陳聰聰,周全

1.河南中醫(yī)藥大學,河南 鄭州 450046; 2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450001

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種免疫介導的慢性炎癥性脊柱關節(jié)疾病,主要侵犯骶髂關節(jié)、中軸關節(jié)從而引起慢性疼痛、僵硬、骨質破壞,甚至出現(xiàn)強直畸形,喪失生理功能。該病目前沒有明確的致病機制及根治方法,臨床以緩解癥狀,恢復身體功能,防止關節(jié)損傷,提高生活質量為主要治療目標[1-2]。高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)是嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少引起血尿酸升高的一種代謝相關疾病,是諸多疾病如心血管、腎臟疾病的危險因素[3]。近年來,隨著人們生活結構的改變,HUA患病率越來越高而且趨于年輕化,據(jù)報道,我國HUA患病率約為13.3%[4]。

中醫(yī)藥在防治疾病方面有獨特的療效,也有“異病同治”的優(yōu)勢,即不同的疾病,病機相同,則可以采用相同的方法進行治療,其思想核心在于“辨病”與“辨證”結合[5]。中醫(yī)認為,AS屬于“痹證” “大僂”范疇,《素問·痹論》云:“痹者,風寒濕三氣雜至,合而為痹?！薄端貑枴っ}要精微論》云:“腰者腎之府,轉搖不能,腎將憊矣?！本C合現(xiàn)代醫(yī)家論述可知,AS發(fā)病以腎虛為主,外邪趁虛而入,日久郁而化熱,血行不暢,痰瘀內(nèi)生,痹阻筋骨經(jīng)脈所致[6-7]。HUA屬于“膏濁病” “濁瘀痹”范疇,孫維峰教授用“脾、腎、痰、瘀” 4個字高度概括了HUA的病機,認為治療時以活血化瘀、利濕化痰為主,佐以健脾益腎[8]。二者發(fā)病基礎均有腎虛,與濕、熱、痰、瘀諸邪有關,可為中醫(yī)“異病同治”兩種疾病提供基礎。

四妙丸出自清代張秉承所著的《成方便讀》,由蒼術、黃柏、牛膝和薏苡仁4味藥物組成,其中黃柏苦寒,善清熱燥濕,除下焦?jié)駸?為君藥;蒼術苦燥溫散、燥濕健脾,薏苡仁滲濕健脾除痹,兩藥合用,助君藥以除生濕之源;牛膝善補肝腎、強筋骨、利關節(jié),通利血脈,又能引藥下行直達下焦,全方共奏清熱利濕、舒筋壯骨之功,可以治療濕熱下注所致的多種疾病,臨床用于AS和HUA療效顯著。研究表明,四妙丸能顯著改善濕熱型AS患者的臨床癥狀,降低炎癥水平,提高臨床療效[9]。陳杰偉等[10]發(fā)現(xiàn)四妙丸可以降低HUA大鼠血清尿酸水平。

網(wǎng)絡藥理學在系統(tǒng)生物學理論指導下,運用藥理學、生物信息學、網(wǎng)絡科學等學科內(nèi)容和技術,從分子水平層面系統(tǒng)整體地揭示中藥成分對疾病的作用關系,為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了有效方法[11]。本文基于網(wǎng)絡藥理學對四妙丸治療AS和HUA的關鍵成分、核心靶點、生物過程和信號通路進行預測,并利用分子對接技術評估生物大分子和小分子配體之間結合構象的穩(wěn)定性,對預測結果進行驗證[12],從“異病同治”的角度闡述四妙丸發(fā)揮作用的相關機制,以期為后續(xù)研究提供新的思路和參考。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及其相關作用靶點搜集利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)分別檢索四妙丸所含藥物蒼術、黃柏、牛膝、薏苡仁的活性成分及其蛋白作用靶點,以藥代動力學參數(shù)中口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18為條件進行篩選,并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)將獲取的相關靶點名稱規(guī)范為基因靶標。

1.2 疾病靶點檢索以“ankylosing spondylitis”“hyperuricemia”為關鍵詞,設置物種為“Homo Sapiens”,在在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://www.omim.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)中檢索AS與HUA的疾病靶點。將3個數(shù)據(jù)庫獲得的結果進行整理去重,獲得AS與HUA最終疾病靶點。

1.3 “藥物-有效成分-潛在靶點-疾病”網(wǎng)絡構建將獲得的藥物相關靶點與疾病靶點輸入在線工具Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖,得到交集靶點,即為四妙丸異病同治AS與HUA的潛在靶點。將潛在靶點及其對應的活性成分、藥物、疾病名稱導入Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-有效成分-潛在靶點-疾病”網(wǎng)絡,并利用Network Analyzer工具計算節(jié)點的度值(Degree),篩選出四妙丸中的關鍵成分,Degree值越高,該活性成分發(fā)揮作用越大。

1.4 蛋白質互作網(wǎng)絡(protein-protein interaction networks,PPI)構建與核心靶點篩選將潛在靶點導入STRING 數(shù)據(jù)平臺(https://string-db.org/cgi/),設置物種為“Homo Sapiens”,置信度“medium confidence(0.4)”,獲得PPI模型及相關文本及表格,把結果以TSV格式導出。借助Cytoscape 3.7.2軟件,將PPI網(wǎng)絡可視化,并根據(jù)Degree值篩選出關鍵靶點。

1.5 富集分析將潛在靶點上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(http://david.ncifcrf.gov),限制物種為“Homo Sapiens”,進行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析。結果根據(jù)FDR值<0.05進行篩選,根據(jù)LogP值大小對結果進行排序,LogP值越小,作用關系越強烈。

1.6 關鍵活性成分與核心靶點分子對接驗證從TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載關鍵成分3D結構圖的MOL2格式,利用Open Babel軟件將其轉換為pdb格式,從蛋白質數(shù)據(jù)庫(protein data bank,PDB,https://www1.rcsb.org/)中獲得核心靶點的pdb格式文件,將其導入AutoDock Tool 1.5.6軟件中進行處理分析。一般認為,結合能絕對值>4.25 kcal·mol-1則表示大分子蛋白與小分子配體之間結合活性良好。最后將對接結果在Pymol軟件中進行可視化處理,并以圖片形式展現(xiàn)。

2 結果

2.1 藥物活性成分及其相關作用靶點通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢,符合篩選標準且能查詢得到對應靶點的活性成分共50種,其中蒼術4種、黃柏24種、牛膝16種、薏苡仁6種。成分對應靶點去重后最終獲得215個靶點。

2.2 疾病靶點利用DrugBank、OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索疾病相關靶點,整理后共獲得2 291個AS靶點,774個HUA靶點。

2.3 “藥物-有效成分-潛在靶點-疾病”網(wǎng)絡將藥物相關靶點和疾病靶點輸入在線工具Venny 2.1.0 繪制韋恩圖,共獲得36個交集靶點,即為四妙丸異病同治AS與HUA的潛在靶點,見圖1,其中36個潛在靶點對應27種藥物有效成分。將潛在靶點及其對應的活性成分、藥物、疾病名稱導入Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-有效成分-潛在靶點-疾病”網(wǎng)絡,SMV為四妙丸,見圖2。根據(jù)Degree值篩選出四妙丸作用于AS和HUA的關鍵成分(前10位),見表1。

表1 四妙丸治療AS和HUA主要活性成分及其參數(shù)

圖1 四妙丸成分靶點與AS、HUA靶點韋恩圖

圖2 “藥物-有效成分-潛在靶點-疾病”網(wǎng)絡圖

2.4 PPI網(wǎng)絡與核心靶點將從STRING數(shù)據(jù)庫平臺獲得的PPI相關文本及表格導入Cytoscape 3.7.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡,得到含169個節(jié)點和929條邊的網(wǎng)絡圖。根據(jù)Degree值設置節(jié)點大小和顏色深淺,Degree值越大,節(jié)點越大,顏色越深,見圖3。圖中白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)與其他靶點聯(lián)系最多,其次是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、IL-1β、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)、CXCL8(IL-8)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1,CCL2)、IL-10等。

圖3 潛在靶點PPI網(wǎng)絡圖

2.5 GO富集分析與 KEGG通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析,將結果以Excel表格形式導出,篩選排序后,GO富集分析共獲得生物過程(biological processes,BP)137條、細胞組成(cellular components,CC)7條及分子功能(molecular functions,MF)15條,其中BP主要富集在基因表達的正向調(diào)控(positive regulation of gene expression),轉錄的正向調(diào)控、DNA依賴(positive regulation of transcription,DNA-templant),RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的正向調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter),炎癥反應(inflammatory response),脂質儲存負調(diào)控(negative regulation of lipid storage)等;CC主要富集在細胞外空間(extracellular space)等;MF主要富集在細胞因子活性(cytokine activity)、相同蛋白結合(identical protein binding)、轉錄因子結合(transcription factor binding)、酶結合(enzyme binding)等。選取各項前5條繪制氣泡圖,見圖4。KEGG富集分析結果共獲得100條通路,選取排名前20名的通路繪制氣泡圖,分析發(fā)現(xiàn)交集靶點主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、瘧疾、IL-17信號通路、TNF信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、恰加斯病(美國錐蟲病)、利什曼病、類風濕性關節(jié)炎信號通路、炎癥性腸病、NF-κB信號通路等,見表2及圖5。以上結果體現(xiàn)四妙丸防治AS和HUA是多途徑的。

表2 交集靶點KEGG通路富集分析

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

2.6 關鍵活性成分與核心靶點分子對接驗證通過AutoDock Tool 1.5.6軟件對四妙丸中關鍵活性成分槲皮素、山柰酚、漢黃芩素與核心靶點IL-6、TNF、IL-1β進行對接,結果顯示,活性成分與核心靶點的結合能絕對值集中在4.37～7.9 kcal·mol-1,說明兩者之間均存在良好的結合活性。對接結果見表3、圖6。

表3 關鍵活性成分與核心靶點分子對接結合能 (kcal·mol-1)

3 討論

AS是免疫相關疾病,HUA是代謝相關疾病,病因雖不同,但二者均存在炎癥反應、氧化應激反應,均有脾腎虧虛,濕熱內(nèi)蘊的病機特點。AS患者中HUA發(fā)生率較高[13-14],同時,尿酸水平過高可能會抑制Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ech-associated protein 1,Keap1)-核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)信號通路活化,增加氧化應激損傷,從而加重AS患者的炎癥反應[15]。Chen等[16]發(fā)現(xiàn),中國AS患者尿酸水平與骨密度成倒“U型”相關,將尿酸濃度控制在300～360 μmmol·L-1有助于預防患者的骨質疏松。四妙丸具有清熱利濕、舒筋壯骨之功,具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎抑菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化、促進尿酸排泄等作用[17]。

本研究分析了四妙丸治療AS和HUA交集靶點的PPI網(wǎng)絡,得到IL-6、TNF、IL-1β、VEGFA、PTGS2等核心靶點。研究表明,它們與炎癥、免疫、血管生成、代謝密切相關。IL-6、TNF、IL-1β均為炎性細胞因子,在免疫和炎癥反應中發(fā)揮重要作用。臨床發(fā)現(xiàn),AS及HUA患者體內(nèi)IL-6、TNF和IL-1β的表達高于正常水平,影響疾病的發(fā)生發(fā)展[18-19]。IL-6可以調(diào)節(jié)輔助性T細胞17(helper T cell,Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)之間的平衡。Th17參與自身免疫性疾病的發(fā)生,而Treg具有免疫抑制作用,因此,Th17/Treg平衡維持了機體的免疫穩(wěn)態(tài)。IL-6與轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)結合可以促進Th17分化,并抑制TGF-β誘導的Treg分化;若IL-6過度表達則會導致Th17/Treg失衡,IL-17、IL-23等炎癥因子水平升高,進而促進AS及HUA的發(fā)生發(fā)展[20-22]。TNF在體內(nèi)有α和β兩種結構,其中TNF-α能夠激發(fā)炎癥級聯(lián)反應,誘導多種炎癥因子如IL-1β、IL-6表達上調(diào),使炎癥迅速擴大并持續(xù)存在[23]。TNF-α還能增加破骨細胞分化因子(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)的表達并誘導產(chǎn)生Wnt信號通路抑制劑DKK-1和硬化蛋白SOST,引起骨質侵蝕,抑制骨形成,造成骨質破壞[24]。臨床治療顯示,靶向TNF是治療AS的有效策略[25]。IL-1β可與自身受體結合激活 IL-1 信號通路和核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB),誘導釋放 IL-6、IL-8 和 IL-17a,引起炎癥反應。此外,IL-1β 能夠增加促氧化酶和黃嘌呤氧化酶的表達,產(chǎn)生更多的超氧化物,導致內(nèi)皮細胞功能異常[26]。王海波等[27]發(fā)現(xiàn),HUA大鼠TNF和IL-1β水平顯著高于空白大鼠,且顯著低于藥物治療大鼠,說明藥物可以通過抑制TNF和IL-1β表達有效緩解HUA。VEGFA是一種血管內(nèi)皮細胞生長因子,能夠誘導血管生成以及內(nèi)皮細胞增殖、增加血管的通透性,導致滑膜炎癥和骨質破壞,進而參與AS病理發(fā)展過程[28]。研究發(fā)現(xiàn),在HUA狀態(tài)下,microRNA-92a(miR-92a)表達下調(diào),其靶基因KLF2表達增加并與VEGFA啟動子結合抑制VEGFA,從而損傷血管內(nèi)皮功能引起心血管疾病,推測miR-92a-KLF2-VEGFA可能是HUA的治療靶點[29]。PTGS2即環(huán)氧合酶2(COX-2),受NF-κB調(diào)節(jié),在前列腺素生物合成中發(fā)揮關鍵作用,而前列腺素能夠調(diào)節(jié)血管張力、細胞增殖分化、炎癥疼痛和能量代謝[30]。非甾體抗炎藥可以通過抑制COX活性減少前列腺素生成來治療AS[31]。有研究顯示,較高水平的尿酸具有直接的促炎作用,可誘導 COX-2 表達和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)合成,引發(fā)組織炎癥,而選擇性的COX-2抑制劑具有顯著降低尿酸的作用[32]。

通過分析“藥物-有效成分-潛在靶點-疾病”網(wǎng)絡可知,槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、β-谷甾醇、蕓香堿、黃芩素等為四妙丸發(fā)揮療效的關鍵成分。分子對接顯示,這些成分與核心靶點結合活性良好,進一步說明四妙丸中槲皮素、山柰酚、漢黃芩素等成分可作用于IL-6、TNF等靶點,對AS和HUA發(fā)揮作用。槲皮素、山柰酚是天然的黃酮類化合物,具有抗炎抑菌、抗氧化、抗血小板聚集和清除自由基等藥理特性[33]。Le等[34]發(fā)現(xiàn),槲皮素能夠降低炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-17和 MCP-1 水平,抑制巨噬細胞浸潤,抑制滑膜細胞的異常增生,減弱炎癥反應,保護骨組織,對炎性疾病有積極的作用。NF-κB通過激活包括TNF-α、IL-6、IL-8、COX-2和iNOS在內(nèi)的炎癥介質參與AS和HUA的發(fā)展過程,且其可受抑制劑IκB-α抑制并駐留在細胞質中,直到它被炎癥刺激觸發(fā)[35]。KIM等[36]發(fā)現(xiàn),AGE的產(chǎn)生及其與其受體RAGE的結合誘導IκB-α的降解,從而誘導大鼠衰老時 NF-κB 的表達,對這些大鼠用山柰酚進行治療時可有效抑制IκB-α的降解并減少NF-κB的活化。此外,郝悅等[37]通過改良的HPLC法對30種抑制黃嘌呤氧化酶XOD活性的黃酮進行測定,發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚的作用最強,可明顯抑制XOD的活性,從而表現(xiàn)出降尿酸的作用。漢黃芩素和黃芩素均可以抑制IL-1β 誘導的 IL-6 、TNF-α、IL-8的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[38]。漢黃芩素還是一種全方位的VEGF信號抑制劑,能有效降低血清中VEGF的濃度[39]。黃芩素還能干擾花生四烯酸的代謝通路,降低PGE2分泌、核因子活性以及細胞因子分泌,從而發(fā)揮一定的解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用[40]。β-谷甾醇被認為是重要的植物甾醇化合物,對炎癥性、免疫性相關疾病同樣具有顯著療效。臨床試驗證實,β-谷甾醇在免疫應激狀態(tài)下,能提高抗炎因子IL-10的表達水平,并可通過抑制 NF-κB 信號轉導,降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的表達[41]。

查閱相關文獻結合KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、TNF信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、炎癥性腸病等信號通路為四妙丸發(fā)揮作用的關鍵通絡。AGE與RAGE配體結合,可激活NADPH氧化酶Nox和NF-κB,促進氧化應激和炎癥循環(huán)。HUA患者血清RAGE水平與血清尿酸呈正相關,尿酸水平過高會增強高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)的生成和釋放,增加氧化應激并激活 RAGE 信號通路,導致內(nèi)皮功能障礙[42-43]。HUA是心血管疾病的危險因素,AS患者同時診斷出動脈粥樣硬化、血脂異常的概率高于正常人群,這可能與炎癥反應通過各種炎癥介質如IL-6、TNF-α、IL-1β 以多種方式影響新陳代謝和心血管系統(tǒng)有關[44]。近年來研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡與機體炎癥反應密切相關,能夠誘導并加重諸如AS和HUA等炎癥性疾病[45]。同時,尿酸水平的高表達也會反向誘發(fā)機體及腸道的炎癥反應,改變腸道內(nèi)環(huán)境[46]。大量研究已經(jīng)證實,IL-17信號通路和TNF信號通路與炎癥、免疫反應及骨質破壞有關。

綜上所述,本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法對四妙丸治療AS及HUA的可能作用機制進行了分析,結果顯示,四妙丸主要通過槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、β-谷甾醇、蕓香堿、黃芩素等活性成分作用于IL-6、TNF、IL-1β、VEGFA、PTGS2等關鍵靶點,通過多種生物過程介導多條通路發(fā)揮抗炎、抗氧化、解熱鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫與代謝、疏通血管、促進尿酸排泄等作用,從而達到異病同治AS與HUA的療效,但后續(xù)還需要進行進一步實驗驗證。