童蘭艷, 許博舟, 聶雪梅, 王秀娟, 馬佳慧 國 偉, 李根容, 龔迎昆, 許秀麗*

(1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176; 2.國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(食品質(zhì)量與安全),國家乳業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心,北京 100176; 3.重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院,國家農(nóng)副加工產(chǎn)品及調(diào)味品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心,重慶 401123)

自“三聚氰胺”事件發(fā)生以來,乳品的安全問題引起了廣大消費(fèi)者及相關(guān)監(jiān)管部門的關(guān)注[1,2]。近年來,關(guān)于乳及乳制品中檢測出真菌毒素類物質(zhì)的事件時(shí)有報(bào)道[3-5]。真菌毒素是真菌在糧食和飼料中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,毒素通過食物鏈從牛、羊等轉(zhuǎn)移至乳及乳制品中,受污染的乳及乳制品即使經(jīng)過高溫、殺菌過程,真菌毒素也不會被破壞[6]。真菌毒素是由鐮刀菌屬、青霉屬、曲霉屬等真菌在適宜的溫、濕度條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[7]。大多數(shù)真菌毒素可通過抑制動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)和相關(guān)酶的合成破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),導(dǎo)致動(dòng)物體肝臟[8]、腎臟[9]、神經(jīng)[10]、造血[11]等組織器官損害,具有致癌、致畸、致突變、神經(jīng)毒性以及免疫毒性等作用,嚴(yán)重威脅人類身體健康。隨著對真菌毒素研究的深入,一些新型的真菌毒素不斷被發(fā)現(xiàn),如單端孢霉烯族毒素、恩鐮孢菌毒素、白僵菌素和細(xì)胞松弛素等[12]。這些真菌毒素尚未得到監(jiān)管,沒有被標(biāo)準(zhǔn)檢測方法覆蓋,且毒理研究和污染數(shù)據(jù)有限,還能與其他真菌毒素協(xié)同作用產(chǎn)生更強(qiáng)毒性,因此被稱為“新興”真菌毒素。目前國內(nèi)對于乳中黃曲霉毒素M1(AFM1)的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.5 μg/kg,其他真菌毒素均未單獨(dú)制定殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。且現(xiàn)行GB 5009.22-2016[13]僅適用于乳中黃曲霉毒素M1和M2(AFM2)的測定。因此,針對尚未制定國家標(biāo)準(zhǔn)限量或者研究較少的真菌毒素亟待開展相關(guān)研究。

文獻(xiàn)報(bào)道的真菌毒素檢測方法主要有免疫分析法[14,15]、色譜法[16,17]和質(zhì)譜法[18,19]。質(zhì)譜法簡化了前處理步驟,提高了準(zhǔn)確性和靈敏度,目前廣泛應(yīng)用于真菌毒素的檢測。三重四極桿質(zhì)譜定量準(zhǔn)確,但是分辨率不足。液態(tài)乳中脂肪含量高,基質(zhì)復(fù)雜,且真菌毒素含量較低,實(shí)現(xiàn)多種真菌毒素的高通量篩查及同時(shí)檢測存在極大挑戰(zhàn)。液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜法具有質(zhì)量分辨率高和提供準(zhǔn)確相對分子質(zhì)量的優(yōu)勢,無需逐個(gè)優(yōu)化目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù),不受傳統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜檢測化合物數(shù)量的限制,可通過提供母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù),實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性[20,21]。因此本研究根據(jù)液態(tài)牛奶的基質(zhì)特點(diǎn),采用液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜分析系統(tǒng),建立了牛奶中22種真菌毒素同時(shí)測定的分析方法,通過一級全掃描獲得目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù),同時(shí)結(jié)合數(shù)據(jù)依賴型二級掃描(dd-MS2)模式獲得目標(biāo)物的二級特征質(zhì)譜圖,快速、準(zhǔn)確、高效地完成了牛奶中22種真菌毒素的快速篩查和確證,以期為真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)全面評估及防控技術(shù)研發(fā)提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀(美國Dionex公司); Thermo Q-Exactive Orbitrap四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司);電子天平XP 105DR(瑞士Mettler Toledo公司);移液器(德國Eppendorf公司); Vortex-Genie2多功能旋渦混合器(美國Scientific Industries公司); KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); Allegra X-22R離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司); MFV-24智能氮吹儀(得泰儀器科技有限公司)。

22種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品:恩鐮孢菌素A(ENA,CAS號:2503-13-1,純度≥99.0%)、恩鐮孢菌素A1(ENA1,CAS號:4530-21-6,純度≥99.9%)、恩鐮孢菌素B(ENB,CAS號:917-13-5,純度≥99.0%)、恩鐮孢菌素B1(ENB1,CAS號:19914-20-6,純度≥99.5%)、白僵菌素(BEA,CAS號:26048-05-5,純度≥99.2%)、細(xì)胞松弛素B(CB,CAS號:14930-96-2,純度≥99.0%)、細(xì)胞松弛素C(CC,CAS號:22144-76-9,純度≥99.2%)、細(xì)胞松弛素D(CD,CAS號:22144-77-0,純度≥98.5%)、細(xì)胞松弛素E(CE,CAS號:36011-19-5,純度≥99.2%)、細(xì)胞松弛素H(CH,CAS號:53760-19-3,純度≥99.2%)、細(xì)胞松弛素J(CJ,CAS號:53760-20-6,純度≥99.5%)、二乙酰鐮刀菌烯醇(CAS號:2270-40-8,DAS,純度≥99.0%)、新茄病鐮刀菌烯醇(NEO,CAS號:36519-25-2,純度≥99.3%)、T-2毒素(T-2,CAS號:21259-20-1,純度≥98.2%)、HT-2毒素(HT-2,CAS號:26934-87-2,純度≥99.0%)、黃曲霉毒素B1(AFB1,CAS號:1162-65-8,純度≥99.0%)、黃曲霉毒素B2(AFB2,CAS號:7220-81-7,純度≥99.9%)、黃曲霉毒素M1(CAS號:6795-23-9,純度≥99.9%)、黃曲霉毒素M2(CAS號:6885-57-0,純度≥99.2%)、赭曲霉毒素A(OTA,CAS號:303-47-9,純度≥99.0%)、赭曲霉毒素B(OTB,CAS號:4825-86-9,純度≥99.0%)、赭曲霉毒素C(OTC,CAS號:4865-85-4,純度≥99.0%)購自澳大利亞Romer公司,純度均在97%以上。3種同位素內(nèi)標(biāo):13C17-黃曲霉毒素B1(13C17-AFB1,CAS號:1217449-45-0,純度≥99.5%)、13C20-赭曲霉毒素A(13C20-OTA,CAS號:911392-42-2,純度≥99.5%)、13C15-瓜萎鐮菌醇(13C15-NIV,CAS號:911392-40-0,純度≥99.5%),購于美國Romer Labs公司。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸(色譜純,美國Thermo Fisher公司);乙酸銨(色譜純,德國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司);超純水(由Milli-Q超純水機(jī)制備(英國ELGA公司));氯化鈉(分析純,美國Agilent公司);尼龍濾膜(0.22 μm,美國Waters公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:向真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品中加入適量甲醇,充分溶解得到真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃冰箱避光封口保存,12個(gè)月內(nèi)用完。標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別精密移取適量22種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋定容,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,渦旋混勻后置于棕色試劑瓶內(nèi),于-20 ℃冰箱避光封口保存。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,用甲醇配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

內(nèi)標(biāo)儲備液:向同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品中加入適量甲醇,充分溶解得到內(nèi)標(biāo)儲備液,于-20 ℃冰箱避光封口保存,12個(gè)月內(nèi)用完。內(nèi)標(biāo)使用液:分別精密移取適量3種同位素內(nèi)標(biāo)儲備液于容量瓶中,用甲醇稀釋定容至刻度,配成質(zhì)量濃度為200 μg/L的同位素內(nèi)標(biāo)使用液,于-20 ℃冰箱避光封口保存,3個(gè)月內(nèi)用完。

1.3 樣品前處理

稱取均勻試樣2.0 g,置于15 mL離心管中,加入10 μL內(nèi)標(biāo)使用液和4 mL 0.5%甲酸乙腈溶液,渦旋1 min,超聲提取10 min,加入1 g氯化鈉,渦旋2 min,在4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min,準(zhǔn)確移取2 mL上清液于氮吹管中,于40 ℃水浴中氮吹至干,加入1 mL 50%甲醇水溶液復(fù)溶,渦旋1 min,過0.22 μm濾膜,供液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜系統(tǒng)分析。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國Agilent公司);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相A為含10 mmol/L乙酸銨的0.1%乙酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1%乙酸甲醇溶液;流速0.30 mL/min;進(jìn)樣量5.0 μL。梯度洗脫條件如表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),正離子模式;離子源溫度320 ℃;鞘氣流速40 arb;輔助氣流速10 arb;噴霧電壓3.2 kV,毛細(xì)管溫度320 ℃。掃描模式為數(shù)據(jù)依賴型二級掃描模式。全掃描模式的分辨率為70 000半峰全寬(FWHM),掃描范圍為m/z100～1 000,C-trap的自動(dòng)增益控制(AGC)目標(biāo)為1×106,最大注射時(shí)間(IT)為100 ms。dd-MS2的分辨率為17 500 FWHM,AGC目標(biāo)1×105,最大IT 50 ms,TopN 5,隔離窗口m/z4。22種真菌毒素及3種同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜信息見表2。

表2 22種真菌毒素及3種同位素內(nèi)標(biāo)的化合物信息及質(zhì)譜參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)分別采用SPSS 22.0和Origin 2018軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件是影響真菌毒素前體離子和碎片離子響應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了電離模式和歸一化碰撞能。利用液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜對22種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行正負(fù)離子掃描,得到一級全掃描質(zhì)譜圖,發(fā)現(xiàn)部分真菌毒素在負(fù)離子模式下無響應(yīng),22種真菌毒素在正離子模式下響應(yīng)值均高于負(fù)離子模式,最終確定掃描模式為正離子模式。為了獲得最大響應(yīng)和穩(wěn)定的碎片離子,比較了真菌毒素在不同碰撞能量下的碎片離子強(qiáng)度。22種真菌毒素和3種內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇

色譜柱的類型、填料和長度是影響目標(biāo)化合物分離的重要因素之一。選擇合適的色譜柱,目標(biāo)物可以得到更好的分離,也可以提高方法的靈敏度和穩(wěn)定性。本文比較了ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Waters BEH HILIC (100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和SUPELCO Ascentis C8(100 mm×4.6 mm,1.7 μm)3種色譜柱的分離效果。結(jié)果顯示,Waters BEH HILIC和SUPELCO Ascentis C8色譜柱無法對細(xì)胞松弛素C和細(xì)胞松弛素D這對同分異構(gòu)體進(jìn)行有效分離,而ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱則可以對這對同分異構(gòu)體進(jìn)行分離,因此采用該色譜柱分析牛奶中的22種真菌毒素。

2.2.2流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相、pH值、流速等都會影響目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和乙腈作為強(qiáng)洗脫流動(dòng)相的洗脫效果。結(jié)果表明,甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí),化合物具有更好的響應(yīng)。這有可能是因?yàn)榧状季哂匈|(zhì)子供體特性,有利于真菌毒素形成帶正電荷的分子離子加合物。乙腈的介電常數(shù)低于甲醇,因此甲醇的電荷轉(zhuǎn)移高于乙腈,電離效率更高。

由于酸性環(huán)境有利于[M+H]+的形成,有利于提高離子化效率[22,23],實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相中加入0.1%乙酸,發(fā)現(xiàn)使用0.1%乙酸水和0.1%乙酸甲醇進(jìn)行梯度洗脫時(shí),黃曲霉毒素類化合物有拖尾現(xiàn)象,而在水相中加入少量乙酸銨能消除這種拖尾現(xiàn)象。為了增大目標(biāo)化合物的響應(yīng)值并改善峰形,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了不同濃度乙酸銨對目標(biāo)化合物離子化效率的影響。結(jié)果表明,10 mmol/L的乙酸銨能夠最大限度地增加目標(biāo)化合物的響應(yīng)值并改善峰形,而過高濃度的乙酸銨反而會降低目標(biāo)化合物的離子化效率[24]。所以實(shí)驗(yàn)最終選擇含10 mmol/L乙酸銨的0.1%乙酸水溶液和0.1%乙酸甲醇溶液作為流動(dòng)相。22種真菌毒素和3種同位素內(nèi)標(biāo)在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下的色譜圖如圖1所示。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[21,25]得知,提取真菌毒素常用的提取溶劑為甲醇、乙腈、甲醇-水和乙腈-水。由于牛奶中有較高含量的蛋白質(zhì)和脂肪等,在真菌毒素的提取過程中容易團(tuán)聚和乳化而影響提取效果,因此需要對牛奶進(jìn)行去除蛋白質(zhì)和脂肪的操作,以提高提取效率。本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(1∶1,v/v)對真菌毒素提取效果的影響。結(jié)果顯示,乙腈具有更好的提取效果,因?yàn)橐译嬗泻芎玫某恋淼鞍踪|(zhì)的作用。在提取溶劑中加入一定量的酸性物質(zhì)可以改善真菌毒素的提取效率,本實(shí)驗(yàn)比較了不同體積分?jǐn)?shù)(0、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%和6.0%)的甲酸乙腈溶液的提取效率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。在加入酸性物質(zhì)后,真菌毒素的提取效果得到改善,但是過高的酸性比例會降低提取效率,綜合考慮確定0.5%甲酸乙腈作為提取溶劑。

2.3.2提取溶劑體積的選擇

本實(shí)驗(yàn)對比了提取溶劑體積為2、4、8 mL時(shí)22種真菌毒素的回收率情況(見圖3)。大部分真菌毒素回收率隨著提取溶劑體積的增加而提高,但回收率不會隨著提取溶劑用量增加持續(xù)提高。部分目標(biāo)物如ENB、OTA、OTB、OTC隨著提取溶劑體積的增加回收率呈先增加后減小的趨勢,這可能由于提取溶劑體積增加,提取到的雜質(zhì)也隨之增加,干擾目標(biāo)物檢測。而且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提高溶劑使用量,氯化鈉鹽析和高速離心無法實(shí)現(xiàn)水相和有機(jī)相分層,不利于目標(biāo)化合物的析出。因此,最終提取溶劑體積選擇4 mL。

圖3 不同提取溶劑體積下22種真菌毒素的回收率(n=6)

2.3.3提取鹽的選擇

牛奶中真菌毒素的提取屬于液液萃取,加入一定量的鹽對于真菌毒素提取有十分重要的作用。本文考察了氯化鈉和無水硫酸鎂對回收率的影響,由圖4可知,在牛奶提取過程中加入氯化鈉,22種真菌毒素的回收率較好。氯化鈉在實(shí)驗(yàn)過程中的鹽析作用有利于真菌毒素從牛奶中析出,離心過后有機(jī)相和水相分層,目標(biāo)化合物進(jìn)入有機(jī)相,故加入氯化鈉有利于提高回收率。在含水的牛奶樣品中加入無水硫酸鎂,無水硫酸鎂吸水后放熱,牛奶蛋白質(zhì)變質(zhì)結(jié)塊,吸附部分目標(biāo)化合物,導(dǎo)致部分目標(biāo)化合物回收率降低。故本實(shí)驗(yàn)選擇加入氯化鈉。

圖4 采用不同提取鹽時(shí)22種真菌毒素的回收率(n=6)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

樣品提取凈化后,可能會有一些共同提取物對真菌毒素的離子化效率產(chǎn)生影響,造成目標(biāo)物的信號響應(yīng)增強(qiáng)或抑制的現(xiàn)象稱為基質(zhì)效應(yīng)(ME)。基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)可能會造成假陽性或者假陰性的結(jié)果,因此本文對方法的基質(zhì)效應(yīng)做了初步考察。實(shí)驗(yàn)選取陰性樣品,按照1.3節(jié)進(jìn)行提取凈化,獲得空白基質(zhì)提取液。用空白基質(zhì)提取液和甲醇分別配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到基質(zhì)匹配校準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液,同法分析。根據(jù)ME=(基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)/(溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)×100%計(jì)算。當(dāng)ME為-20%～20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng),ME為-50%～-20%或20%～50%時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng),當(dāng)ME≤-50%或≥50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[26]。結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)條件下空白基質(zhì)中22種真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)絕對值<20%(見圖5),說明牛奶中22種真菌毒素在本實(shí)驗(yàn)過程中基質(zhì)效應(yīng)較弱。因此本方法采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸擬合。

2.5 方法學(xué)評價(jià)

2.5.1線性范圍與檢出限

對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,以化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸擬合,得到線性方程和相關(guān)系數(shù)(R2)。結(jié)果表明,22種真菌毒素在0.5～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.999。在空白牛奶樣品中添加適量標(biāo)準(zhǔn)品,以樣品中目標(biāo)化合物信噪比為3和10時(shí)的含量分別為22種真菌毒素的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.3～0.5 μg/kg和1.0～1.5 μg/kg(見表3),低于GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[27]中規(guī)定的指標(biāo),說明該方法可滿足牛奶中真菌毒素的檢測要求。

表3 22種真菌毒素的線性范圍、檢出限、定量限及3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.5.2回收率與精密度

在空白牛奶樣品中添加低、中、高3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,添加量分別為1.5、5.0和15 μg/kg,每個(gè)水平做6個(gè)平行樣。按照優(yōu)化的前處理?xiàng)l件進(jìn)行真菌毒素的提取和凈化。根據(jù)加標(biāo)濃度和實(shí)際測得濃度計(jì)算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表3所示,22種真菌毒素的加標(biāo)回收率為84.7%～100.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～9.9%,說明本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性好,符合要求。

2.6 實(shí)際樣品的檢測

購買來自不同國家和地區(qū)的市售牛奶25份,用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測,實(shí)驗(yàn)采用已確證的陰性樣品加標(biāo),同步進(jìn)行前處理和分析,作為實(shí)驗(yàn)過程的質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)際樣品中均未檢出22種真菌毒素。

3 結(jié)論

本研究建立了牛奶中22種真菌毒素的液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜快速篩查方法及精準(zhǔn)定量檢測方法。目標(biāo)物經(jīng)酸化乙腈提取后,通過簡單的低溫高速離心達(dá)到凈化目的。利用一級全掃描和dd-MS2質(zhì)譜掃描模式,對22種真菌毒素進(jìn)行了定性定量分析。該方法為開展新興毒素毒性評價(jià)、檢測技術(shù)研發(fā)和污染水平調(diào)查提供技術(shù)支持,并為提出符合國情的真菌毒素污染控制措施以及食品中新污染物的防控提供依據(jù)。