湯墅 ,張坤賢 ,趙國艷 ,楊朝綱

1武漢大學(xué)中南醫(yī)院麻醉手術(shù)科 武漢市,430071 2武漢大學(xué)中南醫(yī)院胃腸外科&腫瘤生物學(xué)行為湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&湖北省腫瘤醫(yī)學(xué)臨床研究中心&武漢市腹膜癌臨床醫(yī)學(xué)研究中心 武漢市,430071

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康,是導(dǎo)致死亡的第二大原因。隨著手術(shù)、放化療、靶向治療以及免疫治療的不斷進(jìn)步,癌癥患者的治療效果已得到一定改善,然而復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致治療失敗的首要原因[1]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (circulating tumor cells,CTCs) 定義為從腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落入血的腫瘤細(xì)胞,被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的種子,與惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。目前,CTCs 檢測作為“液體活檢” 技術(shù)之一,已被應(yīng)用于臨床實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[3]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelialmesenchymal transition,EMT) 被認(rèn)為是增加上皮性腫瘤細(xì)胞活力和侵襲能力的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)因素[4],我們團(tuán)隊(duì)前期已證實(shí)EMT 在CTCs 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,CTCs 通過EMT 獲得間質(zhì)表型從而獲得生存優(yōu)勢并提高轉(zhuǎn)移能力[5]。既往的臨床研究表明,CTCs 可在抗腫瘤治療過程(包括化療、放療或分子靶向治療) 的不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)生EMT,從而增強(qiáng)其耐藥性,介導(dǎo)腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和患者的不良預(yù)后[6]。然而,目前關(guān)于間質(zhì)型CTCs 在結(jié)腸癌(colon cancer,CC) 中的臨床意義和預(yù)后價(jià)值仍不清楚?；诖?本研究擬采用團(tuán)隊(duì)前期自主研發(fā)的CTCBIOPSY?設(shè)備結(jié)合免疫熒光染色(immunofluorescence staining,IF) 檢測115 例CC 患者外周血中間質(zhì)型CTCs 的數(shù)目,并分析其與臨床病理因素和患者預(yù)后的關(guān)系,從而為CC 的臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 基本資料

選擇于2015 年1 月至2016 年6 月在我科住院治療的115 例CC 患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn): ①病理證實(shí)為結(jié)腸癌;②年齡＞18 歲;③臨床預(yù)后資料完整;④既往未接受任何抗腫瘤治療;⑤按照中國臨床腫瘤學(xué)會(CSCO) 結(jié)腸癌指南要求,需要接受輔助化療的患者均完成標(biāo)準(zhǔn)療程CAPEOX方案治療。排除標(biāo)準(zhǔn): ①合并其他器官或系統(tǒng)的惡性腫瘤;②合并嚴(yán)重心腦血管疾病;③合并認(rèn)知障礙或精神疾病。本研究獲得武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理號: 2022010K),所有患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 樣本采集與資料收集

入院后24 h 內(nèi),經(jīng)外周靜脈采集所有納入患者的外周血樣2.5 mL 于EDTA 抗凝管中(BD,美國),上下顛倒搖勻,送至實(shí)驗(yàn)室在半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理。從醫(yī)院的病歷信息系統(tǒng)中收集患者的基本資料、實(shí)驗(yàn)室檢查資料以及病理資料,包括年齡、性別、腫瘤標(biāo)志物水平、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期、脈管浸潤以及神經(jīng)侵犯等。

1.3 間質(zhì)表型CTCs 的分離與鑒定

CTCs 的分離與鑒定采用我們團(tuán)隊(duì)前期和武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司(武漢,中國) 合作研發(fā)的CTCBIOPSY?設(shè)備進(jìn)行,具體操作步驟和方法參考我們團(tuán)隊(duì)前期研究報(bào)道[7],簡而言之,將2.5 mL 血樣用含0.2 % 多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA) 的生理鹽水稀釋至8 mL,在室溫下靜置10 min,然后轉(zhuǎn)入底部裝有直徑8 μm 孔徑濾膜的ISET管中,通過12～20 mmHg 正壓過濾后,候選CTCs粘附在濾膜上,待三色免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。

免疫熒光染色具體操作按照我們之前的報(bào)道進(jìn)行[5]。簡而言之,將含有CTCs 的濾膜轉(zhuǎn)移到玻片上,4 % PFA 室溫固定5 min,用BD 洗滌緩沖液(BD,美國) 清洗濾膜3 次;在濾膜上加入100 μL Cytofix/ Permeabilization Kit (BD,美國),室溫孵育20 min,以便進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色;加入10 %山羊血清,室溫阻斷1 h;丟棄血清,加入FITC-CK小鼠一抗(1 ∶100;Abcam,美國),PE-Vimentin大鼠一抗(1∶100;Abcam,美國) 和AF647-CD45大鼠一抗體(1 ∶100;Santa,美國),4 ℃下孵育過夜;第二日,用BD 洗滌緩沖液清洗濾膜3 次后,分別加入Alexa Fluor 488 偶聯(lián)的羊抗鼠IgG 二抗(1∶100;Invitrogen,美國),Alexa Fluor 546 偶聯(lián)的羊抗兔IgG 二抗(1 ∶200;Invitrogen,美國)和Alexa Fluor 647 偶聯(lián)的羊抗兔IgG 二抗(1∶200;Invitrogen,美國),用Hoechst 33342 進(jìn)行細(xì)胞核染色(1∶500;Sigma,美國),室溫孵育1 h;用BD洗滌緩沖液洗滌3 次后,使用熒光顯微鏡(IX81;Olympus,日本) 對濾膜的CTCs 進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。其中,CK+/Vimentin-/CD45-/Hoechst+細(xì)胞定義為上皮表型 CTCs (ECTCs),CK-/Vimentin+/CD45-/Hoechst+細(xì)胞定義為間質(zhì)表型 CTCs(MCTCs),CK-/Vimentin-/CD45-/Hoechst+細(xì)胞定義為白細(xì)胞(WBC)。該設(shè)備的參考閾值為1 個(gè)CTC,即CTC 數(shù)目為0 定義為CTC 陰性,≥1 個(gè)為CTC 陽性。

1.4 輔助治療和隨訪

納入患者在接受根治性手術(shù)后,根據(jù)CSCO 結(jié)腸癌臨床管理指南,需要接受輔助治療的患者按照CAPEOX 方案(第1 天,奧沙利鉑130 mg/m2,靜脈輸注2 h;第1～14 天,卡培他濱片每次1 000 mg/m2,口服,每日2 次;每3 周重復(fù)) 進(jìn)行術(shù)后輔助化療?；颊叩碾S訪通過患者檔案、微信或者電話聯(lián)絡(luò)患者或其監(jiān)護(hù)人進(jìn)行,每3 個(gè)月隨訪一次,最后隨訪日期為2022 年12 月或死亡?？偵嫫?overall survival,OS) 定義為自患者確診至死亡或最后一次隨訪的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 (SPSS Institute,美國) 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)變量以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用Student’st檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析;采用Pearson χ2檢驗(yàn)分析CTCs 狀態(tài)與患者臨床病理特征的關(guān)系;采用Kaplan-Meier 結(jié)合Log-rank 檢驗(yàn)分析不同分組患者間OS 的累積概率及差異;采用單因素和Cox 多因素回歸分析分析探究影響CC 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素因素,并以95 %置信區(qū)間(confidence intervals,CIs) 估計(jì)相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio,HR)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同患者外周血中間質(zhì)表型CTCs 的比較

本研究總計(jì)納入115 例患者,基本特征詳見表1。其中,男性73 例、女性42 例;年齡38～74歲,平均年齡(58.6 ± 6.2) 歲;升結(jié)腸54 例,橫結(jié)腸16 例,降結(jié)腸10 例,乙狀結(jié)腸35 例;高分化42 例,中分化25 例,低分化48 例;TNM 分期Ⅰ期10 例,Ⅱ期62 例,Ⅲ期43 例。利用免疫熒光染色檢測患者外周血中上皮表型和間質(zhì)表型CTCs 數(shù)目,代表性圖片如圖1A 所示。進(jìn)一步分析表明,不同腫瘤位置患者外周血中的間質(zhì)表型CTCs 的數(shù)目無差異(圖1B);腫瘤低中分化患者外周血中間質(zhì)表型CTCs 的數(shù)目顯著多于高分化患者(圖1C);且Ⅲ期患者外周血中間質(zhì)表型CTCs的數(shù)目顯著高于Ⅱ期和Ⅰ期(圖1D)。

表1 結(jié)腸癌患者外周血中間質(zhì)表型CTCs 狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系(n=115)

2.2 間質(zhì)表型CTCs 狀態(tài)與患者臨床病理因素的關(guān)系

在納入的115 例患者中,間質(zhì)表型CTCs 陽性38 例,陰性77 例。

進(jìn)一步分析顯示,間質(zhì)表型CTCs 陽性與腫瘤分化程度 (P=0.013)、腫瘤浸潤深度 (P=0.010)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (P=0.043)、TNM 分期(P＜0.001)、脈管浸潤(P＜0.001)、神經(jīng)侵犯(P=0.004) 以及CEA 水平(P＜0.001) 相關(guān)。間質(zhì)表型CTCs 陽性與患者性別、年齡、腫瘤位置以及腫瘤直徑無關(guān)(P均＞0.05) (表1)。

2.3 外周血中CTCs 狀態(tài)與患者總生存期的相關(guān)性

上皮表型CTCs 陰性的患者其平均總生存期為(54.6 ±1.6) 月,5 年生存率為63 %,上皮表型CTCs 陽性患者平均總生存期為(46.9 ±1.4) 月,5 年生存率為44.3 %,上皮表型CTCs 陽性患者的總生存期顯著低于陰性者(χ2=4.142,P=0.042;圖2A)。

我們接著分析了不同間質(zhì)表型CTCs 狀態(tài)與患者總生存期的關(guān)系,結(jié)果顯示,間質(zhì)表型CTCs 陰性的患者的平均總生存期為(51.6 ±1.3) 月,5年生存率為57.1 %,而陽性患者的平均總生存期為(42.9 ±2.5) 月,5 年生存率為31.6 %,間質(zhì)表型CTCs 陽性患者的總生存期顯著低于陰性者(χ2=9.726,P=0.002;圖2B)。

2.4 結(jié)腸患總生存期危險(xiǎn)因素的單因素和多因素分析

單因素分析顯示,腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、脈管浸潤、神經(jīng)侵犯、CEA 水平、上皮表型CTCs 以及間質(zhì)表型CTCs 是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P均＜0.05)。

將上述因素納入多因素Cox 逐步回歸分析,結(jié)果顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=1.568,95 %CI:1.035～2.966,P=0.034)、TNM 分期 (HR=2.712,95 %CI: 1.135～3.796,P=0.004)、脈管浸潤 (HR=1.615,95 %CI: 1.243～2.654,P=0.025) 以及間質(zhì)表型CTCs 狀態(tài)(HR=1.752,95 %CI: 1.104～3.871,P=0.015) 是影響結(jié)腸癌患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表2)。

3 討論

結(jié)腸癌(CC) 作為常見的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率均位居所有惡性腫瘤前列,疾病負(fù)擔(dān)相當(dāng)嚴(yán)重[8]。肝臟和肺部是CC 常見的兩個(gè)轉(zhuǎn)移部位,既往研究表明,CC 的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是由脫落進(jìn)入血液循環(huán)的CTCs 所介導(dǎo)[9],因此,研究血液循環(huán)中CTCs 的特性有助于了解原發(fā)灶的病理特征以及早期監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。在本研究中,我們通過自主研發(fā)的CTCBIOPSY?設(shè)備結(jié)合IF 染色方法對115 例CC 患者外周血中的CTCs 亞型——間質(zhì)表型CTCs 進(jìn)行了檢測分析,結(jié)果表明,間質(zhì)表型CTCs 陽性與CC 患者的多種臨床病理因素密切相關(guān),且是影響患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,上述結(jié)果提示,檢測間質(zhì)表型CTCs 具有重要的臨床意義,有望成為CC 患者預(yù)后評估的新型生物標(biāo)志物。

EMT 的特點(diǎn)是上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間連接,獲得遷移表型且細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增加,EMT 已被證明在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。如今,越來越多的證據(jù)表明,EMT 廣泛參與了CTCs 的產(chǎn)生,同時(shí),進(jìn)入血液循環(huán)中的CTCs 在面對抗腫瘤治療時(shí)也可能發(fā)生EMT 變化,以抵抗外部干預(yù),從而在外周循環(huán)系統(tǒng)中存活并最終形成轉(zhuǎn)移灶[3,5～6,9]。從理論上講,腫瘤病灶每天可以釋放數(shù)千個(gè)CTCs 到血液循環(huán)中,但由于它們可能會遭遇強(qiáng)烈的抗癌治療,最終只有少數(shù)能夠存活下來。然而,在這些應(yīng)激刺激下,CTCs 可以通過EMT 改變形成間質(zhì)表型CTCs,其通過避免細(xì)胞凋亡和衰老以及促進(jìn)耐藥來維持其生存[6]。此外,EMT 的轉(zhuǎn)錄因子,如Snail,Slug,Twist 和SIP1 等,也可以通過干擾正常的凋亡級聯(lián)反應(yīng),抵抗衰老和/或與TrkB 合作來保護(hù)間質(zhì)表型CTCs 免受凋亡,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,從而影響患者預(yù)后[11～12]。因此,檢測患者外周血中間質(zhì)表型CTCs 可能更能反應(yīng)腫瘤的惡性特征,更好地指導(dǎo)患者的精準(zhǔn)分層和個(gè)體化治療。在本研究中,我們分析了CC 患者外周血中上皮表型和間質(zhì)表型兩種常見CTCs 亞型與患者預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果證實(shí),兩種亞型CTCs 陽性患者的總生存期均較陰性患者明顯縮短,然而在綜合其他臨床病理因素進(jìn)行多因素回歸分析后發(fā)現(xiàn),間質(zhì)表型CTCs 陽性是影響CC 患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素,而上皮表型CTCs 陽性則不是。這一結(jié)果也與既往研究結(jié)果相符,Zhang 等[13]通過基于CTCs尺寸的檢測平臺結(jié)合IF 染色探究了不同亞型CTCs在接受化療的晚期結(jié)直腸癌中的預(yù)后價(jià)值,結(jié)果發(fā)現(xiàn),間質(zhì)表型CTCs 陽性患者比陰性患者具有更短的疾病無進(jìn)展生存期和總生存期;Qi 等[14]利用CanPatrol CTCs 檢測技術(shù)結(jié)合RNA 原位雜交探究了肝細(xì)胞癌患者外周血中CTCs 的EMT 改變及其臨床意義,結(jié)果表明,手術(shù)前間質(zhì)表型CTCs 陽性患者更早發(fā)生局部復(fù)發(fā)、肝內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移以及肺轉(zhuǎn)移;另一研究團(tuán)隊(duì)也通過上述方法分析了腎癌患者外周血中不同亞型CTCs 的動(dòng)態(tài)變化,結(jié)果證明,腎癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移與總的CTCs 數(shù)目無顯著相關(guān),但與間質(zhì)表型CTCs 的數(shù)目有關(guān)[15]。這些研究提示,檢測腫瘤患者外周血中間質(zhì)表型CTCs 變化可能為我們提供更多關(guān)于腫瘤生物學(xué)特征以及轉(zhuǎn)移潛能的相關(guān)信息,有助于對患者治療的全程管理。然而,鑒于本研究納入病例較少,分析指標(biāo)相對有限,關(guān)于間質(zhì)表型CTCs 和上皮表型CTCs 的預(yù)后價(jià)值仍需要更大規(guī)模的臨床研究加以驗(yàn)證。

從上述的研究中我們可以看出,目前CTCs 的分離方法多種多樣,包括細(xì)胞學(xué)方法、基于PCR的方法、抗體依賴方法以及基于細(xì)胞尺寸的分離方法[3]。其中,CellSearchTM系統(tǒng)是第一個(gè)被FDA 批準(zhǔn)用于CTCs 臨床檢測的的平臺[16]。然而,作為一類EpCAM 抗體依賴的技術(shù),其已被證實(shí)了不能檢測出外周血中的間質(zhì)表型CTCs[17]。而基于CTCs尺寸差異的檢測方法正好可以克服這一缺點(diǎn),其可檢測所有亞型的CTCs,再通過細(xì)胞染色技術(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)分型,這些平臺包括ISET?、CanPatrolTM和Vitatex CAM 等[18]。在本研究中,我們使用了前期團(tuán)隊(duì)自主參與研發(fā)的基于細(xì)胞尺寸分離的CTCBIOPSY?設(shè)備,這一設(shè)備已在前期的研究中被證實(shí)具有較好的CTCs 檢測效率[7]且可以有效地檢測間質(zhì)表型的CTCs[13]。這也可以從一定程度上增加我們研究結(jié)果的可信度和說服力。盡管如此,本研究仍有以下缺點(diǎn): ①本研究為單中心回顧性研究,且納入樣本量小;②未對患者治療過程中間質(zhì)表型CTCs 的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)CC 患者外周血中間質(zhì)表型CTCs 與腫瘤的惡性進(jìn)展和患者的不良預(yù)后密切相關(guān),有望成為臨床預(yù)后評估的新型生物標(biāo)志物。然而,此結(jié)果需要大規(guī)模多中心隨機(jī)對照的前瞻性研究去加以證實(shí)。