沈惠芳，張婷，王國紅，田寶玉*

（細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點實驗室 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108）

德國小蠊屬蜚蠊目蜚蠊科小蠊屬昆蟲，是全球最嚴(yán)重的城市害蟲之一[1]，對公共衛(wèi)生安全危害極為嚴(yán)重，常在人類居住地中生活，藏匿于浴室、廁所和廚房，德國小蠊的糞便和脫落的身體部位是過敏原的來源，會引發(fā)敏感人群的哮喘癥狀、兒童哮喘和過敏反應(yīng)等[2]。目前，蟑螂種群的管控廣泛依賴于殺蟲劑的使用，但自20世紀(jì)50年代以來，殺蟲劑耐藥性一直是控制蟑螂的障礙。

研究表明飼喂抗生素會影響昆蟲的生長和健康。Chloe等[3]通過給黑腹果蠅喂食鏈霉素，結(jié)果表明與正常黑腹果蠅相比，喂食鏈霉素的個體需要更長的時間來發(fā)育并且體重更輕。Zhu等[4]通過研究土壤中存在的抗生素污染對土壤食物鏈的影響發(fā)現(xiàn)抗生素處理使土壤跳蟲體重的降低。Elena等[5]研究了抗生素甲氧芐啶對大型水蚤的寄主攝食的變化，結(jié)果表明受抗生素影響后水蚤的攝食和消化能力均下降。Raymann等[6]使用四環(huán)素喂食蜜蜂，研究發(fā)現(xiàn)喂食四環(huán)素影響了昆蟲的健康。長時間使用四環(huán)素等廣譜抗生素會對昆蟲腸道微生物群落造成強大的選擇壓力，殺滅腸道內(nèi)的敏感菌群，導(dǎo)致腸道微生物菌群多樣性的喪失[7]。Lisa等[8]研究表明四環(huán)素類藥物對特定微生物的選擇性殺傷將導(dǎo)致這些微生物從腸道微生物群中丟失。Lee等[9]用氨芐西林處理德國小蠊，結(jié)果顯示氨芐西林處理改變了德國小蠊腸道微生物群中的細(xì)菌組成。

腸道微生物可以幫助宿主降解有毒或有害物質(zhì)[10]，參與宿主對殺蟲劑的抗性[11-13]，對農(nóng)藥和農(nóng)藥抗性的進(jìn)化產(chǎn)生變化，做出反應(yīng)[12]，增加解毒酶的產(chǎn)生使有毒的物質(zhì)被分解等[14-15]。昆蟲體內(nèi)解毒酶包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase,GST）和磷酸酶（phosphatase）等。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是一種對殺蟲劑產(chǎn)生代謝抗性的重要酶系，參與許多分子的解毒機(jī)制，高水平的GST活性與昆蟲對殺蟲劑的高抗性有關(guān)[16]。昆蟲體內(nèi)的磷酸酶對有機(jī)磷農(nóng)藥也具有極強的水解作用[17]，昆蟲體內(nèi)的磷酸酶又分為酸性磷酸酶（Acid phosphatase,ACP）和堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP或AKP），它們在昆蟲機(jī)體的抗病性、解毒代謝和免疫防御過程發(fā)揮著重要功能[18-21]。

目前對于抗生素導(dǎo)致的昆蟲腸道微生物紊亂對宿主的影響主要集中在對宿主腸道微生物群本身的變化趨勢等方面，而對宿主生長和解毒酶活性方面的研究較少。不同的抗生素具有不同的殺菌譜，本研究選用廣譜類的四環(huán)素并結(jié)合臨床常用的氨芐西林為實驗材料，通過飼喂德國小蠊鹽酸四環(huán)素溶液以及氨芐西林鈉和四環(huán)素混合溶液擾亂德國小蠊腸道微生物生態(tài)，以探究抗生素脅迫下的腸道微生物群的改變對于德國小蠊體內(nèi)營養(yǎng)效應(yīng)和三種解毒酶活性的影響，為解析腸道微生物在昆蟲的營養(yǎng)利用和解毒機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

德國小蠊：由福建省疾病預(yù)防控制中心贈送。

1.2 儀器與試劑

總蛋白測定試劑盒、酸性磷酸酶測定試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；鹽酸四環(huán)素（Tetracyclin HCl）購于北京索萊寶（Solarbio）公司，氨芐西林鈉（Ampicillin Na）購于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.3 試蟲飼養(yǎng)

德國小蠊飼養(yǎng)在 260 mm×180 mm×140 mm 塑料盒中，塑料盒口內(nèi)壁沿邊緣涂抹一層寬約30 mm的凡士林和液體石蠟（1∶2，體積比）混合物以防止德國小蠊逃跑。盒中放置鼠糧和水作為德國小蠊的食物，兩個紙板卷。使用人工智能氣候箱飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為（27±1）℃，相對濕度（RH）40%～50%，光周期12L∶12D。

1.4 試驗設(shè)計

試驗設(shè)3個處理，試驗組飲用水為相對應(yīng)的抗生素溶液。

⑴ 四環(huán)素處理組（T）：0.5 mg/mL鹽酸四環(huán)素溶液；⑵ 抗生素混合處理組（AT）：0.5 mg/mL鹽酸四環(huán)素和氨芐西林鈉混合溶液（每mL溶液含0.25 mg鹽酸四環(huán)素+0.25 mg氨芐西林鈉）；⑶ 對照組（C）。每個處理組重復(fù)3次，共9個小組。

試驗前將德國小蠊進(jìn)行隨機(jī)分組，每個小組300只德國小蠊（不區(qū)分雌雄）。試驗組連續(xù)7 d使用抗生素溶液作為德國小蠊的飲用水；第8 d換成無菌水，無菌水喂養(yǎng)7 d后再將無菌水換成相對應(yīng)的抗生素溶液，以此類推進(jìn)行抗生素連續(xù)規(guī)律間隔處理6個月；對照組始終使用無菌水作為飲用水。

抗生素溶液的制備：分別制備10 mg/mL的鹽酸四環(huán)素溶液和氨芐西林溶液，過濾除菌后作為貯備液存于-20 ℃冰箱中備用，使用時將貯備液用無菌水稀釋至飼喂?jié)舛取?/p>

1.5 德國小蠊雄成蟲營養(yǎng)指標(biāo)測定

營養(yǎng)指標(biāo)測定試蟲準(zhǔn)備：抗生素連續(xù)間隔處理6個月后在每個小組中隨機(jī)取出5只羽化后一周的德國小蠊雄成蟲，分別將其單獨飼養(yǎng)于50 mm×36 mm×62 mm 的塑料盒中，飼喂鼠糧和無菌水，連續(xù)飼喂21 d后饑餓24 h。稱量飼喂前飼料重量，飼喂前和飼喂后雄成蟲鮮重。將雄蟲、雄蟲糞便和剩余餌料放入烘箱，60 ℃烘干至恒重。每個小組重復(fù)5次，每個處理組取樣數(shù)為3×5=15（只）。

不同抗生素處理組間雄成蟲干重參照Montandon[22]等的方法測定，依照下列公式計算各營養(yǎng)指標(biāo)[23]：

相對生長率（RGR）=G/(B×T)；

相對取食量（RCR）=I/(B×T)；

食物利用率（ECI）=G/I×100%；

食物轉(zhuǎn)化率（ECD）=G/(I-F)×100%；

近似消化率（AD）=(I-F)/I×100%；

增重率（WG）=（飼喂后鮮重-飼喂前鮮重）/飼喂前鮮重×100% 。

公式中：

G 為蟲體增重，G=飼喂后干重－飼喂前干重；

B 為試驗期間的平均體重，B=（飼喂前干重+飼喂后干重）/2；

I 為取食量，I=飼喂前食物干重-飼喂后食物干重；

F 為糞便干重；

T 為實驗天數(shù)。

1.6 酶源制備

將抗生素處理6個月后的德國小蠊雄成蟲饑餓24 h 后，取雄成蟲除去翅、足和頭部后一起稱重，按質(zhì)量（g）與提取液（mL）為1∶9的比例加入9倍體積預(yù)冷的PBS冰浴勻漿，4 ℃溫度下 8000 r/min離心10 min，取上清液作為酶源，測定時再稀釋。每個抗生素處理重復(fù)3次，每個小組取3只德國小蠊冰浴勻漿混為一個樣品。酶活測定按照試劑盒說明書進(jìn)行，總蛋白測定使用考馬斯亮藍(lán)法，試驗按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素處理對德國小蠊雄成蟲營養(yǎng)效應(yīng)的影響

2.1.1 不同抗生素處理對德國小蠊雄成蟲取食量和體重影響

由表1可知，四環(huán)素處理組的德國小蠊經(jīng)四環(huán)素處理后體重較對照組低，且差異顯著（p＜0.05），但與抗生素混合處理組（AT）無顯著差異（p＞0.05）。兩試驗組（T、AT）增重率與對照組（C）相比無顯著差異（p＞0.05）。對照組德國小蠊取食量為31.05 mg顯著高于四環(huán)素處理組（T）和抗生素混合處理組（AT）（p＜0.05）。

2.1.2不同抗生素處理對德國小蠊雄蟲的營養(yǎng)效應(yīng)

由表2可知，抗生素處理對德國小蠊雄成蟲的營養(yǎng)效應(yīng)與對照組相比差異顯著（p＞0.05），對照組雄成蟲的相對取食量顯著高于兩試驗組（T、AT）（p＞0.05），兩實驗組（T、AT）間相對取食量無顯著差異（p＞0.05）。對照組（C）的食物利用率達(dá)12.97% ，顯著高于四環(huán)素處理組（T）和抗生素混合處理組（AT）（p＞0.05），四環(huán)素處理組（T）和抗生素混合處理組（AT）的食物利用率分別為8.34%和6.90% ，兩組間無顯著差異（p＞0.05）。四環(huán)素組（T）的近似消化率達(dá)73.25% ，顯著高于對照組（C）（p＞0.05），與抗生素混合處理組（AT）無顯著差異。兩試驗組（T、AT）的相對生長量和食物轉(zhuǎn)化率與對照組（C）相比無顯著差異（p＞0.05）。

組別T AT C取食量（mg）22.64±3.89b 20.72±4.02b 31.05±5.20a初始濕重（mg）41.33±2.24a 43.47±4.17a 43.73±5.42a 21 d后濕重（mg）45.67±2.68b 47.47±3.99ab 49.53±5.72a濕重增重率(10.60±5.66)%a(9.43±4.94)%a(13.47±4.39)%a

2.2 抗生素處理對德國小蠊雄成蟲解毒酶活性的影響

2.2.1 處理后各組間德國小蠊雄成蟲體內(nèi) ACP的活力比較

由圖1可以看出四環(huán)素組（T）ACP活性最高，抗生素混合處理組（AT）ACP 活力最低。其中四環(huán)素組（T）的ACP活力為0.0066 金氏單位/gprot , 抗生素混合處理組（AT）ACP活力為0.0035金氏單位/gprot，對照組（C）ACP活力為0.0042金氏單位/gprot，但是三組間無顯著差異（p＞0.05）。

圖1 處理后各組ACP活力比較

2.2.2 處理后各組間德國小蠊雄成蟲體內(nèi) AKP的活力比較

由圖2可以看出四環(huán)素組（T）AKP活性最高，抗生素混合處理組（AT）AKP 活力最低。其中四環(huán)素組（T）的AKP活力為0.00047 金氏單位/gprot ,抗生素混合處理組（AT）AKP活力為0.000324金氏單位/gprot，對照組（C）AKP活力為0.00041金氏單位/gprot，但是三組間無顯著差異（p＞0.05）。

圖2 處理后各組AKP活力比較

2.2.3 處理后各組間德國小蠊體內(nèi) GST的活力比較

由圖3可以看出四環(huán)素組（T）GST活性最高，對照組GST 活力最低。其中四環(huán)素組（T）的GST活力為3.63金氏單位/gprot , 抗生素混合處理組（AT）GST活力為3.60金氏單位/gprot，對照組（C）GST活力為3.27金氏單位/gprot，三組間無顯著差異（p＞0.05）。

圖3 處理后各組GST活力比較

3 討論

腸道菌群在德國小蠊的營養(yǎng)代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，抗生素的使用會對腸道微生物群產(chǎn)生多種負(fù)面影響，包括物種多樣性降低、代謝活動改變和抗生素耐藥微生物的選擇，這反過來又將影響宿主的生長和營養(yǎng)代謝[24]。本研究試驗結(jié)果顯示抗生素的處理對德國小蠊雄成蟲的營養(yǎng)利用有顯著影響，其中四環(huán)素處理和抗生素混合處理顯著降低了德國小蠊雄成蟲的相對取食量（p＜0.05）和食物利用率（p＜0.05），顯著提高了四環(huán)素組的近似消化率（p＜0.05），顯著降低了四環(huán)素處理組的德國小蠊的體重（p＜0.05）。研究表明腸道微生物群會影響宿主飲食中的能量收集和能量儲存[25]，是宿主能量攝取和儲存的重要調(diào)節(jié)劑[26]。腸道微生物群可以通過調(diào)節(jié)宿主的多種內(nèi)分泌、神經(jīng)和免疫途徑來影響宿主的基本功能，包括消化、能量代謝等[27]。

先前研究表明腸道菌群在德國小蠊的代謝解毒機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，抗生素的處理將導(dǎo)致德國小蠊腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生變化，這種變化可能會對宿主的殺蟲劑耐藥性產(chǎn)生影響[28]。然而，關(guān)于腸道微生物如何影響德國小蠊解毒機(jī)制尚不清晰。本文通過實驗顯示抗生素處理后的德國小蠊體內(nèi)酸性磷酸酶、堿性磷酸酶以及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性與對照組相比沒有顯著性差異，結(jié)果表明德國小蠊腸道微生物的改變不會顯著影響宿主本身的解毒酶活性。當(dāng)然，抗生素處理后的宿主本身代謝活性的穩(wěn)定也很可能與抗生素間隔處理的方式和處理時間有關(guān)。有研究表明因抗生素處理導(dǎo)致的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及微生物種類、組成、豐度等的變化會在一定的時間內(nèi)在一定程度上有所恢復(fù)[29,30]。抗生素處理不顯著影響德國小蠊體內(nèi)解毒酶活性也可能是因為腸道微生物對宿主解毒機(jī)制的影響不是通過誘導(dǎo)體內(nèi)解毒酶活性，而是通過腸道微生物本身對殺蟲劑的解毒作用，降低了殺蟲劑的濃度和毒性[31-34]。

對于長期接觸抗生素對腸道微生物群所造成的生態(tài)后果，包括抗生素耐藥性等的了解仍然是有限的。在這里，我們研究了長期接觸單一種抗生素和多種抗生素混合對德國小蠊雄成蟲營養(yǎng)效應(yīng)指標(biāo)和解毒酶活性所造成的變化，發(fā)現(xiàn)腸道菌群生態(tài)紊亂降低了德國小蠊的體重和取食量，對德國小蠊的營養(yǎng)利用有顯著影響；而對德國小蠊解毒酶活性沒有顯著影響，且在長期的抗生素選擇壓力中，腸道微生物受單種抗生素和多種抗生素共同脅迫的后果對其解毒酶活性沒有顯著差異。本試驗為抗生素的使用和腸道微生物的功能提供科學(xué)思路。