徐秀連,謝平,印隆寬,袁華燕,劉建軍,王攀

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外一科 四川省南充市,637000

胃癌(gastric carcinoma,GC) 是全球最常見的癌癥之一,死亡率高,是癌癥死亡的第三大原因[1]。雖然化療和靶向治療使部分患者受益,但腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移仍然是治療和預(yù)后的主要障礙。近年來(lái),越來(lái)越多的人認(rèn)識(shí)到腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是由腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的雙向交流而不是由腫瘤細(xì)胞單獨(dú)介導(dǎo)[2]。與腫瘤細(xì)胞不同,腫瘤微環(huán)境內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞在基因上是穩(wěn)定的,這使它們成為更有吸引力的癌癥治療靶點(diǎn)。癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs) 是腫瘤微環(huán)境中最重要的基質(zhì)細(xì)胞類型之一,被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展的共謀者[3-4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明CAFs 有助于GC 的發(fā)展[5],在GC 細(xì)胞的遷移和侵襲中起著至關(guān)重要的作用[6]。然而,CAFs 對(duì)GC 細(xì)胞的促腫瘤作用機(jī)制尚不清楚。

外泌體(exosome) 是分泌的膜囊泡,與腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)相關(guān)[7]。CAFs 釋放的exosome 可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境,特別是exosome 包裹的microRNAs(miRNAs)[8]。miRNA 是一種小的非編碼RNA,通過(guò)抑制其靶mRNA 的翻譯發(fā)揮癌基因或抗癌基因的功能。miRNAs 的失調(diào)在癌細(xì)胞和CAFs 之間的腫瘤與基質(zhì)相互作用是至關(guān)重要的[9-10]。然而,miRNAs 在胃癌CAFs 中的確切功能尚不十分清楚。本研究旨在探究CAFs 來(lái)源的外泌體miR-34c-5p 是否參與GC 細(xì)胞干樣特性,包括增殖、侵襲、成球形成和干性基因的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH) 試劑盒購(gòu)自廣州RiboBio 公司;結(jié)晶紫、聚凝胺和嘌呤霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;抗CD9、抗 TSG101、抗 Calnexin、抗 SOX2、抗OCT4、抗NANOG 和抗β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。

1.2 倫理聲明

所有臨床樣本均來(lái)自既往未接受放療或新輔助化療的胃癌患者。本研究獲得了倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),并取得所有參與者的書面知情同意書。所有實(shí)驗(yàn)方法均按照《赫爾辛基宣言》 進(jìn)行。

1.3 癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的分離

原代正常成纖維細(xì)胞 (normol fibroblasts,NFs) 和CAFs 群從同一患者的胃組織的正常區(qū)(距離腫瘤區(qū)超過(guò)5 cm) 和腫瘤區(qū)(腫瘤邊界內(nèi)的組織) 分離[11],然后用光學(xué)顯微鏡捕獲NFs 或CAFs 的形態(tài)。所有患者均未接受術(shù)前放療或化療。用于體外研究的所有成纖維細(xì)胞均為3～10 代。NFs 或CAFs 在37 ℃含有10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞孵育至70 %～90 %匯合,用磷酸鹽緩沖鹽水 (phosphate buffered saline,PBS) 洗滌3 次,在無(wú)血清培養(yǎng)基中再培養(yǎng)48 h 以制備條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM)。CM 3 000 r/min 離心10 min 以除去細(xì)胞碎片,并儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)

用4 %多聚甲醛固定NFs 和CAFs 20 min,并用0.1 % Triton X-100 滲透30 min。在3 %山羊血清中封閉,與抗α-肌動(dòng)蛋白(α-SMA,稀釋比1∶1 000) 和成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP,稀釋比1∶1 000) 在4 ℃下孵育過(guò)夜。將細(xì)胞與辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 結(jié)合的二抗(1∶500) 在室溫下孵育1 h,然后將細(xì)胞用二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 染色5 min。

1.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

用4 %多聚甲醛固定NFs 和CAFs 20 min,并用0.1 % Triton X-100 滲透30 min。在3 %山羊血清中封閉,與抗波形蛋白(vimentin,稀釋比1∶1 000) 在4 ℃下孵育過(guò)夜。將細(xì)胞與熒光Alexa Fluor 48 結(jié)合的二抗(1∶500) 在室溫下避光孵育1 h。用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI,1 ∶300,美國(guó)Invitrogen 公司) 檢測(cè)細(xì)胞核。最后,用熒光顯微鏡獲取細(xì)胞圖片。

1.6 外泌體的分離和鑒定

NFs 或CAFs 在37 ℃含有10 %胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng),直到約80 %融合。然后,用不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h 以制備CM。CM 上清液以300 r/min 離心10 min,以2 000 r/min 離心10 min,以10 000 r/min 離心30 min。收集沉淀并用滅菌磷酸緩沖液(phosphate buffer solution,PBS) 洗滌,再次以10 000 r/min 離心70 min,并將最終顆粒重新溶于PBS 中。用2.5 %戊二醛處理exosome,將其加載到碳涂層銅網(wǎng)格上,然后用1 %磷鎢酸對(duì)網(wǎng)格進(jìn)行染色。用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM) 檢查樣品的形態(tài)。使用ZetaView 納米顆粒跟蹤分析儀測(cè)定外泌體的尺寸。指定時(shí)間內(nèi)用CAFs-exo 或NFs-exo (50 μg/mL)處理MGC-803 和SGC-7901 細(xì)胞。

1.7 外泌體小RNA 測(cè)序

用TRIzol 試劑(美國(guó)Invitrogen 公司) 從NFs外泌體和CAFs 外泌體中提取高質(zhì)量總RNA。文庫(kù)構(gòu)建、miRNA 測(cè)序和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析由上海CloudSeq Biotech 公司完成。RNA 含量和純度通過(guò)超微量分光光度計(jì)NanoDrop ND-100 (美國(guó)Thermo公司) 分析。僅選擇長(zhǎng)度為20～22 nt 的小RNA 來(lái)制備文庫(kù)和PCR 擴(kuò)增。選擇標(biāo)準(zhǔn)為|Log2 FC | ＞1,P＜0.05。

1.8 透射電鏡術(shù)

將外泌體滴到銅網(wǎng)格上,并用2 %磷鎢酸進(jìn)行2 min 的負(fù)染色?？諝飧稍锖?使用FEI Tecnai G2 Spirit 透射電子顯微鏡(美國(guó)Thermo 公司) 在80 kV 下觀察樣品。

1.9 熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)制造商提供的說(shuō)明,使用熒光原位雜交試劑盒檢測(cè)miR-34c-5p 的表達(dá)。用4 %甲醛固定10 min,并在4 ℃下在5 %Triton X-100 中滲透5 min。用PBS 沖洗3 次,37 ℃下在RNA-FISH 雜交系統(tǒng)(北京諾為生物公司) 中預(yù)雜交30 min,然后用抗-miR-34c-5pa 寡核苷酸探針?lè)跤^(guò)夜,同時(shí)保護(hù)其不受光照。最后,用DAPI 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染,并用共焦激光掃描顯微鏡成像。

1.10 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

胃癌細(xì)胞系 (MGC-803 和SGC-7901) 購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司。在37 ℃和5 % CO2條件下,在含有1 %青霉素/鏈霉素和10 % FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。使用Lipofectamine 2000 試劑(美國(guó)Invitrogen 公司) 將miR-34c-5p 表達(dá)載體和慢病毒質(zhì)?；旌衔?上海生工生物公司) 共轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后,收集含病毒的上清液并過(guò)濾,然后將上清液用無(wú)血清DMEM 稀釋2 倍,并加入聚凝胺(5 μg/mL)。將混合溶液添加到CAFs 中,并在與新鮮培養(yǎng)基交換之前孵育24 h。用嘌呤霉素(10 μg/mL) 選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CAFs。

1.11 菌落形成試驗(yàn)

轉(zhuǎn)染24 h 后,將細(xì)胞接種到含有2 mL 完全培養(yǎng)基,0.6 %瓊脂(美國(guó)Gibco 公司) 的6 孔板(500 個(gè)細(xì)胞/孔) 中,并在37 ℃5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 周。當(dāng)克隆肉眼可見時(shí),終止培養(yǎng)并移除培養(yǎng)基。PBS 中漂洗2 次,然后用1.5 mL 甲醛固定15 min,并在黑暗中用1 %結(jié)晶紫溶液染色20 min,在顯微鏡下檢查菌落(超過(guò)50 個(gè)細(xì)胞) 并拍照。

1.12 Transwell 實(shí)驗(yàn)

將相同數(shù)量的MGC-803 和SGC-7901 細(xì)胞懸浮在200 μL 無(wú)血清DMEM 中,并接種在涂有matrigel (美國(guó)康寧公司) transwell 小室上室中。下室含有600 μL DMEM。將3 種不同的外泌體(exomiR-34c-5p、exo-miR NC 和exo 對(duì)照) 添加到上室并孵育24 h,然后用棉簽去除上室上表面的細(xì)胞。通過(guò)基質(zhì)凝膠遷移到上室下表面的細(xì)胞用甲醇固定15 min,用0.1 %結(jié)晶紫染色15 min,并用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)。

1.13 細(xì)胞成球形成實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染3 種不同的外泌體(exo-miR-34c-5p、exo-miR NC 和exo 對(duì)照) 的MGC-803 和SGC-7901細(xì)胞孵育在含有4 ng/mL 胰島素(美國(guó)Sigma 公司)、2 % B27 (美國(guó)Thermo Fisher 公司)、20 ng/mL EGF (美國(guó)Sigma 公司),10 ng/mL FGF (美國(guó)Sigma 公司) 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后,在光鏡下計(jì)數(shù)3 組細(xì)胞形成的球體(大于20個(gè)細(xì)胞)。

1.14 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting,WB)

用RIPA 裂解緩沖液在4 ℃下提取細(xì)胞總蛋白,使用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳,然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用含5 %脫脂牛奶的TBST 封閉膜1 h 后,用稀釋的一抗CD9 (1∶600)、TSG101 (1 ∶600)、Calnexin (1 ∶1 200)、SOX2(1∶1 500)、OCT4 (1 ∶1 000)、NANOG (1 ∶500)和β-actin (1∶1 000) 于4 ℃孵育過(guò)夜。然后,將膜與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗(1∶1 000) 于37 ℃孵育2 h,并使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑ECL 顯示條帶,用Image J 定量蛋白灰度值。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GC 患者成纖維細(xì)胞特征

首先,我們分別從同一患者的正常區(qū)和腫瘤區(qū)分離出NFs 和CAFs。顯微鏡下NFs 和CAFs 均呈長(zhǎng)紡錘形形態(tài),但CAFs 比NFs 略圓潤(rùn)。與NFs 比較,2 種CAF 特異性生物標(biāo)志物α-SMA 和FAP 在CAFs 中過(guò)表達(dá)。原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞群NFs 和CAFs 的間充質(zhì)標(biāo)記物Vimentin 均呈強(qiáng)陽(yáng)性,表明成纖維細(xì)胞群成功分離(圖1)。

圖1 GC 患者成纖維細(xì)胞特征

2.2 GC 患者成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體特征

然后,我們從NFs-exo 和CAFs-exo 的上清液中分離外泌體,并通過(guò)TEM、納米顆粒跟蹤分析(NTA) 和蛋白質(zhì)印跡法對(duì)分離出的囊泡進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,這些囊泡直徑(125 ±50) nm,圓形和杯狀。與胞外囊泡比較,外泌體標(biāo)記物CD9和TSG101 高表達(dá),外泌體陰性標(biāo)記物Calnexin 陰性表達(dá),表明分離的囊泡是外泌體(圖2)。

圖2 GC 患者CAFs 外泌體的分離

2.3 miR-34c-5p 在CAF 衍生的外泌體中下調(diào)

與NFs-exo 比較,miR-34c-5p 在CAFs-exo 中顯著降低(P＜0.05)。與正常癌旁胃組織比較,miR-34c-5p 在GC 患者組織樣本中表達(dá)下調(diào)(P＜0.05),表明CAFs-exo 表現(xiàn)出miR-34c-5p 下調(diào)。因此,選擇miR-34c-5p 作為本研究的目標(biāo)基因(圖3)。

圖3 CAFs 來(lái)源的外泌體顯示miR-34c-5p 下調(diào)

2.4 外泌體miR-34c-5p 抑制了GC 細(xì)胞的增殖和侵襲能力

與CAFs-exo 組比較,CAFs-exo miR-34c-5p 組miR-34c-5p 在MGC-803 和SGC-7901 細(xì)胞中表達(dá)升高,表明miR-34c-5p 成功從CAFs 外泌體轉(zhuǎn)染到GC 細(xì)胞中 (P＜0.05)。與CAFs-exo 組比較,CAFs-exo miR-34c-5p 組的細(xì)胞表現(xiàn)出最低的增殖能力(P＜0.05)。與CAFs-exo 組比較,CAFs-exo miR-34c-5p 組的細(xì)胞表現(xiàn)出最弱的侵襲能力(P＜0.05),表明miR-34c-5p 可抑制GC 細(xì)胞的增殖和侵襲性(圖4)。

圖4 外泌體miR-34c-5p 對(duì)GC 細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

2.5 外泌體miR-34c-5p 抑制了GC 細(xì)胞成球能力

與CAFs-exo 組比較,CAFs-exo miR-34c-5p 組培養(yǎng)的癌細(xì)胞形成的球體數(shù)最少,球體體積最小(P＜0.05)。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)細(xì)胞干性標(biāo)志基因的蛋白表達(dá)。與CAFs-exo 組比較,CAFs-exo miR-34c-5p 組SOX2、OCT4 和NANOG 蛋白表達(dá)降低(P＜0.05),表明miR-34c-5p 抑制GC 細(xì)胞成球(圖5)。

3 討論

近幾十年來(lái),微環(huán)境在癌癥進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療中的作用越來(lái)越受到關(guān)注[2,12]。CAFs 已成為基質(zhì)細(xì)胞中的關(guān)鍵角色,因?yàn)樗鼈冊(cè)诖蠖鄶?shù)實(shí)體瘤中大量存在,并具有多種腫瘤抑制/促進(jìn)作用[10,13]。本研究中,我們成功分離了胃癌患者源性CAFs。CAFs 和癌細(xì)胞可以通過(guò)經(jīng)典的旁分泌(細(xì)胞因子、趨化因子) 信號(hào)機(jī)制[14],也可以通過(guò)外泌體進(jìn)行交流[7,15]。外泌體是內(nèi)泌體衍生的微泡,包含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸 (如miRNA 和LncRNA)[16]。作為外泌體的主要RNA 成分,miRNA 在幾種類型的癌癥中表達(dá)失調(diào)[9-11],并調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。本研究中,我們通過(guò)外泌體分離試劑從CAFs 和NFs 中分離出外泌體,并通過(guò)TEM 和NTA 鑒定外泌體形態(tài)和大小。此外,WB 顯示CD9 和TSG101陽(yáng)性表達(dá),calnexin 無(wú)表達(dá),這些結(jié)果表明我們分離的顆粒是合格的外泌體。

據(jù)報(bào)道,CAFs 中一些關(guān)鍵miRNAs 的丟失可能對(duì)癌細(xì)胞有顯著的致瘤性影響[17]。本研究中,CAFs 中外泌體miR-34c-5p 的缺失是我們研究中的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)。此外,與鄰近正常組織比較,GC組織中miR-34c-5p 的表達(dá)也較低。先前的研究表明,miR-34c-5p 在宮頸癌細(xì)胞組織中下調(diào),并抑制宮頸癌的轉(zhuǎn)移和侵襲[18]。相反,miR-34c-5p 在鼻咽癌組織中下調(diào),并通過(guò)靶向NOTCH1 顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和遷移[19]。目前,miR-34c-5p 是GC 中研究較少的miRNA,盡管WU 等[20]提出miR-34c-5p 的過(guò)度表達(dá)顯著下調(diào)MAPT 蛋白表達(dá),并增加紫杉醇耐藥GC 細(xì)胞的化學(xué)敏感性,但miR-34c-5p 在GC 中所起的作用及其潛在機(jī)制尚未闡明。本研究中,與腫瘤實(shí)質(zhì)中檢測(cè)到的水平比較,miR-34c-5p 在基質(zhì)中顯著低表達(dá)。通過(guò)將GC 細(xì)胞與從患者源性CAFs 分離的外泌體孵育,我們用慢病毒載體建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的高表達(dá)miR-34c-5p,證實(shí)miR-34c-5p 被轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞,并在體外抑制其增殖和轉(zhuǎn)移。

此外,在成球形成實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)與CAFsexo 組比較,CAFs-exo miR-34c-5p 組培養(yǎng)的癌細(xì)胞形成了更少的球體。一些轉(zhuǎn)錄因子,如OCT4、SOX2 和NANOG,可能參與了腫瘤干細(xì)胞樣表型的維持[21]。本研究中,與CAFs-exo 組比較,在使用exo-miR-34c-5p 培養(yǎng)的癌細(xì)胞中,這3 個(gè)基因的蛋白表達(dá)顯著降低,表明CAFs 外泌體衍生的miR-34c-5p 過(guò)度表達(dá)可以顯著降低這些干性基因的表達(dá)。

綜上所述,本研究證實(shí)外泌體miR-34c-5p 缺失是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn),這有助于維護(hù)GC 細(xì)胞的生物學(xué)特性,包括增殖能力、侵襲、成球形成,以及干細(xì)胞樣基因的表達(dá),表明細(xì)胞外泌體miR-34c-5p對(duì)GC 治療具有潛在價(jià)值。