陳旭 張冬 唐麗華 仲莉君 張娟 李玉蘭

摘要：目的? 探究苯二氮類(lèi)藥物對(duì)幽門(mén)螺桿菌（Hp）的抗菌作用及其機(jī)制分析。方法? 以Hp國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43504作為實(shí)驗(yàn)菌株，苯二氮類(lèi)藥物地西泮、咪達(dá)唑侖、瑞馬唑侖為實(shí)驗(yàn)藥物，阿莫西林、克拉霉素為陽(yáng)性對(duì)照，注射用水為陰性對(duì)照，采用藥敏紙片法測(cè)量每種藥物的抑菌圈。采用抗菌效能檢測(cè)藥物對(duì)Hp的最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）。配置Hp菌懸液，分別用地西泮（地西泮組）、咪達(dá)唑侖（咪達(dá)唑侖組）處理，不加藥的菌懸液作為對(duì)照組，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組藥物干預(yù)前（T0）及干預(yù)后1（T1）、2（T2）、3（T3）、4（T4）、5（T5）、6（T6）、7 h（T7）菌懸液中K+濃度。提取Hp脲酶，分別采用1/2 MIC地西泮、MIC地西泮、2 MIC地西泮、1/2 MIC咪達(dá)唑侖、MIC咪達(dá)唑侖、2 MIC咪達(dá)唑侖、1 mg/ml乙酰氧肟酸、注射用水處理，酚紅顯色法檢測(cè)各組pH值從6.8升至7.7所需的時(shí)間。結(jié)果? 地西泮、咪達(dá)唑侖、瑞馬唑侖、阿莫西林、克拉霉素、注射用水對(duì)Hp的抑菌圈分別為52.3、42.7、6.0、72.3、60.8、6.0 mm。地西泮、咪達(dá)唑侖對(duì)Hp的MIC分別為12.5、25.0 μg/ml，MBC分別為25、50 μg/ml。與T0比較，T1～T7地西泮組、咪達(dá)唑侖組和對(duì)照組的K+濃度均明顯升高（P均＜0.01）；T1～T4地西泮組和咪達(dá)唑侖組的K+濃度明顯高于對(duì)照組（P均＜0.01）。1/2 MIC地西泮組、MIC地西泮組、2 MIC地西泮組、1/2 MIC咪達(dá)唑侖組、MIC咪達(dá)唑侖組、2 MIC咪達(dá)唑侖組對(duì)脲酶活性的抑制時(shí)間分別為（39.86±5.11）、（36.52±6.65）、（38.58±4.83）、（39.25±6.19）、（36.36±4.61）、（35.81±6.18）min，明顯短于乙酰氧肟酸組（P均＜0.01），但與注射用水組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。結(jié)論 ?苯二氮類(lèi)藥物地西泮、咪達(dá)唑侖對(duì)Hp有良好的抗菌作用，其抗菌機(jī)制可能與Hp細(xì)胞裂解有關(guān)，與脲酶抑制無(wú)關(guān)。

關(guān)鍵詞：幽門(mén)螺桿菌；苯二氮類(lèi)；抗菌

中圖分類(lèi)號(hào)： R517.9；R971+.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1000-503X（2023）05-0783-06

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15651

Inhibitory Effects and Mechanisms of Three Benzodiazepines on Helicobacter pylori

CHEN Xu1，ZHANG Dong2，TANG Lihua3，ZHONG Lijun3，ZHANG Juan3，LI Yulan4

1The First School of Clinical Medicine，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

2Department of Gastroenterology，3Department of Microbiology，Jiuquan City Peoples Hospital，Jiuquan，Gansu 735000，China

4Department of Anesthesiology，The First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

Corresponding author：LI Yulan? Tel：13519625065，E-mail：jasm@sina.com

ABSTRACT：Objective? To explore the inhibitory effects and mechanisms of benzodiazepines on Helicobacter pylori （Hp）.Methods? The Hp international standard strain ATCC43504 was treated with benzodiazepines diazepam，midazolam，and remimazolam，respectively.The treatments with amoxicillin and clarithromycin were taken as the positive controls，and that with water for injection as the negative control.The inhibition zone of each drug was measured by the disk diffusion method.The minimum inhibitory concentration（MIC）and minimum bactericidal concentration（MBC）of each drug against Hp were determined.Hp suspension was configured and treated with diazepam and midazolam，respectively.The bacterial suspension without drug added was used as the control group.The concentration of K+ in each bacterial suspension was measured by an automatic biochemical analyzer before drug intervention（T0）and 1（T1），2（T2），3（T3），4（T4），5（T5），6（T6），and 7 h（T7）after intervention.Hp urease was extracted and treated with 1/2 MIC diazepam，1 MIC diazepam，2 MIC diazepam，1/2 MIC midazolam，1 MIC midazolam，2 MIC midazolam，1 mg/ml acetohydroxamic acid，and water for injection，respectively.The time required for the rise from pH 6.8 to pH 7.7 in each group was determined by the phenol red coloring method.Results? The inhibition zones of diazepam，midazolam，remimazolam，amoxicillin，clarithromycin，and water for injection against Hp were 52.3，42.7，6.0，72.3，60.8，and 6.0 mm，respectively.Diazepam and midazolam showed the MIC of 12.5 μg/ml and 25.0 μg/ml and the MBC of 25 μg/ml and 50 μg/ml，respectively，to Hp.The concentrations of K+ in the diazepam，midazolam，and control groups increased during T1-T7 compared with those at T0（all P<0.01）.The concentration of K+ in diazepam and midazolam groups during T1-T4 was higher than that in the control group（all P<0.01）.The time of inhibiting urease activity in the 1/2 MIC diazepam，1 MIC diazepam，2 MIC diazepam，1/2 MIC midazolam，1 MIC midazolam，and 2 MIC midazolam groups was（39.86±5.11），（36.52±6.65），（38.58±4.83），（39.25±6.19），（36.36±4.61），and（35.81±6.18）min，respectively，which were shorter than that in the acetohydroxamic acid group（all P<0.01）and had no significance differences from that in the water for injection group（all P>0.05）.Conclusion? Diazepam and midazolam exerted inhibitory effects on Hp，which may be related to the cleavage of Hp cells rather than inhibiting urease.

Key words：Helicobacter pylori；benzodiazepines；antibacterial

Acta Acad Med Sin，2023，45（5）：783-788

幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌以及胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等多種胃部疾病密切相關(guān)，也可引起難治性缺鐵性貧血、難治性蕁麻疹等消化道以外疾病。目前認(rèn)為Hp感染是導(dǎo)致胃癌的主要危險(xiǎn)因素［1］。根除Hp感染是預(yù)防和治療胃部疾病的重要途徑。但隨著Hp根治治療的廣泛開(kāi)展，其耐藥性逐漸增加，如何有效提高Hp根除率仍面臨著挑戰(zhàn)［2］，探尋新的抗Hp藥物具有重要的臨床意義［3］。苯二氮類(lèi)藥物是臨床鎮(zhèn)靜、催眠的常用藥物之一。1995年英國(guó)學(xué)者M(jìn)agee等［4］發(fā)現(xiàn)含有咪達(dá)唑侖的注射器在使用數(shù)小時(shí)后微生物培養(yǎng)呈陰性，之后Ayoglu等［5］發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等具有殺菌作用。近期又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一些新合成的苯二氮類(lèi)化合物具有廣泛的抗菌活性［6-7］。然而苯二氮藥物是否能殺滅或抑制Hp目前國(guó)內(nèi)外缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究擬采用Hp國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株，觀(guān)察苯二氮類(lèi)藥物對(duì)Hp的抗菌作用，并探討其抗菌效能和機(jī)制。

材料和方法

菌株、試劑和儀器? Hp菌株ATCC43504購(gòu)自商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，該菌株為美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）細(xì)菌藥敏試驗(yàn)執(zhí)行指南推薦的質(zhì)控菌株。地西泮（批號(hào)：1501531）購(gòu)自天津金耀藥業(yè)有限公司，咪達(dá)唑侖（批號(hào)：MZ210608）購(gòu)自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，苯磺酸瑞馬唑侖（批號(hào)：20T04081）購(gòu)自宜昌人福藥業(yè)有限公司，哥倫比亞血平板、Mueller-Hinton血平板、Mueller-Hinton瓊脂粉、腦心浸液肉湯、羊血均購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，微需氧產(chǎn)氣袋、密封箱購(gòu)自日本三菱公司，尿素、酚紅、乙酰氧肟酸、PBS緩沖液購(gòu)自合肥博美生物科技公司。生物安全柜購(gòu)自力康精密科技（上海）有限公司，恒溫箱購(gòu)自北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司，比濁儀購(gòu)自美國(guó)PhoenixSpec公司，全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，超低溫冰柜購(gòu)自日本三菱公司，微量移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

菌株復(fù)蘇和鑒定? 取出-80 ℃冰箱中凍存的Hp菌株，置于37 ℃水浴箱中解凍，吸取100 μl均勻涂布于哥倫比亞血平板上，將血平板倒置，置于37 ℃、微需氧環(huán)境（5% O2、10% CO2和85% N2）中培養(yǎng)3 d后觀(guān)察菌落，并通過(guò)革蘭氏染色、氧化酶試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)鑒定［8］，同時(shí)收集復(fù)蘇后的菌落，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST-N對(duì)比。將鑒定無(wú)誤的細(xì)菌在上述環(huán)境中傳代增菌，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

藥物篩選? 按照Matuschek等［9］的方法制作藥敏紙片，將10片空白藥敏紙片分別置入濃度為2 mg/ml的地西泮、咪達(dá)唑侖、瑞馬唑侖溶液和注射用水中，30 min后將藥敏紙片置入另一干燥無(wú)菌平皿中，室溫下放置15 min待其干燥。以25 μg/片阿莫西林和15 μg/片克拉霉素藥敏紙片作為陽(yáng)性對(duì)照，注射用水藥敏紙片作為陰性對(duì)照。配制0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，?00 μl均勻涂布于Mueller-Hinton血平板，室溫下放置15 min。使用無(wú)菌鑷將干燥的藥敏紙片貼于已接種Hp的平板上，每種藥物貼3個(gè)平板，在37 ℃、微需氧環(huán)境中培養(yǎng)3 d后，觀(guān)察并測(cè)量抑菌圈直徑。依據(jù)CLSI M45-A3（2015）中的標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈＞17 mm定義為Hp對(duì)該藥敏感。

抗菌效能檢測(cè)? 將篩選出的Hp敏感藥物，制作0、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000 mg/ml濃度的含藥培養(yǎng)皿［10-11］，并接種100 μl濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海糠N藥物濃度接種3個(gè)培養(yǎng)皿，在37 ℃、微需氧環(huán)境中培養(yǎng)3 d，觀(guān)察Hp生長(zhǎng)情況，記錄完全抑制Hp生長(zhǎng)的培養(yǎng)基藥物最低濃度，即最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。將大于等于MIC的培養(yǎng)皿用10%甘油洗脫，涂布于不含藥的空白培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)3 d，觀(guān)察Hp生長(zhǎng)情況，記錄完全殺死Hp的培養(yǎng)皿所對(duì)應(yīng)的第1批培養(yǎng)皿的藥物最低濃度，即最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

細(xì)胞滲漏試驗(yàn)? 配制0.5麥?zhǔn)蠁挝坏腍p菌懸液，分別與12.5 μg/ml地西泮（地西泮組）和25 μg/ml咪達(dá)唑侖（咪達(dá)唑侖組）以1∶1比例混合，配成1/2 MIC的藥菌混合液，以不加藥的菌懸液作為對(duì)照組，加入24孔板中，每孔2 ml，每組重復(fù)3次［12］。將24孔板置于37 ℃、微需氧環(huán)境中培養(yǎng)，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組藥物干預(yù)前（T0）、干預(yù)后1（T1）、2（T2）、3（T3）、4（T4）、5（T5）、6（T6）和7 h（T7）菌懸液中K+濃度。

脲酶試驗(yàn)? 按照Yu等［13］方法提取Hp脲酶，將50 ml Hp菌懸液置于離心管中，5 000 g、4 ℃離心收集Hp，用磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）洗滌2次，將沉淀的Hp置于-80 ℃保存1 d，取出恢復(fù)至室溫，加入3 ml蒸餾水和蛋白酶抑制劑，超聲波振蕩1 min，15 000 g、4 ℃離心10 min，取上清液透析除鹽，所得到的脲酶溶液加入等體積的甘油后于4 ℃儲(chǔ)存。分別將1/2 MIC地西泮、MIC地西泮、2 MIC地西泮、1/2 MIC咪達(dá)唑侖、MIC咪達(dá)唑侖、2 MIC咪達(dá)唑侖、1 mg/ml乙酰氧肟酸、注射用水加入脲酶中，每組重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入緩沖液、尿素和酚紅，檢測(cè)各組pH值從6.8升至7.7所需的時(shí)間。脲酶濃度為14 U/ml（對(duì)應(yīng)2.0麥?zhǔn)蠁挝籋p菌懸液）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理? 采用SPSS 25.0軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

Hp復(fù)蘇與鑒定? 在涂有Hp的哥倫比亞血平板上，肉眼可見(jiàn)菌落呈灰白色半透明狀，表面濕潤(rùn)，稍凸于培養(yǎng)基表面；挑取單個(gè)菌落做革蘭氏染色，鏡檢菌體呈海鷗狀、彎曲形短桿菌；氧化酶試驗(yàn)顯示，沾有菌落的氧化酶試紙1 min內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)紫色；快速尿素酶試驗(yàn)顯示，當(dāng)將菌懸液加入以酚紅為指示劑的尿素試劑中，試劑由黃色變紅色。復(fù)蘇的菌落經(jīng)16S擴(kuò)增測(cè)序，在NCBI進(jìn)行BLAST-N對(duì)比，結(jié)果顯示與Hp一致性為99.92%（圖1）。

藥物篩選? 地西泮、咪達(dá)唑侖、瑞馬唑侖、阿莫西林、克拉霉素、注射用水對(duì)Hp的抑菌圈分別為52.3、42.7、6.0、72.3、60.8、6.0 mm（圖2）。

抗菌效能比較? 地西泮和咪達(dá)唑侖對(duì)Hp的MIC分別為12.5、25.0 μg/ml，MBC分別為25、50 μg/ml。

不同藥物治療組K+濃度比較? 與T0比較，T1～T7地西泮組、咪達(dá)唑侖組和對(duì)照組的K+濃度均明顯升高（P均＜0.01）；T1～T4地西泮組和咪達(dá)唑侖組的K+濃度明顯高于對(duì)照組（P均＜0.01）。地西泮組和咪達(dá)唑侖組K+濃度在2 h內(nèi)快速升高，3 h達(dá)峰，之后趨于穩(wěn)定；對(duì)照組K+濃度1 h后逐漸升高，直至5 h后趨于穩(wěn)定（圖3）。

脲酶反應(yīng)時(shí)間? 1/2 MIC地西泮組、MIC地西泮組、2 MIC地西泮組、1/2 MIC咪達(dá)唑侖組、MIC咪達(dá)唑侖組、2 MIC咪達(dá)唑侖組對(duì)脲酶活性的抑制時(shí)間分別為（39.86±5.11）、（36.52±6.65）、（38.58±4.83）、（39.25±6.19）、（36.36±4.61）、（35.81±6.18）min，明顯短于乙酰氧肟酸組［（88.26±5.69）min］（P均＜0.01），但與注射用水組［（37.72±4.34）min］差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

討論

Hp感染是一個(gè)嚴(yán)重的全球性問(wèn)題。世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將Hp列為Ⅰ類(lèi)致癌因子［14］，因此根治Hp對(duì)于預(yù)防Hp引起的一系列疾病具有重要的臨床意義。目前，抗生素治療Hp的效果受到了耐藥性問(wèn)題的限制，尋找或者合成新型抗Hp藥物具有重要的研究意義。苯二氮類(lèi)藥物是一類(lèi)常用的鎮(zhèn)靜麻醉藥，在臨床上已被廣泛應(yīng)用于鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮以及遺忘等領(lǐng)域。本研究結(jié)果顯示，地西泮、咪達(dá)唑侖對(duì)Hp有顯著抗菌作用。

據(jù)報(bào)道，某些抗抑郁藥和抗精神病類(lèi)藥物具有抑制部分細(xì)菌和真菌的作用［15-16］。研究表明，舍曲林具有抗Hp作用，其MIC為2～8 μg/ml［17］。另一項(xiàng)研究顯示，咪達(dá)唑侖對(duì)金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的MIC分別為256 μg/ml和128 μg/ml［5］。此外，Kathwate等［18］的研究結(jié)果表明地西泮和咪達(dá)唑侖對(duì)白色念珠菌的MIC分別為400、100 μg/ml。本研究結(jié)果顯示地西泮和咪達(dá)唑侖對(duì)Hp的MIC分別為12.5、25 μg/ml。從MIC值可以看出，與其他細(xì)菌相比，這兩種藥物對(duì)Hp的抗菌作用更強(qiáng)，其效能類(lèi)似于甲硝唑［19］，但略低于阿莫西林［19］。盡管靜脈注射的苯二氮類(lèi)藥物很難達(dá)到產(chǎn)生抗菌效應(yīng)所需的血藥濃度，但很多患者通過(guò)口服地西泮或咪達(dá)唑侖進(jìn)行治療后，在胃內(nèi)產(chǎn)生較高的藥物濃度，可以形成抑制或殺滅Hp的環(huán)境。由于普通混合食物的胃排空時(shí)間通常為4～6 h，而地西泮、咪達(dá)唑侖1～3 h內(nèi)即可殺滅Hp細(xì)胞，因此達(dá)到抗菌效果。

本研究細(xì)胞滲漏試驗(yàn)結(jié)果顯示，地西泮和咪達(dá)唑侖干預(yù)的菌懸液在用藥1～3 h K+濃度快速升高，提示地西泮、咪達(dá)唑侖治療可以破壞Hp的細(xì)胞膜，顯著減少Hp細(xì)胞數(shù)量，并導(dǎo)致K+大量滲漏。而未加藥的空白菌懸液K+濃度在1 h內(nèi)緩慢上升，之后在5 h達(dá)到峰值并趨于穩(wěn)定，這可能是由于Hp缺乏適宜的氣體及溫度環(huán)境所致，隨著時(shí)間的推移，細(xì)菌逐漸死亡。

Hp脲酶是Hp與其他胃腸道微生物區(qū)分的主要特征之一，對(duì)于Hp的生存和定植至關(guān)重要［20］。脲酶能夠催化尿素水解，產(chǎn)生NH3、CO2和HCO3，其中NH3可以中和胃酸，為Hp在強(qiáng)酸環(huán)境中生存創(chuàng)造近中性的條件。脲酶是治療Hp感染的重要靶點(diǎn)［21］。既往文獻(xiàn)報(bào)道，咪唑類(lèi)化合物具有脲酶抑制的活性［22-23］。由于本研究的干預(yù)藥物地西泮、咪達(dá)唑侖含有咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)，故采用脲酶抑制試驗(yàn)，以探究這兩種藥物對(duì)Hp脲酶的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，地西泮和咪達(dá)唑侖干預(yù)后的反應(yīng)體系pH值從6.8上升至7.7所需時(shí)間與注射用水基本一致，遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于陽(yáng)性對(duì)照乙酰氧肟酸，說(shuō)明這兩種藥物的抗菌作用與脲酶抑制無(wú)關(guān)。

2008年土耳其麻醉醫(yī)師Ayoglu等［5］發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖具有抗菌作用，并認(rèn)為這一作用是由于藥液的低pH值而非藥物本身的藥理作用所導(dǎo)致。但本研究中咪達(dá)唑侖的pH值為2.9～3.7，瑞馬唑侖的pH值為3.0～4.0，兩種藥物pH值相似，然而抑菌效果卻完全不同（咪達(dá)唑侖抗菌作用明顯，而瑞馬唑侖無(wú)效），因此，可以初步排除低pH值是咪達(dá)唑侖產(chǎn)生抗菌作用的原因。

本研究尚存在不足之處：（1）僅體外證實(shí)了地西泮、咪達(dá)唑侖的抗Hp作用，未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；（2）僅采用細(xì)胞滲漏試驗(yàn)證實(shí)藥物干預(yù)后Hp細(xì)胞裂解，對(duì)于抗菌機(jī)制、作用通路及靶點(diǎn)未進(jìn)行更深一步的探索，未來(lái)擬通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析地西泮、咪達(dá)唑侖對(duì)Hp的抗菌機(jī)制。

綜上，本研究結(jié)果表明，苯二氮類(lèi)藥物地西泮、咪達(dá)唑侖對(duì)Hp具有良好的抗菌作用，其機(jī)制與Hp的細(xì)胞裂解有關(guān)，與脲酶抑制無(wú)關(guān)。地西泮和咪達(dá)唑侖可能成為Hp的潛在治療藥物，并為抗Hp新藥的研發(fā)提供參考。

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（收稿日期：2023-04-25）