侯 嶺

(烏魯木齊市米東區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，新疆 烏魯木齊 830000)

引言

明膠(gelatin，GE)是膠原蛋白的水解產(chǎn)物，是兩性物質(zhì)，同時(shí)含有-COOH和-NH32類基團(tuán)，具有乳化性。通過(guò)調(diào)節(jié)pH可以改變明膠的帶電性，且范圍廣。正是由于這種優(yōu)良的性質(zhì)，常被用作為復(fù)合凝聚法的壁材，可與不同種類的多糖物質(zhì)或其它相反電性的化合物形成復(fù)聚物。六偏磷酸鈉(Sodium metaphosphate，SHMP)，又稱“聚偏磷酸鈉”“格雷漢姆鹽”，為直鏈狀聚合化合物，其鏈長(zhǎng)至少為20～100個(gè)單位，在食品工業(yè)中用作品質(zhì)改良劑，也可作為鍋爐用水和工業(yè)用水的軟水劑，在醫(yī)藥、石油、造紙等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[1]。

不同壁材組合形成復(fù)聚物的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)存在區(qū)別。本文主要研究明膠與六偏磷酸鈉形成復(fù)聚物的條件，如壁材比、pH、壁材濃度，通過(guò)濁度、Zeta電位等手段進(jìn)行表征，并與常見(jiàn)的大分子壁材組合明膠-阿拉伯膠對(duì)比。復(fù)聚物的性質(zhì)與相應(yīng)微囊的制備有相關(guān)性，研究復(fù)聚物的性質(zhì)能為復(fù)合凝聚法制備微囊起到指導(dǎo)作用。

1 材料與設(shè)備

1.1 原料與試劑

明膠，化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；六偏磷酸鈉，分析純，阿拉??；阿拉伯膠，生物試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；醋酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

AL204萬(wàn)分之一電子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；HK-1D型恒溫水槽，南京大學(xué)應(yīng)用物理研究所；JJ-3數(shù)顯恒溫?cái)嚢杵?，金壇市科析儀器有限公司；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DM 1000生物顯微鏡，德國(guó)Leica公司；雷磁PHS-25 pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；DHC-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海圣欣科學(xué)儀器有限公司；其它玻璃儀器，北京欣維爾玻璃儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 反應(yīng)液的制備

分別配制1%的明膠、六偏磷酸鈉與阿拉伯膠溶液，以質(zhì)量濃度(W/V)濃度配制。具體配制方法：稱取1g明膠或阿拉伯膠，加入100mL去離子水于50℃水浴中加熱溶解1h；六偏磷酸鈉在常溫下配制即可，操作同上。

2.2 Zeta電位的測(cè)定

分別配制0.1%的明膠、六偏磷酸鈉與阿拉伯膠溶液，利用1%的醋酸溶液將各反應(yīng)液調(diào)到所需pH值，使用電位儀測(cè)量各個(gè)pH下的Zeta電位值，并繪制曲線。

2.3 復(fù)合凝聚反應(yīng)的濁度滴定曲線

配制明膠-六偏磷酸鈉混合反應(yīng)液(15∶1，W/W)，總濃度為0.1%。將反應(yīng)液置于50℃的恒溫水浴中，500rpm下攪拌，逐滴滴加醋酸溶液，調(diào)節(jié)不同的pH值，取樣于400nm下測(cè)量各個(gè)pH下的吸光度值，即為濁度值。配制明膠-阿拉伯膠混合反應(yīng)液(1∶1，W/W)，總濃度為0.1%，其它步驟同上，取樣于590nm下測(cè)量吸光度值。

2.4 明膠-六偏磷酸鈉復(fù)凝聚比例的確定

配制不同混合比例的明膠-六偏磷酸鈉的反應(yīng)液(GE/SHMP：45、40、35、30、25、20、15、10、5，W/W)，總濃度為0.1%。將反應(yīng)液置于50℃的恒溫水浴中，500rpm下攪拌，逐滴滴加醋酸溶液，調(diào)節(jié)不同的pH值(4.54、4.60、4.65、4.70、4.75)，取樣于400nm下測(cè)量各個(gè)pH下的吸光度值，通過(guò)濁度的大小確定形成復(fù)合凝聚物的最佳壁材比。

2.5 明膠-六偏磷酸鈉復(fù)凝聚濃度的確定

將不同濃度的明膠與六偏磷酸鈉反應(yīng)液(1%、1.5%、2%、3%、4%，W/W)混合，置于50℃的恒溫水浴中，500rpm下攪拌，逐滴緩慢加入10%醋酸溶液，待pH調(diào)節(jié)到特定值后，繼續(xù)反應(yīng)30min。冰浴，使溫度維持在15℃以下，繼續(xù)攪拌20min。冰浴結(jié)束后，用10%(W/V)NaOH溶液調(diào)節(jié)體系至堿性(pH=9～10)，隨后加入37%(W/V)甲醛進(jìn)行固化反應(yīng)1h。以復(fù)聚物的產(chǎn)率作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)確定復(fù)聚物形成的最佳濃度。

2.6 復(fù)聚物的形態(tài)觀察

用滴管取少量復(fù)聚物溶液置于載玻片上，蓋上蓋玻片，用生物顯微鏡觀察復(fù)聚物的形態(tài)，放大倍數(shù)為400倍，并拍照記錄。

2.7 復(fù)凝聚產(chǎn)率的測(cè)定

將復(fù)聚物溶液倒入離心管中，在3000rpm下離心30min，離心管底部的白色固體即為復(fù)聚物，用去離子水清洗復(fù)聚物3次。移去上清液，取出復(fù)聚物進(jìn)行冷凍干燥。

計(jì)算復(fù)聚物產(chǎn)率公式：

式中，Y為復(fù)聚物產(chǎn)率，%；m為干燥后復(fù)聚物的質(zhì)量，g；M為未反應(yīng)前明膠與六偏磷酸鈉的質(zhì)量之和，g。

3 結(jié)果與討論

復(fù)凝聚法是2種電性相反的物質(zhì)主要通過(guò)靜電相互作用結(jié)合形成不溶性復(fù)聚物。常見(jiàn)的發(fā)生復(fù)合凝聚的壁材組合均為大分子，如明膠-阿拉伯膠、殼聚糖-阿拉伯膠等。關(guān)于討論明膠-六偏磷酸鈉這類大分子與小分子組合形成復(fù)聚物的報(bào)道很少。將明膠-阿拉伯膠體系與明膠-六偏磷酸鈉體系進(jìn)行對(duì)比，能更深入、更透徹地了解復(fù)合凝聚的過(guò)程及復(fù)聚物的性質(zhì)。

3.1 體系帶電性質(zhì)的分析

復(fù)合凝聚法主要是由靜電相互作用驅(qū)動(dòng)，因此pH對(duì)復(fù)聚物的形成具有很大影響。明膠是兩性離子，帶電性由環(huán)境中的pH決定。六偏磷酸鈉在水中溶解度較大，在水中易電離，分子量為611.77。阿拉伯膠的成分較復(fù)雜，還含有少量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此，阿拉伯膠具有良好的乳化性。

明膠、阿拉伯膠與六偏磷酸鈉在不同pH下的電位圖見(jiàn)圖1。通過(guò)對(duì)壁材電位的考察，能快速確定體系發(fā)生復(fù)合凝聚的pH范圍，減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)。由圖1可知，明膠對(duì)pH敏感，表現(xiàn)在隨著pH的下降電位經(jīng)歷了由負(fù)向正的轉(zhuǎn)變。明膠分子的-COOH與-NH3在酸性或堿性環(huán)境中會(huì)發(fā)生電離，當(dāng)-COO-多于-NH3+時(shí)，溶液呈負(fù)電；當(dāng)COO-比-NH3+少時(shí)，溶液呈正電；當(dāng)兩者的量相等時(shí)，溶液呈電中性。根據(jù)這個(gè)性質(zhì)，可以得到明膠的等電點(diǎn)，即電位為零時(shí)所對(duì)應(yīng)的pH值。本實(shí)驗(yàn)所用的明膠等電點(diǎn)為5.10。

當(dāng)今社會(huì)的科學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，我們要充分利用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)，從實(shí)現(xiàn)最大限度防災(zāi)減災(zāi)的目的出發(fā)，建立合理的避險(xiǎn)系統(tǒng)，在地質(zhì)災(zāi)害發(fā)生時(shí)，及時(shí)的響應(yīng)，科學(xué)高效的進(jìn)行應(yīng)急處理，力求將災(zāi)害程度降到最小。

圖1 pH對(duì)明膠、阿拉伯膠及六偏磷酸鈉帶電性質(zhì)的影響

阿拉伯膠在較寬泛的范圍內(nèi)電位均為負(fù)，且隨著pH的下降，呈上升趨勢(shì)，在pH 3.50～5.50的區(qū)間，電位在-25～-15mV。六偏磷酸鈉不受pH的影響，電位在-40～-30mV波動(dòng)。

由此可確定，在pH<5.10的情況下均能發(fā)生復(fù)合凝聚。但pH<2.00時(shí)，阿拉伯膠的-COOH電離受到抑制，電位由負(fù)向正轉(zhuǎn)變[2]。因此，明膠-阿拉伯膠體系的復(fù)合凝聚發(fā)生范圍在pH2.00～5.10。

3.2 體系的濁度滴定曲線

復(fù)合凝聚反應(yīng)的過(guò)程中，溶液的pH會(huì)對(duì)壁材的帶電基團(tuán)有影響。隨著pH的變化，復(fù)聚物在溶液中經(jīng)歷多個(gè)階段的的變化，包括存在狀態(tài)、粒徑等，這些變化從外觀上可通過(guò)濁度體現(xiàn)。通過(guò)測(cè)量體系的濁度，可以從宏觀的角度對(duì)復(fù)合凝聚過(guò)程有進(jìn)一步了解。

明膠-六偏磷酸鈉體系在不同pH下的濁度滴定曲線見(jiàn)圖2。選取pH范圍為4.0～5.0，此時(shí)明膠帶正電，六偏磷酸鈉帶負(fù)電。由圖2可知，隨著pH的變化，濁度呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢(shì)。在pH5.0～4.8階段，濁度呈輕微的上升，此時(shí)明膠分子雖然帶正電，但帶電量極小，明膠與六偏磷酸鈉之間的靜電吸引力弱，沒(méi)有出現(xiàn)相分離現(xiàn)象，混合液外觀上透明、均一。這個(gè)階段形成的復(fù)聚物稱為可溶性復(fù)合物[3]。當(dāng)繼續(xù)滴加醋酸，從pH4.7開始體系的濁度快速增大，這是由于明膠的帶電量增加，增強(qiáng)了與六偏磷酸鈉之間的靜電相互作用。溶液由透明轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌该鞯娜榘咨?，靜置一段時(shí)間后溶液發(fā)生分層，上層澄清透明，下層為白色粘稠狀物質(zhì)。此階段形成的復(fù)聚物成為不可溶性復(fù)合物，在微囊上的應(yīng)用正是基于此階段。達(dá)到最大濁度點(diǎn)后，溶液的濁度開始下降，相比于濁度上升過(guò)程，濁度的下降過(guò)程顯得比較緩慢。溶液由渾濁再次轉(zhuǎn)變?yōu)橥该鳡顟B(tài)，表明不可溶性復(fù)合物逐漸解體，重新變?yōu)榭扇苄詮?fù)合物。

圖2 pH對(duì)明膠-六偏磷酸鈉體系濁度的影響

明膠-阿拉伯膠體系的濁度滴定曲線見(jiàn)圖3，同樣是出現(xiàn)了3個(gè)變化階段，變化過(guò)程與明膠-六偏磷酸鈉體系相同。pH4.8～4.5形成可溶性復(fù)合物，pH4.8～3.9形成不可溶性復(fù)合物，繼續(xù)降低pH，又變?yōu)榭扇苄詮?fù)合物。由于阿拉伯膠與六偏磷酸鈉在不同pH下的電位有差異，導(dǎo)致形成3個(gè)階段對(duì)應(yīng)的pH值不同。

圖3 pH對(duì)明膠-阿拉伯膠體系濁度的影響

3.3 復(fù)合凝聚物的形態(tài)

明膠與六偏磷酸鈉、明膠與阿拉伯膠形成的復(fù)聚物均為球形，從能量方面解釋，可能是為了降低體系的表面自由能所致。并不是所有體系形成的復(fù)聚物均為球形。張海洋等[4]在研究明膠-羧甲基纖維素體系時(shí)，發(fā)現(xiàn)明膠與羧甲基纖維素形成的復(fù)聚物呈長(zhǎng)條狀。

明膠-六偏磷酸鈉體系在不同pH下形成的復(fù)聚物的顯微鏡圖見(jiàn)圖4。pH為4.75、4.71處于可溶性復(fù)合物階段，在顯微鏡下觀察不到復(fù)聚物。pH4.65時(shí)，復(fù)聚物的粒徑較小，可能是此pH下明膠所帶的正電較少，與六偏磷酸鈉之間的靜電相互作用不強(qiáng)所致，且由于六偏磷酸鈉過(guò)量，形成的復(fù)聚物之間存在靜電排斥作用，阻礙復(fù)聚物聚集。pH4.60下的復(fù)聚物粒徑有所增大，且大小較均一，此時(shí)對(duì)應(yīng)的是濁度的最大值，表明明膠與六偏磷酸鈉之間的作用力已達(dá)最大。pH4.54時(shí)，復(fù)聚物的粒徑進(jìn)一步增大，此時(shí)的濁度值與pH4.60的濁度值相差不大。推測(cè)可能是六偏磷酸鈉的電位不隨pH變化，在pH4.60下明膠分子的有效位點(diǎn)與六偏磷酸鈉的結(jié)合達(dá)到飽和，而pH4.54下明膠的電位發(fā)生變化，導(dǎo)致明膠分子上有過(guò)量的帶電基團(tuán)，由于靜電排斥作用使得復(fù)聚物的結(jié)構(gòu)不如pH4.60下的緊湊，因此粒徑會(huì)略增大。但明膠的電位變化幅度較小，所以濁度變化并不明顯。當(dāng)pH降低到4.30時(shí)，溶液的粘度明顯變大，攪拌過(guò)程中出現(xiàn)大量泡沫，形成的復(fù)聚物粒徑繼續(xù)變大，且出現(xiàn)粘連，有不規(guī)則形狀出現(xiàn)。pH4.10時(shí)，可看到溶液中出現(xiàn)白色的絮狀物，顯微鏡下觀察到復(fù)聚物的粒徑不均一，存在粒徑小的復(fù)聚物，表明復(fù)聚物開始解體，由不可溶性復(fù)合物向可溶性復(fù)合物過(guò)渡。這與濁度滴定曲線的變化趨勢(shì)一致。

3.4 明膠與六偏磷酸鈉最佳比例的確定

本研究采用濁度法測(cè)量最佳壁材比。由圖5可知，不同pH下，相同壁材比對(duì)應(yīng)的濁度值不同。濁度曲線可分為2類，pH4.54、pH4.60、pH4.65下的濁度曲線趨勢(shì)相同，均為隨著壁材比的增大，濁度先增大后變??；pH4.70、pH4.75下的濁度曲線趨勢(shì)一致，先增大后平緩，下降趨勢(shì)不如第1類濁度曲線明顯，且濁度值小，在0.5以下。

圖5 混合比例對(duì)于明膠-六偏磷酸鈉體系濁度的影響

圖6 壁材比對(duì)明膠-六偏磷酸鈉體系最大濁度的影響

由第1類曲線可知，在相同pH條件下，隨著明膠用量的增加，濁度先增大后減小。當(dāng)明膠用量較小時(shí)，六偏磷酸鈉相對(duì)明膠過(guò)量，加入的明膠均能與六偏磷酸鈉通過(guò)靜電相互作用結(jié)合，使?jié)岫仍黾樱划?dāng)明膠的量達(dá)到某一個(gè)值，如圖5中GE/SHMP為15時(shí)，參與形成復(fù)聚物的明膠的量已達(dá)到飽和，此時(shí)對(duì)應(yīng)的濁度為最大值；繼續(xù)增加明膠的量，參與復(fù)合凝聚反應(yīng)的明膠過(guò)多，由于分子間的靜電排斥作用或空間位阻作用，使得復(fù)聚物的結(jié)構(gòu)變得松散，復(fù)聚物開始發(fā)生解體，表現(xiàn)為濁度值開始下降。而第2類曲線，在相同pH下，隨著明膠的量的增加，濁度上升的幅度不大，且出現(xiàn)平緩趨勢(shì)。濁度之所以出現(xiàn)上升趨勢(shì)，原因與第1類曲線相同，但由于pH 4.70、pH4.75接近于等電點(diǎn)明膠的電位較小，即使增加明膠的量，總體的正電荷增幅不大，六偏磷酸鈉相對(duì)于明膠仍處于過(guò)量狀態(tài)，因此濁度變化不大。

除此之外，隨著pH的減小，最大濁度值對(duì)應(yīng)的壁材比呈減小趨勢(shì)，即明膠的量減小。這是因?yàn)殡S著pH的減小，明膠分子的zeta電位增大，結(jié)合位點(diǎn)增多，而六偏磷酸鈉的量不變，因此，參與復(fù)合凝聚的明膠的量減小。

由圖5可知，當(dāng)pH為4.60，明膠/六偏磷酸鈉為15時(shí)濁度值最大。因此，可確定明膠與六偏磷酸鈉復(fù)合凝聚反應(yīng)最適宜的pH為4.60，最佳壁材比為15。

不同壁材比的最大濁度值對(duì)應(yīng)的pH不同。明膠/六偏磷酸鈉為5時(shí)，在pH4.55～4.75，其濁度值均小于0.2，表明兩者之間的相互作用極弱，可忽略不計(jì)。隨著明膠/六偏磷酸鈉比例的增加，不同壁材比對(duì)應(yīng)的最大濁度值呈先增加后減小趨勢(shì)，在壁材比為15時(shí)達(dá)最大。相應(yīng)的，兩壁材之間的相互作用隨著壁材比的增加而先增加后減小，表明增大明膠比例，不利于復(fù)聚物的形成。Ana S Prata等[5]也得出相似的結(jié)論。在明膠與阿拉伯膠的體系中，增加明膠的量有助于產(chǎn)率的提高，而增加阿拉伯膠的量導(dǎo)致產(chǎn)率下降。

3.5 明膠-六偏磷酸鈉復(fù)凝聚濃度的確定

明膠-六偏磷酸鈉在復(fù)凝聚反應(yīng)過(guò)程中的濃度是以復(fù)合凝聚物產(chǎn)率作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，在其它條件(pH、壁材比、溫度、反應(yīng)時(shí)間等)相同的情況下，復(fù)合凝聚物產(chǎn)率最高時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度即為最佳壁材濃度。在形成復(fù)聚物過(guò)程中，調(diào)節(jié)溶液至酸性至關(guān)重要，關(guān)系到能否形成復(fù)聚物。M Saravanan等[6]研究表明，酸的種類會(huì)影響復(fù)聚物的形成；以鹽酸、檸檬酸、硫酸、硝酸和醋酸作為果膠/海藻酸鈉-明膠體系的pH調(diào)節(jié)劑，發(fā)現(xiàn)這些酸都能誘導(dǎo)果膠-明膠體系形成復(fù)聚物，而只有醋酸才能引發(fā)海藻酸鈉-明膠體系發(fā)生凝聚現(xiàn)象，檸檬酸不能形成凝聚物，其余幾種酸使海藻酸鈉與明膠生成沉淀。

本研究選用醋酸作為pH調(diào)節(jié)劑，且將壁材混合后逐滴滴加醋酸調(diào)節(jié)pH。在此基礎(chǔ)上，選取了6種濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%)來(lái)探討濃度對(duì)復(fù)凝聚產(chǎn)物的影響。

由圖7可知，隨著壁材濃度的增大，復(fù)凝聚物產(chǎn)率先增大后減小，在濃度為3%時(shí)，產(chǎn)率達(dá)65.1%，與Wang等[7]研究結(jié)果一致。因此，明膠-六偏磷酸鈉復(fù)凝聚反應(yīng)最適宜的壁材濃度為3%。

圖7 壁材濃度對(duì)復(fù)聚物產(chǎn)率的影響

4 小結(jié)

復(fù)合凝聚反應(yīng)主要的驅(qū)動(dòng)力為靜電相互作用，通過(guò)分析體系的帶電情況確定復(fù)合凝聚反應(yīng)發(fā)生的pH范圍。明膠的等電點(diǎn)約為5.10。阿拉伯膠的帶電量會(huì)隨著pH的變化而變化，在pH>2.00時(shí)帶負(fù)電。而六偏磷酸鈉的帶電性質(zhì)與阿拉伯膠不同，其帶電量與pH無(wú)關(guān)。因此，明膠-六偏磷酸鈉體系形成復(fù)合凝聚物的pH范圍更廣。

明膠-阿拉伯膠體系與明膠-六偏磷酸鈉體系的濁度滴定曲線的變化趨勢(shì)一致。復(fù)合凝聚反應(yīng)過(guò)程均是隨著pH的減小，經(jīng)歷可溶性復(fù)合物-不可溶性復(fù)合物-可溶性復(fù)合物的過(guò)程。

通過(guò)對(duì)明膠-六偏磷酸鈉體系的pH、壁材比、壁材濃度進(jìn)行探討，得出復(fù)合凝聚的最佳條件：pH=4.60、壁材比為15、壁材濃度為3%，此條件下復(fù)合凝聚物的產(chǎn)率達(dá)65.10%。