jié)果顯示，1、2、6亞群為RUNX3（+）+、ETS1（+）+、HOXD11（+）-巨噬細(xì)胞群，0亞群為ZNF281（+）+、PRRX1（+）-巨噬細(xì)胞群。這些巨噬細(xì)胞亞群對骨肉瘤均具有關(guān)鍵的預(yù)后價值。此外，巨噬細(xì)胞發(fā)育分析軌跡表明，巨噬細(xì)胞并非從腫瘤初始階段即存在預(yù)后效應(yīng)，而是隨著骨肉瘤的不斷進(jìn)展，持續(xù)分化的巨噬細(xì)胞才具有預(yù)測預(yù)后的價值。在具有預(yù)后意義的巨噬細(xì)胞群體中，Prog_Macro2和Prog_Macro4細(xì)胞亞群位于發(fā)育終端，且空間差異表達(dá)基因的表達(dá)下調(diào)。使用這些差異基因構(gòu)建模型能夠?qū)侨饬鲱A(yù)后及風(fēng)險進(jìn)行有效預(yù)測。而無預(yù)后意義的巨噬細(xì)胞的具體作用及特征有待進(jìn)一步研究。

近年來有多項研究通過單細(xì)胞測序技術(shù)揭示了骨肉瘤微環(huán)境的異質(zhì)性以及浸潤的免疫細(xì)胞對患者預(yù)后的影響。Liu等［27］研究表明骨肉瘤組織中以CD83+、CCR7+、LAMP3+為標(biāo)志物的成熟調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞可通過募集Treg細(xì)胞促進(jìn)腫瘤免疫耐受，進(jìn)而影響患者的預(yù)后。Tu等［28］以及He等［29］研究結(jié)果提示骨肉瘤微環(huán)境中浸潤的C1Q+和LPAR5+巨噬細(xì)胞具有較好的預(yù)后意義。這些研究主要根據(jù)CIBERSORTx算法推斷bulk測序樣本中免疫細(xì)胞富集程度，并以此為依據(jù)將收集樣本劃分為高低浸潤組，跟據(jù)生存情況計算高低浸潤組生存結(jié)局及差異。然而，這種方法僅對推斷異質(zhì)性較強的細(xì)胞亞型有效。骨肉瘤中浸潤的巨噬細(xì)胞各亞型間基因表達(dá)譜相似，CIBERSORTx算法難以獲得足夠的特征基因標(biāo)志，進(jìn)而丟失部分細(xì)胞對于患者預(yù)后的影響。本研究所采用的Scissor算法可以避免細(xì)胞亞型間的基因表達(dá)譜過于相似對推斷結(jié)果造成的干擾，進(jìn)而對骨肉瘤組織中影響患者預(yù)后的巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行更準(zhǔn)確推斷。同時，結(jié)合擬時序算法monocle3以及細(xì)胞干性算法CytoTrace對具有不同預(yù)后意義的巨噬細(xì)胞亞群出現(xiàn)的先后進(jìn)行推測，分析了骨肉瘤浸潤巨噬細(xì)胞在不同的分化階段對患者預(yù)后影響的差異。Zhou等［9］雖然也對骨肉瘤微環(huán)境中浸潤的巨噬細(xì)胞進(jìn)行了系統(tǒng)分析，但只做了傳統(tǒng)的M1、M2以及脂肪酸結(jié)合蛋白4+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分型，同時，也缺乏骨肉瘤浸潤巨噬細(xì)胞對于患者預(yù)后影響的分析。而本研究進(jìn)一步完善了骨肉瘤中巨噬細(xì)胞群的不同分型及其對于患者預(yù)后的影響。

綜上，本研究結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞亞群與骨肉瘤預(yù)后密切相關(guān)，可作為骨肉瘤免疫治療的關(guān)鍵靶細(xì)胞。然而本研究未針對不同病理亞型的骨肉瘤患者的細(xì)胞組成及預(yù)后情況進(jìn)行分析，未來應(yīng)擴大樣本類型進(jìn)行更深入的研究；同時，應(yīng)關(guān)注無預(yù)后意義的巨噬細(xì)胞群體在骨肉瘤中所起到的潛在作用。

參考文獻(xiàn)

［1］Czarnecka AM，Synoradzki K，F(xiàn)irlej W，et al.Molecular biology of osteosarcoma[J].Cancers，2020，12（8）：2130.DOI：10.3390/cancers12082130.

［2］Gill J，Gorlick R.Advancing therapy for osteosarcoma[J].Nat Rev Clin Oncol，2021，18（10）：609-624.DOI：10.1038/s41571-021-00519-8.

［3］Yang C，Tian Y，Zhao F，et al.Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis[J].Int J Mol Sci，2020，21（19）：6985.DOI：10.3390/ijms21196985.

［4］Tang X，Huang Y，Lei J，et al.The single-cell sequencing：new developments and medical applications[J].Cell Biosci，2019，9（1）：1-9.DOI：10.1186/s13578-019-0314-y.

［5］Sathe A，Grimes SM，Lau BT，et al.Single-cell genomic characterization reveals the cellular reprogramming of the gastric tumor microenvironment[J].Clin Cancer Res，2020，26（11）：2640-2653.DOI：10.1158/1078-0432.CCR-19-3231.

［6］Maynard A，McCoach CE，Rotow JK，et al.Therapy-induced evolution of human lung cancer revealed by single-cell RNA sequencing[J].Cell，2020，182（5）：1232-1251.e22.DOI：10.1016/j.cell.2020.07.017.

［7］Grosselin K，Durand A，Marsolier J，et al.High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer[J].Nat Genet，2019，51（6）：1060-1066.DOI：10.1016/j.cell.2020.07.017.

［8］Levitin HM，Yuan J，Sims PA.Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity[J].Trends Cancer，2018，4（4）：264-268.DOI：10.1016/j.trecan.2018.02.003.

［9］Zhou Y，Yang D，Yang Q，et al.Single-cell RNA landscape of intratumoral heterogeneity and immunosuppressive microenvironment in advanced osteosarcoma[J].Nat Commun，2020，11（1）：6322.DOI：10.1038/s41467-020-20059-6.

［10］Stuart T，Butler A，Hoffman P，et al.Comprehensive integration of single-cell data[J].Cell，2019，177（7）：1888-1902.e21.DOI：10.1016/j.cell.2019.05.031.

［11］Aran D，Looney AP，Liu L，et al.Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage[J].Nat Immunol，2019，20（2）：163-172.DOI：10.1038/s41590-018-0276-y.

［12］Sun D，Guan X，Moran AE，et al.Identifying phenotype-associated subpopulations by integrating bulk and single-cell sequencing data[J].Nat Biotechnol，2022，40（4）：527-538.DOI：10.1038/s41587-021-01091-3.

［13］Chu T，Wang Z，Peer D，et al.Cell type and gene expression deconvolution with BayesPrism enables Bayesian integrative analysis across bulk and single-cell RNA sequencing in oncology[J].Nat Cancer，2022，3（4）：505-517.DOI：10.1038/s43018-022-00356-3.

［14］Aibar S，González-Blas CB，Moerman T，et al.SCENIC：single-cell regulatory network inference and clustering[J].Nat Methods，2017，14（11）：1083-1086.DOI：10.1038/nmeth.4463.

［15］Qiu X，Mao Q，Tang Y，et al.Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories[J].Nat Methods，2017，14（10）：979-982.DOI：10.1038/nmeth.4402.

［16］Gulati GS，Sikandar SS，Wesche DJ，et al.Single-cell transcriptional diversity is a hallmark of developmental potential[J].Science，2020，367（6476）：405-411.DOI：10.1126/science.aax0249.

［17］Sadykova LR，Ntekim AI，Muyangwa-Semenova M，et al.Epidemiology and risk factors of osteosarcoma[J].Cancer Invest，2020，38（5）：259-269.DOI：10.1080/07357907.2020.1768401.

［18］Araki Y，Yamamoto N，Hayashi K，et al.The number of osteoclasts in a biopsy specimen can predict the efficacy of neoadjuvant chemotherapy for primary osteosarcoma[J].Sci Rep，2021，11（1）：1-9.DOI：10.1038/s41598-020-80504-w.

［19］Cascini C，Chiodoni C.The immune landscape of osteosarcoma：implications for prognosis and treatment response[J].Cells，2021，10（7）：1668.DOI：10.3390/cells10071668.

［20］Wang Z，Wang Z，Li B，et al.Innate immune cells：a potential and promising cell population for treating osteosarcoma[J].Front Immunol，2019，10：1114.DOI：10.3389/fimmu.2019.01114.

［21］Gonzalez H，Hagerling C，Werb Z.Roles of the immune system in cancer：from tumor initiation to metastatic progression[J].Gene Dev，2018，32（19-20）：1267-1284.DOI：10.1101/gad.314617.118.

［22］Binnewies M，Roberts EW，Kersten K，et al.Understanding the tumor immune microenvironment（TIME）for effective therapy[J].Nat Med，2018，24（5）：541-550.DOI：10.1038/s41591-018-0014-x.

［23］Waldman AD，F(xiàn)ritz JM，Lenardo MJ.A guide to cancer immunotherapy：from T cell basic science to clinical practice[J].Nat Rev Immunol，2020，20（11）：651-668.DOI：10.1038/s41577-020-0306-5.

［24］Luo ZW，Liu PP，Wang ZX，et al.Macrophages in osteosarcoma immune microenvironment：implications for immunotherapy[J].Front Oncol，2020，10：586580.DOI：10.3389/fonc.2020.586580.

［25］Goswami S，Anandhan S，Raychaudhuri D，et al.Myeloid cell-targeted therapies for solid tumours[J].Nat Rev Immunol，2022：1-15.DOI：10.1038/s41577-022-00737-w.

［26］Veglia F，Sanseviero E，Gabrilovich DI.Myeloid-derived suppressor cells in the era of increasing myeloid cell diversity[J].Nat Rev Immunol，2021，21（8）：485-498.DOI：10.1038/s41577-020-00490-y.

［27］Liu W，Hu H，Shao Z，et al.Characterizing the tumor microenvironment at the single-cell level reveals a novel immune evasion mechanism in osteosarcoma[J].Bone Res，2023，11（1）：4.DOI：10.1038/s41413-022-00237-6.

［28］Tu J，Wang D，Zheng XT，et al.Single-cell RNA datasets and bulk RNA datasets analysis demonstrated C1Q+ tumor-associated macrophage as a major and antitumor immune cell population in osteosarcoma[J].Front Immunol，2023，14：438.DOI：10.3389/fimmu.2023.911368.

［29］He Y，Zhou H，Huang X，et al.Infiltration of LPAR5+ macrophages in osteosarcoma tumor microenvironment predicts better outcomes[J].Front Immunol，2022，13：909932.DOI：10.3389/fimmu.2022.909932.

（收稿日期：2023-03-14）