孔繁聰 蔡少芬 齊凌 紀(jì)德香 喻敏 周玉蘭 王詩軒 李菲

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，具有極強(qiáng)的異質(zhì)性。基因突變在AML 患者的診斷、危險(xiǎn)度分層、治療方案選擇及預(yù)后等方面至關(guān)重要[1]。隨著分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展，大量突變基因被發(fā)現(xiàn)，然而大部分突變基因臨床預(yù)后意義未明確。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型11（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 11，PTPN11）基因位于染色體12q24 上，編碼含Src 同源2 結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶（Src homology 2 domain containing protein tyrosine phosphatase，SHP2）。SHP2 含有兩個(gè)Src 同源2 結(jié)構(gòu)域（N-SH2 和C-SH2）和1 個(gè)PTP 酶催化結(jié)構(gòu)域，主要調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡，在造血干細(xì)胞的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[2]。2001 年P(guān)arikh等[3]首次在努南綜合征患者中發(fā)現(xiàn)PTPN11 基因突變，并證實(shí)PTPN11 突變增加努南綜合征患者發(fā)生血液系統(tǒng)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。隨后其他血液系統(tǒng)疾病中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了PTPN11 基因突變。幼年型粒單核細(xì)胞白血病患者PTPN11 基因突變與不良預(yù)后和較高的復(fù)發(fā)率密切相關(guān)[4]。然而，PTPN11 基因突變在成人AML 中發(fā)生率較低，其預(yù)后意義尚存爭議[5-6]。既往研究均為非隨機(jī)對照的回顧性分析，這可能是導(dǎo)致各研究結(jié)果不一致的重要原因之一。傾向性評分匹配（propensity score matching，PSM）是臨床觀察性研究中常用的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，通過均衡混雜因素的影響，實(shí)現(xiàn)觀察組和對照組之間更合理的比較[7]?；诖?，本研究采用傾向性評分匹配手段去除混雜因素，分析南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院初治AML 患者的臨床資料，探究PTPN11基因突變對AML 患者療效及預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

分析2019 年1 月至2023 年1 月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科確診且行血液腫瘤相關(guān)基因突變二代測序（next generation sequencing，NGS）檢測的526例初治AML（非M3 型）患者的臨床資料并進(jìn)行回顧性分析。PTPN11 突變型（PTPN11 mutation，PTPN11mut）患者51 例，PTPN11 野生型（PTPN11 wild-type，PTPN11wt）患者475 例。所有患者診斷符合2016 版世界衛(wèi)生組織（WHO）造血和淋巴組織腫瘤[1]的分型診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)歐洲白血病網(wǎng)（ELN）2017 指南[8]對患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層。本研究經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：2023260 ）且所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方案及療效評價(jià) 526 例患者中，除51 例患者未接受誘導(dǎo)化療外，其余患者經(jīng)診斷后均接受誘導(dǎo)治療。誘導(dǎo)化療方案包括：強(qiáng)化療方案，包括標(biāo)準(zhǔn)劑量阿糖胞苷聯(lián)合蒽環(huán)類藥物（IA 或DA）方案（303 例），高三尖杉酯堿聯(lián)合DA（HAD）方案（25 例）；靶向治療方案，包括去甲基化藥物（hypomethylating agent，HMA）聯(lián)合B-cell lymphoma-2（Bcl-2）抑制劑（43 例）或聯(lián)合預(yù)激方案（86 例）或聯(lián)合其他方案（18 例）。化療藥物均參考《中國成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血病）診療指南（2021 年版）》[9]推薦用量進(jìn)行。

誘導(dǎo)治療恢復(fù)期（化療間歇第28 天）行骨髓穿刺評估療效。療效評估標(biāo)準(zhǔn)參照ELN 2017 指南[8]，包括：完全緩解（complete remission，CR），部分緩解（partial remission，PR），未緩解（non-remission，NR）。總反應(yīng)率（overall response rate，ORR）定義為患者在治療后達(dá)到CR、PR 的比例。

1.2.2 血液腫瘤相關(guān)基因外顯子NGS 檢測方法 抽取患者骨髓液（EDTA 抗凝管）3 mL，提取送檢標(biāo)本中基因組DNA，基于目標(biāo)區(qū)域探針捕獲技術(shù)，采用Illumina 高通量測序平臺對目的基因（56 個(gè)血液系統(tǒng)腫瘤相關(guān)基因，分別為：ANKRD26、ASXL1、ASXL2、BCOR、BCORL1、CASP8、CBL、CCND1、CCDN2、CCDN3、CDC25C、CDKN1B、CEBPA、CSF3R、CUX1、DDX41、DNMT3A、ETV6、EZH2、FLT3、GATA1、GATA2、IDH1、IDH2、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KMT2A、KRAS、NF1、NPM1、NRAS、PHF6、PTEN、PTPN11、RAD21、RELN、RUNX1、SETBP1、SETD2、SF1、SF3B1、SMC1A、SMC3、SRP72、SRSF2、STAG2、TERT、TET2、TP53、U2AF1、WT1、ZBTB7A、ZESR2）蛋白質(zhì)編碼區(qū)域進(jìn)行檢測。平均基因覆蓋率＞99%，平均測序深度為2 000×。以GRCh37/hg19 為參考基因組，使用DRAGEN 軟件對每個(gè)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制分析。分析目的基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)域以及外顯子旁側(cè)內(nèi)含子的點(diǎn)突變和短片段插入/缺失突變。測序后原始數(shù)據(jù)利用dbSNP、1000 Genomes、gnomAD、COSMIC、ClinVar 等公共數(shù)據(jù)庫及Polyphen2、SIFT 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定致病基因突變位點(diǎn)。

1.2.3 傾向性評分匹配 為減少研究中的偏差和混雜因素的影響，將PTPN11mut患者和PTPN11wt患者進(jìn)行匹配，選擇診斷時(shí)的性別、年齡和ELN 2017 危險(xiǎn)度分層等作為協(xié)變量，按1∶1 的比例、0.1 的卡鉗值、最近鄰匹配法進(jìn)行PSM。

1.2.4 隨訪 隨訪方式以住院病歷、門診病歷、微信及電話為主。隨訪日期截至2023 年3 月31 日或患者死亡日期，失訪患者截至失訪日期。中位隨訪21.3（9.8～34.4）個(gè)月，失訪患者4 例（4.2%）?？偵妫╫verall survival，OS）時(shí)間定義為自診斷日期至患者死亡或隨訪截止日期。無復(fù)發(fā)生存（relapse-free survival，RFS）時(shí)間定義為患者達(dá)血液學(xué)CR 日期至患者死亡、首次復(fù)發(fā)或隨訪截止日期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 27.0 和R 4.3.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPad Prism 9.3.0 軟件繪制生存曲線。計(jì)量資料以中位數(shù)（范圍）表示，采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。分類資料以例數(shù)（構(gòu)成比）表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法進(jìn)行比較。通過Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。雙側(cè)P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基線特征

526 例AML 患者中男性298 例，女性228 例，中位年齡51（11～83）歲。51 例PTPN11 突變型和475例PTPN11 野生型患者的臨床特征，見表1。兩組患者僅在骨髓原始細(xì)胞比例（P=0.015）和ELN 2017 危險(xiǎn)度分層（P=0.043）方面具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在性別、年齡、診斷時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)、誘導(dǎo)化療方案等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)ELN 2017 危險(xiǎn)度分層標(biāo)準(zhǔn)，與PTPN11wt組相比，PTPN11mut患者常發(fā)生在預(yù)后良好組（21.9%vs.37.3%，P=0.014），而在預(yù)后中等和預(yù)后不良組發(fā)生率較低。剔除未接受誘導(dǎo)治療的AML 患者，根據(jù)性別、年齡和ELN 2017 危險(xiǎn)度分層等臨床資料進(jìn)行PSM，匹配后兩組各納入48 例患者，兩組患者基線特征一致，具有可比性（表1）。

表1 PSM 前后PTPN11mut AML 和PTPN11wt AML 患者的臨床特征

2.2 PTPN11 突變患者的基因特征分析

526 例AML 患者中51 例存在PTPN11 基因突變，PTPN11 基因突變頻率為9.7%（51/526）。共檢測到72 種突變類型，均為錯(cuò)義突變。最常見的突變位點(diǎn)發(fā)生于N-SH2 結(jié)構(gòu)域的A72（22.2%）、E76（13.9%）、D61（11.1%）和PTP 結(jié)構(gòu)域的G503（9.7%）和S502（8.3%）（圖1A）。PTPN11 突變常與其他基因發(fā)生共突變，共突變發(fā)生率最高的基因?yàn)镹RAS 為52.9%（27/51），其次為DNMT3A 為35.3%（18/51）、FLT3為33.3%（17/51）、NPM1 為31.4%（16/51）、KRAS為21.6%（11/51）（圖1B）。與PTPN11wt組相比，PTPN11 突變與NRAS（52.9%vs.20.6%，P＜0.001）、KRAS（21.6%vs.8.4%，P=0.006）、DNMT3A（35.3%vs.16.8%，P=0.001）和NPM1（31.4%vs.17.9%，P=0.020）等基因共突變發(fā)生率較高，而與FLT3（33.3%vs.26.1%，P=0.268）、TET2（17.6%vs.14.7%，P=0.580）和CEBPA（11.8%vs.21.9%，P=0.091）等基因共突變發(fā)生率兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

圖1 PTPN11mut 患者突變位點(diǎn)及共突變基因概況

2.3 療效及生存分析

對PSM 后兩組患者的首次誘導(dǎo)化療療效進(jìn)行評估，48 例PTPN11mut患者中34 例CR（70.8%），3 例PR（6.3%），48 例PTPN11wt患者中27 例CR（56.3%），5 例PR（10.4%），兩組患者1 個(gè)療程誘導(dǎo)化療的CR率（70.8%vs.56.3%，P=0.138）和ORR（77.1%vs.66.7%，P=0.256）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

生存分析顯示，PTPN11mut患者和PTPN11wt患者中位OS（median OS，mOS）時(shí)間分別為21.3 個(gè)月和31.4 個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.416）（圖2A）。PTPN11mut組與PTPN11wt組相比，中位RFS（median RFS，mRFS）明顯縮短（19 個(gè)月vs.N/A，P=0.02）（圖2B）。為進(jìn)一步評估異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）對PTPN11mut患者預(yù)后的影響，本研究對接受和未接受移植的患者進(jìn)行了生存比較。13 例（27.1%）患者接受allo-HSCT，35 例（72.9%）僅接受常規(guī)化療和鞏固治療。結(jié)果顯示，進(jìn)行allo-HSCT 的PTPN11mut患者mOS 和mRFS 均未達(dá)到，明顯長于未接受移植的PTPN11mut患者（OS：N/Avs.11 個(gè)月，P=0.001；RFS：N/Avs.5.7 個(gè)月，P=0.018）（圖3A、3B）。匹配前PTPN11 突變更常發(fā)生于ELN 2017 危險(xiǎn)度分層預(yù)后良好組，因此比較了匹配后危險(xiǎn)度分層對患者OS 及RFS 的影響。結(jié)果顯示ELN 2017 危險(xiǎn)度分層對PTPN11mut患者OS 無顯著影響（圖4A），而預(yù)后良好組PTPN11mut患者RFS 明顯延長（P=0.012）（圖4B）。

圖2 PTPN11mut 與PTPN11wt 患者生存分析

圖3 PTPN11mut 移植與未移植患者生存分析

圖4 不同ELN 2017 危險(xiǎn)度分層PTPN11mut 患者生存分析

2.4 單因素和多因素分析

為研究影響PTPN11mut患者OS 和RFS 的獨(dú)立預(yù)后因素，納入性別、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、首次療效評估、移植、復(fù)發(fā)及可能影響預(yù)后的基因突變等因素進(jìn)行Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型單因素分析，結(jié)果顯示首次誘導(dǎo)療效未達(dá)CR 和未行allo-HSCT 是影響PTPN11mut患者OS 的危險(xiǎn)因素，復(fù)發(fā)、未行allo-HSCT、伴NPM1和RUNX1 突變是影響PTPN11mut患者RFS 的危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步將單因素分析中P＜0.1 的因素納入Cox 回歸多因素分析，結(jié)果表明首次誘導(dǎo)療效未達(dá)CR 和未接受allo-HSCT 是影響PTPN11mut患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），影響PTPN11mut患者RFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素為復(fù)發(fā)和未行allo-HSCT（P＜0.05）（表2）。此外，合并RUNX1 突變的PTPN11mut患者與較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（P=0.05）。

表2 影響PTPN11mut AML 患者OS 和RFS 的單因素和多因素Cox 回歸分析

3 討論

成人急性髓系白血病中PTPN11 基因突變發(fā)生率為4%～10%[5-6,10]，其預(yù)后意義尚存爭議。本研究采用傾向性評分匹配方法均衡混雜因素的影響，分析PTPN11mut初治AML 患者臨床特征及預(yù)后影響因素。結(jié)果提示，526 例初治AML 患者中PTPN11 突變檢出率為9.7%，且常與NRAS、DNMT3A、FLT3、NPM1、KRAS 等基因伴隨出現(xiàn)；生存分析顯示，PTPN11mutAML 患者無復(fù)發(fā)生存時(shí)間明顯短于無突變患者。隨后進(jìn)行的Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析表明，未接受allo-HSCT、首次誘導(dǎo)療效未達(dá)CR 和復(fù)發(fā)是影響PTPN11mut患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

研究表明，PTPN11 突變的AML 患者通常以女性居多[11-12]，且初診時(shí)高齡[13]、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血小板計(jì)數(shù)較高[10-11]，多發(fā)生于ELN 2017 危險(xiǎn)度分層預(yù)后良好組[5-6]。本研究觀察到PTPN11 突變與ELN 2017 危險(xiǎn)度分層顯著相關(guān)，但與患者性別、年齡、外周血白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)等因素?zé)o明顯相關(guān)性。Liu 等[14]在國內(nèi)開展的相關(guān)研究顯示PTPN11 突變型與野生型患者之間在性別、年齡、白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、細(xì)胞遺傳學(xué)核型等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本研究結(jié)果相一致。各研究納入的患者在性別、年齡、人種等方面的差異，可能是造成上述研究之間結(jié)果不一致的主要原因。

基因突變是影響AML 患者預(yù)后的重要決定因素，隨著基因檢測技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的突變基因被檢出，且大多伴隨其他基因突變。Stasik 等[6]在1 529 例AML 患者中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)PTPN11 突變患者伴隨NPM1 突變的發(fā)生率明顯高于PTPN11 野生型患者，伴隨DNMT3A 突變和NRAS 突變的發(fā)生率也有升高趨勢。Sun 等[10]研究亦證實(shí)PTPN11 突變患者更易合并NPM1、DNMT3A 和NRAS 突變，很少與CEBPA、KIT 和EZH2 發(fā)生共突變。本研究發(fā)現(xiàn)NRAS、KRAS、DNMT3A 和NPM1 等突變?yōu)镻TPN11 常見的共存突變，與文獻(xiàn)報(bào)道相似。在突變類型和位點(diǎn)方面，Stasik 等[6]報(bào)道PTPN11 突變主要發(fā)生在N-SH2 結(jié)構(gòu)域的E76、D61、A72 位點(diǎn)和PTP結(jié)構(gòu)域的S502、G503 位點(diǎn)。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符，51 例PTPN11 突變患者以A72、E76、D61、G503 和S502 等為主要突變位點(diǎn)。

Alfayez 等[11]對880 例新診斷AML 患者的分析顯示，PTPN11mut患者CR 率和ORR 分別為40%和68%，CR 率明顯低于對照組，ORR 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中PTPN11mut患者的首次誘導(dǎo)CR 率（70.8%）和ORR（77.1%）均高于野生型患者，可能與本研究中PTPN11mut患者常伴隨NPM1 突變有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道NPM1 野生型患者合并PTPN11 突變常表現(xiàn)為較低的CR 率和OS，而在NPM1 突變的AML 患者中PTPN11 突變對預(yù)后無顯著性影響[13,15]。此外，本研究中PTPN11 突變患者中位年齡低于文獻(xiàn)報(bào)道中位年齡，該部分患者對強(qiáng)化療耐受性好，可能是本研究中PTPN11mut患者療效優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的另一個(gè)原因。

本研究結(jié)果提示PTPN11 突變主要對AML 患者的無復(fù)發(fā)生存時(shí)間具有不良影響，但不影響OS。Alfayez 等[11]認(rèn)為PTPN11 突變的AML 患者預(yù)后不良，常伴有較短的OS 和RFS，PTPN11 突變是導(dǎo)致初治AML 患者預(yù)后差、死亡風(fēng)險(xiǎn)高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。然而，F(xiàn)obare 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PTPN11 突變型AML 患者與野生型AML 患者相比，CR 率、早期死亡率、OS和RFS 等并無顯著差異。該研究根據(jù)患者年齡分為年輕或老年兩組，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)PTPN11 突變對患者的臨床療效及預(yù)后均無明顯相關(guān)性，但老年P(guān)TPN11突變患者可能與較短的無病生存期相關(guān)（P=0.05）。本研究中PTPN11 突變患者療效及生存時(shí)間明顯高于既往文獻(xiàn)報(bào)道，可能與本研究大部分患者為年輕患者，對強(qiáng)化誘導(dǎo)治療具有良好的耐受性、化療相關(guān)死亡率低有關(guān)。

異基因造血干細(xì)胞移植是中高危AML 患者獲得CR 后的首選治療手段[9,16]。關(guān)于allo-HSCT 對PTPN11 突變患者預(yù)后的影響，文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一[10-12]，本研究結(jié)果表明接受allo-HSCT 的PTPN11mutAML患者較常規(guī)化療患者RFS 及OS 明顯延長，與Sun 等[10]報(bào)道結(jié)果一致，提示allo-HSCT 能夠顯著改善PTPN11mutAML 患者預(yù)后。

PTPN11 編碼的SHP2 是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的致癌性磷酸酶，其是受體酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)抑制SHP2 的表達(dá)能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞生長[2]，因此SHP2 可能是抗白血病治療的潛在有效靶點(diǎn)。SHP099 是首個(gè)作用于SHP2 變構(gòu)位點(diǎn)的小分子選擇性抑制劑，通過同時(shí)與N-SH2、CSH2 和PTP 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，穩(wěn)定SHP2 的自抑制構(gòu)象，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育[17]，因此SHP099 有望改善PTPN11 突變AML 患者的預(yù)后。目前，關(guān)于SHP2 抑制劑靶向治療急性髓系白血病的臨床研究有限，亟需進(jìn)一步開展前瞻性臨床研究證實(shí)其有效性。

綜上所述，PTPN11 突變AML 患者預(yù)后較差，且常合并多種基因突變，異基因造血干細(xì)胞移植能夠顯著改善PTPN11 突變AML 患者的預(yù)后。由于采用傾向性評分匹配手段進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，導(dǎo)致入組病例數(shù)偏少，且隨訪時(shí)間較短，結(jié)果可能存在一定局限性，希望未來應(yīng)用生信分析及前瞻性研究等方式，進(jìn)一步證實(shí)PTPN11 基因突變對AML 患者預(yù)后的影響。

本文無影響其科學(xué)性與可信度的經(jīng)濟(jì)利益沖突。