王嚴嚴，蔣世云

1 廣西科技大學生物與化學工程學院 廣西柳州 545006

2 廣西科技大學醫(yī)學部 廣西柳州 545006

盆腔炎（pelvic inflammatory disease，PID）是臨床上常見的婦科疾病，其主要由微生物感染引起的炎癥反應，可導致不孕癥、異位妊娠和慢性盆腔疼痛等后遺癥，嚴重影響女性健康[1]。臨床上常采用廣譜抗生素治療，但是長期使用抗生素容易引起胃腸道反應、耐藥性等不良反應[2]。金雞膠囊（JinJi JiaoNang，JJJN）是在金雞沖服制劑的基礎上，更改技術工藝，是廣西靈峰藥業(yè)有限公司在國內首創(chuàng)研發(fā)出的婦科用藥。由于中藥制劑成分較多且復雜，金雞膠囊所起療效的主要活性成分和作用機制還不是十分清楚。故本文運用網絡藥理學和分子對接技術，通過構建金雞膠囊活性成分-作用靶點-通路網絡關系圖，得到關鍵活性成分和核心靶點，初步闡明金雞膠囊治療PID 的作用機制，為后續(xù)增強其療效提供一定的科學依據。

資料與方法

1 金雞膠囊活性成分和靶點的搜集與篩選

基 于 數 據 庫ETCM[3]、HERB[4]、TCMSP[5]和 文獻[6]搜集金雞膠囊6 味中藥所有化學成分。以OB ≥30%，DL ≥0.18[7]和Lipinski 規(guī)則[8]作為藥物活性成分的篩選條件建立金雞膠囊藥物活性小分子庫?；赑ubchem 數據庫[9]和SwissTargetPrediction數據庫[10]預測化合物作用靶點。

2 PID 疾病靶點的篩選

以關鍵詞“pelvic inflammatory disease”上傳至OMIM 數 據 庫（https：//www.omim.org/）、Genecards 數據庫（https：//www.genecards.org/）進行檢索，兩者合并去重復得到盆腔炎（PID）疾病作用靶點。

3 金雞膠囊治療PID 靶點蛋白相互作用分析

利用BioLadder 生物信息在線分析可視化云平臺（https：//www.bioladder.cn/web/#/pro/index） 分 析金雞膠囊化學成分作用靶點和PID 疾病作用靶點，得到交集靶點。利用String 數據庫（https：//www.string-db.org/）初步分析蛋白之間的相互作用，并運用Cytoscape 3.8.2 軟件對得到的tsv 格式進一步分析，結合Network Analyzer 分析得到的度值大小排序和插件Cytohubba 中的MCC 算法得到的分數排名較高的前30 位靶蛋白，取共同靶蛋白作為潛在的核心靶點進行后續(xù)的研究[11]。

4 核心靶蛋白的基因富集分析

運用Cytoscape 3.8.2 軟件中的插件ClueGo[12]和Metescape 數據庫[13]對核心靶點進行基因本體分析，物種選擇人類，P＜0.01，分析其主要的生物學過程和作用通路。通過構建金雞膠囊活性成分-核心靶點-關鍵通路圖，經Network Analyzer 分析后根據度值、介數中心性和緊密性＞中位數反推測出起主要作用的藥物成分和作用靶點，進一步從整體出發(fā)，探究金雞膠囊治療PID 的作用機制和活性成分。

5 分子對接研究

運用Autodock 4.0 軟件對篩選出的5 個關鍵活性物質和6 個核心靶蛋白進行對接，初步驗證網絡藥理學的準確性。利用Pubchem 數據庫[9]和OpenBabel軟件完成關鍵活性成分結構的下載和pdb 格式文件的轉換，作為小分子配體。利用PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）和Uniport 數據庫（https：//www.uniprot.org/）篩選并下載相應蛋白的晶體結構，作為分子對接的受體。使用AutoGrid 工具設置對接盒的參數，采用半柔性對接找到最佳對接條件，并記錄受體和配體的對接位置。將對接自由能絕對值＞8.0Kcal/mol 的作為優(yōu)勢構象[14]，利用Pymol 軟件和PLIP 數據庫[15]進行可視化繪制和分析。

結 果

1 金雞膠囊主要活性成分的篩選結果

結 合ETCM、HERB、TCMSP 數 據 庫 和 文 獻，共檢索出金雞膠囊化學成分有712 種。同時滿足OB ≥30%、DL ≥0.18 和類藥五原則（MW（g/mol）＜500、Hdon＜5、Hacc＜10、Rbon ≤10、ALogP＜5）共有46 種。其中穿心蓮9 種、功勞木7 種、雞血藤17 種、兩面針15 種、千斤拔3 種、金櫻根1 種，見圖1 和表1。

表1 金雞膠囊化學成分

圖1 金雞膠囊活性成分網絡關系

2 金雞膠囊化學成分作用靶點和PID 疾病靶點的篩選結果

經過SwissTargetPrediction 預測，得到金雞膠囊復方中穿心蓮、功勞木、雞血藤、兩面針、千斤拔和金櫻根作用靶點數目分別為282、284、368、376、81 和57，整理后得到金雞膠囊作用靶共618 個。對OMIM數據庫和Genecards 數據庫檢索得到PID 疾病靶點，經去重復處理后得到510 個。利用BioLadder 在線分析，得到金雞膠囊治療PID 的作用靶點89 個，見圖2。

圖2 金雞膠囊治療PID 交集靶點

3 金雞膠囊治療PID 靶蛋白相互作用分析結果

經String 數據庫對交集靶蛋白初步分析得到相互作用網絡關系圖，圖中共涉及78 個節(jié)點、245 條邊，見圖3。將tsv 格式上傳至Cytoscape 軟件，結合Network Analyzer 分析和MCC 算法運算結果，對排名前30 名靶蛋白取交集，得到26 個交集靶蛋白，作為后續(xù)研究的核心靶蛋白，具體拓撲參數見表2。

表2 金雞膠囊治療PID 核心靶蛋白網絡拓撲分析

圖3 金雞膠囊治療PID 蛋白相互作用分析

4 核心靶蛋白的GO、KEGG 分析結果

從整體看，經ClueGo 插件對核心靶蛋白分析得到主要生物學過程包括細胞增殖、細胞遷移和腺體發(fā)育、對活性氧的反應、一氧化氮合酶活性的調節(jié)等，見圖4。KEGG 分析得到132 條作用通路，除廣泛的癌癥信號通路外，主要涉及HIF-1 信號通路、PI3K-Akt信號通路、JAK-STAT 信號通路和C 型凝集素受體信號通路等炎癥信號通路。根據P＜0.01 和基因數量選擇前20 個作用通路做可視化分析，見圖5。

圖4 ClueGo 功能分析核心靶點生物學過程網絡關系

圖5 核心靶蛋白作用通路富集分析

5 金雞膠囊活性成分-核心靶點-關鍵通路的構建結果分析

利用Cytoscape 3.8.2 軟件繪制“金雞膠囊活性成分-核心靶點-關鍵通路圖”，經Network Analyzer 分析后得到89 個節(jié)點，269 條邊，活性成分的度值中位數為5.35135，靶蛋白度值中位數為15.07692。根據度值排序，金雞膠囊中前5 個化學成分14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內酯（JJJN3）、穿心蓮黃酮（JJJN5）、甘草查爾酮A（JJJN20）、遠志酮I（JJJN25）和千層紙素A（JJJN2）作為主要活性成分。6 個靶蛋白EGFR、PIK3CA、ESR1、AKT1、MTOR、MAPK1 作為最核心的靶點發(fā)揮作用，見表3。

表3 金雞膠囊主要活性成分和核心靶點拓撲參數

6 分子對接結果

利用Autodock 軟件將5 個關鍵化合物（14- 去氧-12-甲氧基穿心蓮內酯、穿心蓮黃酮、甘草查爾酮A、遠志酮I、千層紙素A）和6 個核心靶蛋白（EGFR、PIK3CA、ESR1、AKT1、MTOR、MAPK1）進行分子對接，對接結果以熱圖顯示，見圖6。從圖中可以看出，化合物與靶蛋白結合自由能均小于零，說明兩者可進行自由結合，且結合能值越低代表兩者結合越牢固，結合效果越好[17]。其中化合物14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內酯與靶蛋白ESR1 結合自由能值最小，為-9.65Kcal/mol，說明該化合物可能是通過靶蛋白ESR1 對PID 發(fā)揮治療作用。利用Pymol 軟件和PLIP數據庫分析優(yōu)勢構象之間的相互作用，見表4。

表4 優(yōu)勢構象對接結果

圖6 金雞膠囊中關鍵成分與核心靶點對接結果

討 論

金雞膠囊是婦科常用藥，臨床上常用于治療濕熱下注引起的PID 疾病。在該制劑中金櫻根能夠除濕熱、止帶，為君藥；雞血藤行血通絡，千斤拔利濕、消瘀、解毒，功勞木、穿心蓮清熱解毒，共為臣藥；兩面針行氣止痛、解毒消腫，為佐藥[18]。本研究對金雞膠囊治療PID 的主要活性成分和作用機制進行了初步預測和分析，其中化合物14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內酯、穿心蓮黃酮和千層紙素A 為穿心蓮化學成分，甘草查爾酮A 和遠志酮I 為雞血藤化學成分，這也正說明了君臣藥中所含有的化學成分可能在治療PID 的過程中起較大作用。靶蛋白EGFR、PIK3CA、ESR1 等6 個作用靶蛋白可能為主要的作用靶點，主要作用于HIF-1信號通路等炎癥信號通路發(fā)揮治療作用。

化合物14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內酯屬于半日花烷型二萜內酯類，該類化合物具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種藥理活性作用[19]。但是目前對此化合物的藥理活性研究暫未見相關報道。結合分子對接，發(fā)現該化合物與靶蛋白ESR1 結合自由能最小，后續(xù)可在確保藥物的安全性及可靠性的情況下，著重研究其藥理學活性和新型靶向制劑等。研究發(fā)現，穿心蓮黃酮能夠強抑制血小板聚集，具有活血化瘀的作用[20]。Li MT 等[21]通過整理甘草查爾酮A 的藥理活性，發(fā)現其具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗寄生蟲等多種藥理活性?；衔镞h志酮I 屬于氧雜蒽酮衍生物，研究發(fā)現，基于氧雜蒽酮為母體衍生出來的化合物，具有抗腫瘤、抗凝血、抗血小板、抗炎等多種藥理活性[22]。但是對于該化合物，是否具有抗炎、抗菌等功效還是有待驗證。研究發(fā)現，千層紙素A 可通過抑制NO 產生和COX-2 酶的表達發(fā)揮基礎抗炎作用，通過對血管舒張、抵抗血管脫落和抗血管增生發(fā)揮對血管組織和細胞的保護作用，此外還有可以保護神經細胞以及抗病毒作用[23]。

結合PPI 蛋白互作關系網絡圖篩選出6 個核心靶蛋白。其中靶蛋白EGFR 是一種酪氨酸激酶，參與細胞穩(wěn)態(tài)的調節(jié)，影響體內細胞發(fā)育過程，以及血管生成和腫瘤的發(fā)生[24]。靶蛋白PIK3CA、AKT1、MTOR可參與PI3K/AKT/MTOR 信號通路，該信號通路參與調控體內細胞過程，包括細胞生長、凋亡、分化和遷移等[25]。研究發(fā)現，甘草查爾酮A 可以激活該信號通路，抑制腎癌細胞的生長過程，包括細胞增殖、遷移和侵襲，并可以誘導腎癌細胞發(fā)生自噬[26]。靶蛋白ESR1為雌激素受體，當與雌激素配體結合后，可釋放疼痛因子和炎癥因子，可導致慢性PID 疼痛[27]。MAP 激酶可作為幾種生化信號通路的整合點，參與各種細胞過程，如細胞凋亡，炎癥和轉錄調節(jié)[28]。分子對接顯示六個核心靶蛋白與五個關鍵化合物都有一定的結合口袋，且結合自由能在-9.65Kcal/mol ～-5.56Kcal/mol。其中化合物14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內酯和甘草查爾酮 A 與靶點ESR1、AKT1 均具有較好的結合能力，能夠形成穩(wěn)定的復合結構，故推測這兩個靶點和化合物可能在金雞膠囊治療PID 過程中起主要作用。

GO 富集分析表明金雞膠囊治療PID 參與了細胞增殖、細胞遷移和腺體發(fā)育、對活性氧的反應以及一氧化氮合酶活性的調節(jié)等生物學過程。研究發(fā)現，低至中等活性氧的濃度可通過調節(jié)細胞信號級聯反應來發(fā)揮其作用，能夠對生長因子的刺激做出反應以及控制炎癥的發(fā)生[29]。NO 作為體內急性和慢性炎癥疾病的重要調節(jié)劑之一，調節(jié)一氧化氮合酶活性是生物體內非常重要的生物過程之一[30]。KEGG 富集分析表明金雞膠囊治療PID 的作用機制與HIF-1 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、JAK-STAT 信號通路、C 型凝集素受體信號通路等炎癥信號通路有關。結合文獻[31]可知，PID 現代發(fā)病機制與炎癥免疫反應、氧自由基、性激素、細胞凋亡機制和血液流變等有很大的關系。研究發(fā)現HIF-1 能夠參與自身免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展，比如類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和強直性脊柱炎等[32]。其中HIF-1α 是該信號通路中的關鍵靶基因，在缺氧狀態(tài)下能夠廣泛的存在機體內，研究發(fā)現該基因均可在免疫性炎癥疾病中、細菌性和病毒性感染和脂多糖誘導的巨噬細胞代謝等炎癥性疾病中檢測到[33]。PI3K-Akt 信號通路是體內重要通路之一，研究發(fā)現，通過下調PI3K-p110 蛋白水平的表達，可以降低PI3K-p85 和AKT 磷酸化水平，抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞中的PI3K-Akt 信號通路的活化，起到抗炎的作用[34]。JAK-STAT 信號通路是機體內非常重要的信號通路之一，在促炎細胞因子的產生中起著關鍵作用[35]。C 型凝集素受體（CLRs）是一大類蛋白質超家族，可以產生炎癥細胞因子和趨化因子，觸發(fā)對病原體的先天性和適應性免疫，從而起到抗真菌的作用[36]。

綜上所述，本研究通過運用網絡藥理學和分子對接技術對金雞膠囊治療PID 的活性成分和作用機制進行了預測，結果表明金雞膠囊通過作用于多靶點、多條通路治療PID，為金雞膠囊治療PID 作用機制提出了一定的參考依據。