杜娜 ,段少瓊 ,宋波 ,李開林 ,顏悅?cè)?,劉悅

1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院 隨州市中心醫(yī)院感染科 湖北省隨州市,441300 2湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院襄陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 湖北省襄陽市,441021

肝葉切除術(shù)、肝移植術(shù)等過程中常發(fā)生肝臟缺血再灌注損傷,從而造成患者死亡。庫普弗細(xì)胞(kupffer cells,KCs) 屬于巨噬細(xì)胞,KCs 過度活化可促進(jìn)氧自由基和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而誘發(fā)肝臟缺血再灌注損傷,因而控制KCs 過度活化對減輕肝臟缺血再灌注損傷具有重要意義[1-2]。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,LncRNA) 是一種長度超過200 nt 的內(nèi)源性非編碼RNA 分子,富含微小RNA (miRNA) 的反應(yīng)元件,可充當(dāng)miRNA 的競爭性內(nèi)源RNA (competing endogenous RNA,ceRNA) 參與肝臟缺血再灌注損傷過程[3-4]。有報道指出LncRNA 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(lung adenocarcinoma metastasis-associated transcript 1,MALAT1) 在氧糖剝奪后再復(fù)糖復(fù)氧(oxygenglucose deprivation and reoxygenation,OGD/R) 誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12 損傷中表達(dá)升高,下調(diào)其表達(dá)可減輕OGD/R 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷[5]。但LncRNA MALAT1 與肝臟缺血-再灌注損傷相關(guān)性研究尚未見報道。研究表明miR-181d-5p 在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 損傷中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞炎性損傷[6]。StarBase 預(yù)測顯示LncRNA MALAT1 與miR-181d-5p 存在結(jié)合位點,但LncRNA MALAT1/miR-181d-5p 分子軸在肝臟缺血-再灌注損傷中發(fā)揮的功能及機制尚未明確。因此,本研究選取由SD 大鼠肝組織獲得的KCs 細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞實驗,探討LncRNA MALAT1 是否可通過靶向調(diào)控miR-181d-5p 表達(dá)而影響脂多糖(lipopolysacharide,LPS) 誘導(dǎo)的KCs 存活和炎性因子表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 只SD 大鼠,6～8 周,體質(zhì)量200～250 g,購自北京凌云博際科技有限公司,動物許可證號:SCXK (京) 2019-0018。

DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶購自上海碧云天生物;LPS 購自美國Sigma;巨噬細(xì)胞特異性抗體購自瑞士羅氏公司;白細(xì)胞介素(interleukin,IL) -6、IL-12、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α) 檢測試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?Trizol 試劑、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen;miRNA 提取試劑盒及其專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒、普通反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購自北京天根生化;小干擾RNA 陰性對照(si-NC)、MALAT1 小干擾RNA (si-MALAT1)、模擬物陰性對照 (miR-NC)、miR-181d-5p 模擬物(miR-181d-5p mimics)、過表達(dá)空載 (pcDNA)、MALAT1 過表達(dá)載體(pcDNA-MALAT1)、抑制劑陰性對照 (anti-miR-NC)、miR-181d-5p 抑制劑(anti-miR-181d-5p) 購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;雙熒光素酶報告基因載體及其活性檢測試劑盒購自美國Promega。

1.2 分離培養(yǎng)庫普弗細(xì)胞[7]

SD 大鼠禁食12 h 后用濃度為30 mg/kg 的1 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,剖腹,露出門靜脈,分離結(jié)扎肝門靜脈與下腔靜脈遠(yuǎn)心端,然后在下腔靜脈遠(yuǎn)心端插管引流肝內(nèi)血液,預(yù)冷PBS 洗滌,切下肝臟小塊4 g,含有0.1 % Ⅳ型膠原酶的PBS 溶解肝組織,37 ℃水浴消化30 min,采用不連續(xù)密度梯度離心法分離出KCs,加入含有20 %胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,2 h 后棄非貼壁細(xì)胞,采用巨噬細(xì)胞特異性抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,采用臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞增殖活性,當(dāng)細(xì)胞增殖活性＞95 %可以選用。

1.3 實驗分組

KCs 接種于6 孔板(1 ×105個/孔),加入含有濃度為1 μg/mL LPS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h[8],記為LPS 組。同時將正常培養(yǎng)的KCs 記為Con 組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-NC、si-MALAT1、miR-NC、miR-181d-5p mimics 分別轉(zhuǎn)染至KCs,轉(zhuǎn)染成功后加入含有濃度為1 μg/mL LPS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為LPS +si-NC 組、LPS +si-MALAT1 組、LPS+miR-NC 組、LPS +miR-181d-5p 組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-MALAT1 和anti-miR-NC、si-MALAT1 和anti-miR-181d-5p 分別共轉(zhuǎn)染至KCs,轉(zhuǎn)染成功后加入含有濃度為1 μg/mL LPS 的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為LPS +si-MALAT1 +anti-miR-NC 組、LPS +si-MALAT1 +anti-miR-181d-5p組。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR) 檢測LncRNA MALAT1、miR-181d-5p 的表達(dá)水平

采用Trizol 試劑提取KCs 總RNA 用于檢測LncRNA MALAT1,并采用miRNA 提取試劑盒提取總RNA 用于檢測miR-181d-5p。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒與miRNA 專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 擴增,應(yīng)用羅氏Light Cycler 480 熒光定量PCR 儀檢測LncRNA MALAT1、miR-181d-5p 相對表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞計數(shù)試劑盒8 (cell counting kit 8,CCK-8) 實驗檢測細(xì)胞增殖

收集各組KCs 接種于96 孔板(2 ×103個/孔)后向每孔中加入CCK-8 溶液10 μL,于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm 處的吸光度值(A值) 并計算細(xì)胞增殖活性[實驗組A值/對照組A值×100 %]。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 檢測IL-6、IL-12、TNF-α 的水平

收集各組KCs 培養(yǎng)上清液,采用ELISA 法檢測IL-6、IL-12、TNF-α 的水平,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 雙熒光素酶報告實驗檢測LncRNA MALAT1 與miR-181d-5p 的靶向關(guān)系

采用分子克隆的方法LncRNA MALAT1 與miR-181d-5p 的結(jié)合位點克隆至pGL3 質(zhì)粒中構(gòu)建野生型載體WT-MALAT1,利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點進(jìn)行突變,突變位點克隆至pGL3 質(zhì)粒中構(gòu)建突變型載體MUT-MALAT1,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將WT-MALAT1、MUT-MALAT1 分別與 miR-NC 或miR-181d-5p mimics 共轉(zhuǎn)染至KCs,培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞并檢測細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LncRNA MALAT1 和miR-181d-5p 在脂多糖誘導(dǎo)的KCs 中的表達(dá)

與Con 組比較,LPS 組LncRNA MALAT1 的表達(dá)量升高(P＜0.05),miR-181d-5p 的表達(dá)量降低(P＜0.05) (表1)。

表1 LncRNA MALAT1 和miR-181d-5p 在脂多糖誘導(dǎo)的KCs 中的表達(dá)(,n=9)

表1 LncRNA MALAT1 和miR-181d-5p 在脂多糖誘導(dǎo)的KCs 中的表達(dá)(,n=9)

與Con 組比較,*P＜0.05

2.2 干擾LncRNA MALAT1 表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的KCs 細(xì)胞增殖活性和炎癥因子表達(dá)的影響

與Con 組比較,LPS 組細(xì)胞增殖活性降低(P＜0.05),IL-6、IL-12、TNF-α 的水平升高 (P＜0.05);與LPS+si-NC 組比較,LPS+si-MALAT1組細(xì)胞增殖活性升高 (P＜0.05),IL-6、IL-12、TNF-α 的水平降低(P＜0.05) (表2)。

表2 干擾LncRNA MALAT1 表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的KCs 存活和炎癥因子表達(dá)的影響(,n=9)

表2 干擾LncRNA MALAT1 表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的KCs 存活和炎癥因子表達(dá)的影響(,n=9)

與Con 組比較,*P＜0.05;與LPS+si-NC 組比較,#P＜0.05

2.3 LncRNA MALAT1 靶向調(diào)控miR-181d-5p 的表達(dá)

LncRNA MALAT1 的序列中含有與miR-181d-5p 互補的核苷酸序列(圖1)。與共轉(zhuǎn)染miR-NC細(xì)胞比,miR-181d-5p 過表達(dá)可抑制野生型載體WT-MALAT1 的熒光素酶活性(P＜0.05),但對突變型載體MUT-MALAT1 的熒光素酶活性無影響(P＞0.05) (表3)。與pcDNA 組比,pcDNA-MALAT1 組miR-181d-5p 表達(dá)量下降(P＜0.05);與si-NC 組比,si-MALAT1 組miR-181d-5p 表達(dá)量升高(P＜0.05),MALAT1 可負(fù)向調(diào)控miR-181d-5p的表達(dá)(P＜0.05) (表4)。

圖1 LncRNA MALAT1 的序列中含有與miR-181d-5p互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

表3 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

與miR-NC 組比較,*P＜0.05

表4 LncRNA MALAT1 調(diào)控miR-181d-5p 的表達(dá)(,n=9)

表4 LncRNA MALAT1 調(diào)控miR-181d-5p 的表達(dá)(,n=9)

與pcDNA 組比較,*P＜0.05;與si-NC 組比較,#P＜0.05

2.4 miR-181d-5p 過表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的KCs 細(xì)胞增殖活性和炎性因子表達(dá)的影響

與LPS +miR-NC 組比較,LPS+miR-181d-5p組細(xì)胞增殖活性升高 (P＜0.05),IL-6、IL-12、TNF-α 的水平降低(P＜0.05) (表5)。

表5 miR-181d-5p 過表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的KCs 存活和炎性因子表達(dá)的影響(,n=9)

表5 miR-181d-5p 過表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的KCs 存活和炎性因子表達(dá)的影響(,n=9)

與LPS+miR-NC 組比較,*P＜0.05

2.5 下調(diào)miR-181d-5p 表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的KCs 細(xì)胞增殖活性和炎性因子表達(dá)的作用

與LPS+si-MALAT1+anti-miR-NC 組比較,LPS+si-MALAT1 +anti-miR-181d-5p 組細(xì)胞增殖活性降低(P＜0.05),IL-6、IL-12、TNF-α 的水平升高(P＜0.05) (表6)。

表6 下調(diào)miR-181d-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾LncRNA MALAT1 表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的KCs 存活和炎性因子表達(dá)的作用(,n=9)

表6 下調(diào)miR-181d-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾LncRNA MALAT1 表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的KCs 存活和炎性因子表達(dá)的作用(,n=9)

與LPS+si-MALAT1 +anti-miR-NC 組比較,*P＜0.05

3 討論

肝臟缺血再灌注損傷與細(xì)胞炎癥損傷及氧化應(yīng)激有關(guān),炎性反應(yīng)可促使機體損傷,主要包括肝功能惡化、肝臟纖維化等,而LncRNA 可調(diào)節(jié)肝功能惡化、肝臟纖維化等所誘導(dǎo)的KCs 損傷中的炎性反應(yīng),同時還可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為[9-11]。IL-6、TNF-α 是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的主要因子,在肝損傷細(xì)胞模型中明顯上調(diào)[10]。本研究通過LPS 誘導(dǎo)建立肝損傷細(xì)胞模型,結(jié)果顯示,LPS 誘導(dǎo)的KCs 存活率降低,IL-6、IL-12、TNF-α 的水平升高,與既往研究報道結(jié)果相似[12],說明LPS 能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分泌炎癥因子,提示成功構(gòu)建細(xì)胞損傷模型,可以進(jìn)行下一步實驗。

LncRNA MALAT1 在過氧化氫處理的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),干擾其表達(dá)可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和MDA 含量升高,提高細(xì)胞中SOD 活性[13]。有報道指出沉默LncRNA MALAT1 可減輕腦缺血再灌注損傷[14],敲低LncRNA MALAT1 可通過調(diào)節(jié)miR-194-5p/FOXP2 分子軸抑制細(xì)胞凋亡從而減輕LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷[15]。以上研究表明LncRNA MALAT1 在不同器官損傷中發(fā)揮重要作用。但LncRNA MALAT1 對LPS 誘導(dǎo)的KCs 損傷的影響尚未可知。本研究結(jié)果顯示,LPS 誘導(dǎo)的KCs中LncRNA MALAT1 的表達(dá)量升高,干擾LncRNA MALAT1 表達(dá)后LPS 誘導(dǎo)的KCs 存活率升高,IL-6、IL-12、TNF-α 的水平降低,提示LncRNA MALAT1 參與肝臟缺血再灌注損傷過程,并且干擾LncRNA MALAT1 表達(dá)可促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的KCs 存活及抑制細(xì)胞炎性因子表達(dá)。

LncRNA 一般通過靶向調(diào)節(jié)miRNA 發(fā)揮作用,既往研究顯示,LncRNA MALAT1 與miR-181a-5p存在靶向調(diào)控的關(guān)系,敲低LncRNA MALAT1 不僅能夠通過提高miR-181a-5p 表達(dá)改善肝纖維化,還能抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖和粘附[16-17]。miR-181a-5p與miR-181d-5p 同屬于miR-181 的亞型,但與LncRNA MALAT1 的結(jié)合序列不完全一致,本研究證實LncRNA MALAT1 可靶向結(jié)合miR-181d-5p,提示LncRNA MALAT1 可能通過充當(dāng)miR-181d-5p 的ceRNA 而參與肝臟缺血再灌注損傷過程。本研究發(fā)現(xiàn),LPS 誘導(dǎo)的KCs 中miR-181d-5p 的表達(dá)量降低,miR-181d-5p 過表達(dá)后LPS 誘導(dǎo)的KCs 細(xì)胞增殖活性升高,IL-6、IL-12、TNF-α 的水平降低,說明miR-181d-5p 可減輕肝細(xì)胞損傷。miR-181d-5p在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活,并抑制其凋亡和炎性因子分泌[18],也有研究發(fā)現(xiàn)miR-181d-5p在腎損傷中表達(dá)水平降低,上調(diào)其表達(dá)可減輕腎損傷[19]。與上述研究類似,miR-181d-5p 可保護(hù)各器官免受炎癥損傷。為深入探討LncRNA MALAT1 與miR-181d-5p 的靶向關(guān)系,本研究在干擾LncRNA MALAT1 表達(dá)的基礎(chǔ)上下調(diào)miR-181d-5p 表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),KCs 存活率降低,炎性因子表達(dá)增高,提示LncRNA MALAT1 可靶向結(jié)合miR-181d-5p 參與LPS 誘導(dǎo)的KCs 損傷過程。

綜上所述,LPS 誘導(dǎo)的KCs 中LncRNA MALAT1 表達(dá)上調(diào),而miR-181d-5p 表達(dá)下調(diào),干擾LncRNA MALAT1 表達(dá)可通過上調(diào)miR-181d-5p 表達(dá)促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的KCs 存活及抑制細(xì)胞炎癥因子表達(dá),LncRNA MALAT1 可能作為減輕肝臟缺血-再灌注損傷的潛在靶點。但關(guān)于其具體作用機制仍需進(jìn)一步探究。