燕禹彤, 高春雨, 張曉梅, 安子哲,馬蘊(yùn)真, 韓林林, 張鴻偉*, 趙 雪*

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266003; 2.青島海關(guān)技術(shù)中心,山東 青島 266109; 3.山東大學(xué)國家糖工程技術(shù)研究中心,山東 青島 266237; 4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)巴瑟斯未來農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,山東 青島 266109)

啤酒酵母(Saccharomycespastorianus)是一種由釀酒酵母(S.cerevisiae)和真貝酵母(S.eubayanus)雜交獲得的重要工業(yè)生產(chǎn)菌株[1],2022年我國啤酒生產(chǎn)的副產(chǎn)品酵母粉的總產(chǎn)量約5.35萬噸。啤酒酵母可用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和酵母抽提物等活性物質(zhì),已廣泛地應(yīng)用于飼料、健康食品和調(diào)味料中[2-5]。啤酒酵母蛋白質(zhì)含量豐富,是一種便宜、豐富的蛋白質(zhì)資源[6]。目前研究報(bào)道表明,酵母蛋白酶解物中發(fā)現(xiàn)了抗氧化肽、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽、抗糖尿病肽、抗菌肽、免疫調(diào)節(jié)肽等,且廣泛地應(yīng)用于健康食品和化妝品中[7,8]。

目前,生產(chǎn)酵母蛋白肽主要使用酶解法和發(fā)酵法降解酵母蛋白,酶解法主要采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等高效蛋白酶酶解制備啤酒酵母蛋白肽,酶解工藝以水解度、多肽的相對(duì)分子質(zhì)量、多肽含量等指標(biāo)來優(yōu)化[9-11]。比較發(fā)現(xiàn),雖然復(fù)合酶解可以獲得較高的水解度和肽得率,但是深度酶解會(huì)導(dǎo)致很多活性肽被水解,不是制備活性肽的最佳方式[7]。蛋白酶解產(chǎn)物中多肽種類和結(jié)構(gòu)復(fù)雜,酶的種類和酶解條件對(duì)蛋白肽的肽指紋譜圖和活性肽的影響還缺少系統(tǒng)的研究。對(duì)于啤酒酵母而言,已有研究對(duì)其特有蛋白質(zhì)、獨(dú)特功能以及不同條件下的蛋白質(zhì)變化等進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析,而對(duì)于肽序列及其活性方面的肽組學(xué)研究較少。因此酶解工藝與產(chǎn)物組成之間的關(guān)系仍然需要進(jìn)一步系統(tǒng)的研究,對(duì)揭示蛋白肽產(chǎn)品的構(gòu)效關(guān)系具有重要作用。

肽組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)分支,是對(duì)生物樣品中的肽進(jìn)行全面定性和定量描述的技術(shù)。基于質(zhì)譜平臺(tái)的肽組學(xué)分析技術(shù)有著一定的分析優(yōu)勢(shì):可以獲得反映生物樣品特質(zhì)的足夠的分子信息且可以進(jìn)行數(shù)據(jù)采集后回溯分析;質(zhì)譜方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確性高、在線分離能力強(qiáng)、靈敏度高[12-15]以及多目標(biāo)和高通量分析的優(yōu)勢(shì);多肽的序列結(jié)構(gòu)對(duì)于某些加工過程(如加熱、剪切等)具有更好的分析穩(wěn)定性。因此,基于質(zhì)譜平臺(tái)的肽組學(xué)分析技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中多肽指紋譜圖、鮮味肽和活性肽的分析鑒定[15-17]。但是質(zhì)譜分析的難點(diǎn)在于需要計(jì)算和鑒定生物樣品中幾千或幾萬個(gè)長短肽的序列和含量,工作量非常巨大。

多肽的鑒定最常見的方法是質(zhì)譜法,其通過對(duì)多肽離子質(zhì)荷比(m/z)的分析,測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu),依賴現(xiàn)有可用的數(shù)據(jù)庫匹配實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù),實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽的定性分析。并且通過研發(fā)一系列聯(lián)用設(shè)備、開發(fā)多項(xiàng)新化學(xué)技術(shù)和優(yōu)化儀器參數(shù)等方法,形成更穩(wěn)定的“y”或“b”離子來更好地實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的匹配。但該法的一個(gè)顯著缺點(diǎn)是不能用于鑒定來自未知基因組的蛋白質(zhì)。而基于人工智能算法的PEAKS Online云計(jì)算平臺(tái),解決了批量質(zhì)譜數(shù)據(jù)集高通量解析的難題[18,19]。PEAKS Online是一種基于bottom up技術(shù)路線的蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件,采用蛋白質(zhì)從頭測(cè)序de novo算法,不依賴于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,計(jì)算所有可能的氨基酸組合中的最佳可能序列,用于在不使用數(shù)據(jù)庫的情況下提取氨基酸序列信息,進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量分析。研究發(fā)現(xiàn),與目前國際上其他算法平臺(tái)相比較,PEAKS Online平臺(tái)可以多解析出5%～30%的肽段序列,把對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴型采集(data dependent acquisition,DDA)和數(shù)據(jù)非依賴型采集(data independent acquisition,DIA)數(shù)據(jù)的解析和挖掘能力提升到了一個(gè)全新的高度。

本研究采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry,UHPLC-HRMS),結(jié)合PEAKS Online云計(jì)算平臺(tái)和BIOPEP、Peptide Ranker在線數(shù)據(jù)庫,分析比較了酵母蛋白的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解液的肽指紋譜圖和活性肽的差異,揭示了不同蛋白酶對(duì)酵母蛋白肽產(chǎn)品組成的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultimate 3000 UHPLC system色譜儀和Q-Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo公司); ZipTip C18微量層析柱(ZTC18S008)、超濾管(UFC501008)、Milli-Q超純水制備系統(tǒng)(美國Millipore公司); SIGMA 1-14低溫冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司); PEAKS Online軟件(版本1.7,加拿大Bioinformatics Solutions Inc公司);Peptide Ranker在線數(shù)據(jù)庫(distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker),用于預(yù)測(cè)多肽的生物活性;數(shù)據(jù)庫BIOPEP(https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep/start_biopep.php),用于預(yù)測(cè)多肽的生物功能活性。

中性蛋白酶(比活力5×104U/g)、木瓜蛋白酶(比活力80×104U/g)均購自北京索萊寶科技有限公司;質(zhì)譜級(jí)甲酸購自美國Sigma-Aldrich公司;質(zhì)譜級(jí)乙腈、質(zhì)譜級(jí)甲醇均購自德國Merck公司。

啤酒酵母粉由青島啤酒有限公司提供。

1.2 樣品前處理

啤酒酵母粉以料液比1∶4(g∶mL)加入蒸餾水清洗酵母,3 000 r/min離心10 min,收集酵母沉淀,重復(fù)洗滌5次。酵母沉淀以料液比1∶4(g∶mL)加入蒸餾水混勻,制成酵母懸浮液。用高壓均質(zhì)機(jī)在90 MPa下破壁處理10 min,破壁后的酵母懸浮液分別在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳條件下進(jìn)行酶解(中性蛋白酶:添加量2 000 U/g,pH 7.0,溫度50 ℃,時(shí)間30 h;木瓜蛋白酶:添加量9 600 U/g,pH 6.0,溫度50 ℃,時(shí)間45 h)。酶解液在100 ℃加熱15 min滅酶活后,5 000 r/min離心10 min,收集上清液,用10 kDa超濾膜過濾,收集小于10 kDa的濾液為啤酒酵母蛋白酶解液[20-22]。

酵母蛋白酶解液用ZipTip C18微量層析柱脫鹽,收集乙腈-甲酸(1∶1,v/v)洗脫液,真空干燥。用50%(v/v)乙腈水溶液溶解成1 mg/mL,用0.22 μm超濾膜過濾后,進(jìn)行UHPLC-HRMS分析。

1.3 UHPLC-HRMS條件

色譜條件 色譜柱:C18(150 mm×1.0 mm,1.7 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.15 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;進(jìn)樣時(shí)間:50 min;流動(dòng)相:含0.1%甲酸的乙腈(A),0.1%甲酸水溶液(B);流動(dòng)相梯度:0～2 min,5%A; 2～27 min,5%A～10%A; 27～37 min,10%A～25%A; 37～39 min,25%A～80%A; 39～42 min,80%A; 42～43 min,80%A～5%A; 43～50 min,5%A。

質(zhì)譜條件 電噴霧正離子(ESI+)模式;噴霧電壓為3.4 kV;在數(shù)據(jù)依賴型采集模式下,m/z掃描范圍:200～1 500;其他參數(shù)設(shè)置如下:(1)一級(jí)質(zhì)譜:分辨率70 000;掃描阱容量為1×106。(2)二級(jí)質(zhì)譜:分辨率17 500;掃描阱容量為1×105;每個(gè)采集循環(huán)中監(jiān)測(cè)的最強(qiáng)離子數(shù)目為20;碰撞能量分別為20、35、45 eV;鞘氣(氮?dú)?流速為40 Arb;輔助氣體流速為10 Arb;毛細(xì)管溫度為320 ℃;輔助氣體加熱溫度為300 ℃;信號(hào)強(qiáng)度閾值為1.6×105。

1.4 多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析

使用PEAKS Online軟件分析不同酶解產(chǎn)物中所有多肽的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜,根據(jù)多肽的二級(jí)質(zhì)譜譜圖,采用de novo從頭測(cè)序算法計(jì)算出所有多肽的氨基酸序列。具體搜索設(shè)置如下。

模式選擇:PEAKS DB;參數(shù)設(shè)置:前體質(zhì)量誤差(precursor mass error tolerance)15×10-6(15 ppm);片段質(zhì)量誤差(fragment mass error tolerance)0.05 Da;酶(enzyme):無;漏切位點(diǎn)(missed cleavage)3;目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(target database)為Saccharomycespastorianus.fasta;置信度(ALC)大于50%;錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)小于1%。

根據(jù)每條肽的提取離子流圖計(jì)算其離子強(qiáng)度,歸一化計(jì)算獲得其相對(duì)離子強(qiáng)度。

1.5 多肽生物活性的預(yù)測(cè)和篩選

將啤酒酵母蛋白酶解物中經(jīng)PEAKS Online軟件解析出的所有多肽序列,使用在線數(shù)據(jù)庫Peptide Ranker預(yù)測(cè)多肽的生物活性。網(wǎng)站為每個(gè)個(gè)體肽序列提供了從0到1的生物活性概率,越接近1的肽,其具有生物活性的概率越高,評(píng)分大于0.50的多肽被認(rèn)為具有較高的生物活性[23]。使用數(shù)據(jù)庫BIOPEP對(duì)多肽的功能活性進(jìn)行分析[24],該數(shù)據(jù)庫中的肽均為已驗(yàn)證報(bào)道的生物活性肽,且隨著實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不斷補(bǔ)充。

2 結(jié)果與討論

2.1 啤酒酵母蛋白酶解物多肽指紋圖譜的分析比較

采用應(yīng)用廣泛且成本低的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)啤酒酵母蛋白進(jìn)行酶解,因酶解因素之間存在復(fù)雜的交互作用,酶解產(chǎn)物因酶解方法及酶解條件的不同存在很大差異,本文目的在于探究不同酶體系下的酶解產(chǎn)物肽組學(xué)差異,因此經(jīng)過單因素優(yōu)化,獲得最佳酶解條件(見1.2節(jié)),并以此制備酶解產(chǎn)物。采用UHPLC-HRMS對(duì)酶解產(chǎn)物中的多肽組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,圖1為兩種酶解產(chǎn)物中多肽的總離子流圖。

圖1 UHPLC-HRMS分析不同啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中多肽的總離子流圖

PEAKS Online分析肽序列所采用的方法可以概括為4個(gè)步驟:(1)預(yù)處理;(2)候選計(jì)算;(3)精確評(píng)分;(4)全局和位置置信度評(píng)分。PEAKS Online基于特征譜峰檢測(cè)算法來有效地計(jì)算最佳肽序列,其片段離子可以很好地解釋MS/MS譜中的峰,分析結(jié)果可給出具有整個(gè)序列的置信度評(píng)分的氨基酸序列,以及序列中各個(gè)位置氨基酸的評(píng)分。與其他分析軟件相比,PEAKS基于特征譜峰檢測(cè)算法,測(cè)序快速而準(zhǔn)確,可深度挖掘質(zhì)譜數(shù)據(jù);不僅能計(jì)算出更多最優(yōu)的序列和氨基酸,而且還能輸出位置置信度得分,從而可靠地確定哪些序列或氨基酸可能性最大[25]。如圖2所示,采用PEAKS解析序列為FLSL的四肽,根據(jù)特征譜峰所反映的相對(duì)分子質(zhì)量,找到對(duì)應(yīng)的b、y離子以及其他對(duì)應(yīng)離子,y1(m/z=132.10)、y2(m/z=219.13)、y3(m/z=332.21)、b2(m/z=261.16)、b3(m/z=348.18)、y2-H2O、b2-NH3等,推算出該譜圖所對(duì)應(yīng)肽段序列為FLSL,且結(jié)果中給出序列FLSL評(píng)分為84.7,氨基酸評(píng)分分別為89、89、92、68。

圖2 PEAKS Online解析酶解產(chǎn)物中多肽組成示例圖

利用多肽的二級(jí)質(zhì)譜和PEAKS Online 1.7軟件,從中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物中分別解析出聚合度2～16的多肽7 221條和7 062條。表1的多肽組成比較發(fā)現(xiàn),酶解產(chǎn)物中,四肽、五肽和六肽的數(shù)量占比較高,其中五肽數(shù)量為最多。木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中三肽和四肽的相對(duì)離子強(qiáng)度顯著高于中性蛋白酶酶解產(chǎn)物,分別是28.41%和26.90%;而二肽(相對(duì)離子強(qiáng)度為22.62%)、六肽及以上多肽的相對(duì)離子強(qiáng)度顯著低于中性蛋白酶酶解產(chǎn)物,說明木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中多肽的相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)更低。

表1 不同啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中多肽的組成

由表1可知,兩種酶解產(chǎn)物中共有肽為980條,其中97.35%為2～5肽。而中性蛋白酶酶解產(chǎn)物中特有肽6 241條,木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物中特有肽為6 082條,說明兩種不同蛋白酶降解產(chǎn)物的肽指紋譜圖有很大的差異。

此外,相較于傳統(tǒng)蛋白數(shù)據(jù)庫,PEAKS Online采用de novo測(cè)序,分析得到更多五肽及其以下寡肽,使其樣品中肽段數(shù)據(jù)更加全面,更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中生物活性肽的預(yù)測(cè)及篩選。

2.2 使用Peptide Ranker對(duì)啤酒酵母蛋白酶解物中生物活性肽的預(yù)測(cè)

Peptide Ranker是一個(gè)較為系統(tǒng)的肽數(shù)據(jù)庫,可以評(píng)價(jià)肽的生物活性概率。Peptide Ranker算法是基于支持向量機(jī)(support vector machine,SVM)的機(jī)器學(xué)習(xí)算法。該算法通過訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的肽序列和對(duì)應(yīng)的生物活性數(shù)據(jù),建立一個(gè)分類模型。該模型可以根據(jù)輸入的肽序列,預(yù)測(cè)其生物活性,并給出一個(gè)相應(yīng)的評(píng)分。使用Peptide Ranker數(shù)據(jù)庫對(duì)啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中所有多肽進(jìn)行了活性功能預(yù)測(cè),活性評(píng)分高于0.50則被標(biāo)記為具有生物活性。

木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中評(píng)分大于0.50的活性肽有3 095條,占總肽數(shù)目的43.83%,顯著高于中性蛋白酶酶解產(chǎn)物中活性肽數(shù)目(3 013條,占41.73%);其中兩種酶解產(chǎn)物的980條共有肽中,評(píng)分大于0.50的活性肽有521條,占比53.16%,說明啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中有大量的活性肽。表2列舉了不同酶解產(chǎn)物中評(píng)分較高的10條活性肽的氨基酸序列和質(zhì)譜解析結(jié)果。其中五肽FGFWF占多肽總離子強(qiáng)度的0.109 1%,其他活性肽的相對(duì)離子強(qiáng)度都低于0.1%,說明單條活性肽在酶解物中的相對(duì)離子強(qiáng)度都非常低。

表2 啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中評(píng)分最高的10條活性肽的質(zhì)譜解析結(jié)果

2.3 使用BIOPEP對(duì)啤酒酵母蛋白酶解物中生物活性肽的預(yù)測(cè)

使用BIOPEP對(duì)酶解產(chǎn)物中鑒定到的所有肽進(jìn)行活性驗(yàn)證,經(jīng)過對(duì)比分析得到不同酶解物中所含有的生物活性肽,來比較不同酶解產(chǎn)物中活性肽的區(qū)別。將PEAKS Online解析得到的啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物的所有多肽序列輸入BIOPEP數(shù)據(jù)庫,搜索已報(bào)道的活性肽。附表1為中性蛋白酶和木瓜蛋白酶中篩選出的所有活性肽的氨基酸序列。圖3為活性肽的數(shù)量和相對(duì)離子強(qiáng)度的比較。

圖3 啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中活性肽的數(shù)量和相對(duì)離子強(qiáng)度的比較

中性蛋白酶的酶解產(chǎn)物的7 221條多肽中,共發(fā)現(xiàn)295條活性肽段(占7 221條多肽總離子強(qiáng)度的58.88%),其中有107條為ACE抑制肽,占總肽離子強(qiáng)度的20.30%;90條二肽基肽酶Ⅳ抑制肽,占總肽離子強(qiáng)度的20.12%;40條抗氧化肽,占總肽離子強(qiáng)度的2.96%,17條二肽基肽酶Ⅲ抑制肽,占總肽離子強(qiáng)度的2.36%;8條腎素抑制肽,相對(duì)離子強(qiáng)度為2.11%。從木瓜蛋白酶的7 062條多肽中,共發(fā)現(xiàn)357條活性肽段,占7 062條多肽的總離子強(qiáng)度的48.41%,活性肽數(shù)量高于中性蛋白酶,但是活性肽的總含量低于中性蛋白酶產(chǎn)物。其中有134條多肽為ACE抑制肽,占總肽離子強(qiáng)度的15.89%。其次為101條二肽基肽酶Ⅳ抑制肽,占總肽離子強(qiáng)度的17.73%,48條抗氧化肽占總肽離子強(qiáng)度的3.02%,20條二肽基肽酶Ⅲ抑制肽占總肽離子強(qiáng)度的2.66%,9條腎素抑制肽占總肽離子強(qiáng)度的1.67%。比較發(fā)現(xiàn),活性肽在木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物中含量低于中性蛋白酶產(chǎn)物。酶解產(chǎn)物中少數(shù)活性肽有區(qū)別:中性蛋白酶酶解產(chǎn)物中有少量的抗病毒肽、抗糖尿病肽、α-淀粉酶抑制肽,而木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中有少量的阿片類肽、阿片類激動(dòng)肽和抗癌肽。

3 結(jié)論

本文以啤酒酵母粉為原料,利用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解制備酵母蛋白肽,基于UHPLC-HRMS分析和PEAKS Online 1.7計(jì)算,從中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物解析出聚合度2～16的多肽有7 221條和7 062條,其中共有肽980條,中性蛋白酶特有肽6 241條,木瓜蛋白酶特有肽6 082條,說明兩種酵母蛋白酶解產(chǎn)物的肽指紋譜圖有很大的差異。使用Peptide Ranker預(yù)測(cè)兩種酶解液中的活性肽,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物中分別有3 013條和3 095條肽為潛在的活性肽。搜索BIOPEP數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物中分別有295條和357條活性肽段,占總肽離子強(qiáng)度的58.88%和48.41%,其中ACE抑制肽和二肽基肽酶Ⅳ抑制肽為主要活性肽。比較發(fā)現(xiàn),木瓜蛋白酶產(chǎn)物中活性肽數(shù)量高于中性蛋白酶,但是活性肽的相對(duì)離子強(qiáng)度卻低于中性蛋白酶產(chǎn)物。不同蛋白酶生產(chǎn)的酵母蛋白肽產(chǎn)品的肽指紋譜圖和活性預(yù)測(cè)的比較,為篩選高活性酵母蛋白肽產(chǎn)品提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),有利于進(jìn)一步挖掘酵母蛋白肽中的活性肽。