吉棚 ,趙華山 ,王晨 ,劉淑榮 ,馬建增

陽光融和醫(yī)院1乳腺甲狀腺外科,2腫瘤內科 山東省濰坊市,261000

乳腺癌是乳腺上皮細胞癌變引起的惡性腫瘤,雖然我國屬于乳腺癌低發(fā)區(qū)域,但近年來我國乳腺癌發(fā)病年齡趨向年輕化[1-2]。目前對于乳腺癌的治療主要以手術切除為主,雖然輔助化療能夠顯著提高乳腺癌患者的治療效果[3-4],但外科創(chuàng)傷、化療也會對癌癥患者身體帶來創(chuàng)傷,對乳腺癌發(fā)病、進展相關基因作用機制的研究有助于治療藥物研發(fā),為癌癥疾病治療提供新的思路[5]。長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA,LncRNA) 是參與腫瘤細胞生物學行為過程的無蛋白質編碼功能的RNA分子,有研究顯示LncRNA BCYRN1 在肺腺癌細胞中表達上調,還能影響肺腺癌細胞周期阻滯、侵襲和遷移能力,LncRNA BCYRN1 高表達患者的預后較差[6]。但LncRNA BCYRN1 在乳腺癌中的作用機理研究較少,本研究借助短發(fā)卡RNA (short hairpin RNA,shRNA) 技術沉默BCYRN 表達,探討shRNA 干擾LncRNA BCYRN1 對乳腺癌MCF-7 細胞行為、移植瘤生長的影響及其潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本、實驗細胞及動物

乳腺癌組織及癌旁組織源于本院行乳腺癌根治術切除組織,共計30 例,乳腺癌患者年齡25～46歲,平均(35.3 ±5.9) 歲。乳腺癌細胞株MCF-7購自中國科學院細胞庫;SPF 級3 周齡雌性裸鼠40只購自濰坊醫(yī)學院[SCXK (魯) 20200001],體重(20 ±4) g。

1.2 主要試劑與儀器

Ki67 抗體(貨號: ab 245113;批號20190209)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin) 抗體(貨號: ab 194982;批號: 20190408)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin) 抗體(貨號: ab 198496;批號: 20190601)、波形蛋白(Vimentin) 抗體(貨號: ab92547;批號20190411) 均購自艾博抗(上海) 貿易有限公司;山羊抗大鼠IgG熒光二抗(貨號: E-AB-1021) 購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;Lipofectamine?2000 購自上海研謹生物科技有限公司;RPMI1640 培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、絲裂霉素均購自美國sigma 公司;TRIzol 試劑購自Thermo Fisher 公司。

細胞培養(yǎng)箱購自美國Forma 公司;低溫離心機購自德國eppendorf 公司;切片機、英冠顯微鏡購自德國Leica 公司;實時熒光定量PCR 儀購自美國伯樂公司。

1.3 細胞培養(yǎng)、分組及轉染

將乳腺癌MCF-7 細胞放于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)(37 ℃、5 % CO2),RPMI1640 培養(yǎng)基含有10 %FBS、100 U/mL 青霉素、鏈霉素。將乳腺癌MCF-7 細胞分為空白對照組(Control)、陰性對照組(shRNA-NC)和干擾組(sh-BCYRN1),用于后續(xù)實驗,按照說明書,將sh-BCYRN1 穩(wěn)定表達下調的質粒轉染干擾組細胞,將無義序列shRNA 質粒轉染陰性對照組細胞,培養(yǎng)48 h,使用RT-PCR 檢測細胞BCYRN1 表達。

1.4 實時定量PCR (real-time quantitative PCR,RTPCR) 檢測BCYRN1 相對表達量

Trizol 提取細胞總RNA,反轉錄合成cDNA 鏈,以此鏈為模板,采用定量PCR 儀擴增,以GADPH為內參照基因,95 ℃預變性2 min;95 ℃變性8 s,58 ℃退火35 s,72 ℃延伸40 s,40 個循環(huán)。目的基因表達相對值RQ=2-ΔΔCt。引物由TAKARA 公司合成,β-肌動蛋白(β-actin) 上游引物5′-CTCAGACACCATGGGGAGGTGA-3′,下游引物 5′-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3′;BCYRN1 上游引物5′-AGACCTGCCTGGGCAATATAG-3′,下游引物5′-GTTGTTGCTTTGAGGGAAGTTACG-3′。

1.5 Edu 法檢測細胞增殖

使用Edu 法檢測細胞增殖,詳細操作參考文獻[7],在400 倍顯微鏡下觀察Edu 陽性細胞數。

1.6 Transwell 檢測細胞侵襲情況

取對數生長期細胞并將密度調整為1 ×105個/mL,將細胞接種至Transwell 小室(上室為無血清培養(yǎng)基、下室為含血清培養(yǎng)基),24 h 后,4 %多聚甲醛固定細胞,0.1 %結晶紫染色細胞,高倍鏡下選取3 個不重疊視野對染色細胞進行拍照,重復3 次,統(tǒng)計細胞數。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將細胞接種至24 孔板(5 ×105個/孔),按照上述細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h,全培養(yǎng)基潤洗,加入10 μmol/L 絲裂霉素,培養(yǎng)2 h,加入完全培養(yǎng)基,分別在0 h 和24 h 時拍照,重復3 次。

1.8 免疫熒光檢測Vimentin 表達

待細胞貼壁生長后,收集細胞涂片,4 %多聚甲醛固定15 min,Triton X-100 透膜10 min,正常非免疫兔血清封閉30 min,加入大鼠抗人Vimentin一抗稀釋液(1∶100) 4 ℃過夜,每張涂片滴加山羊抗大鼠IgG 熒光二抗稀釋液(1∶400) 37 ℃反應30 min,晾干后抗熒光猝滅封片劑封固,于熒光顯微鏡觀察細胞Vimentin 表達。

1.9 蛋白質印跡法(Western blotting) 檢測蛋白表達水平

待細胞貼壁生長后使用胰蛋白酶處理,提取總蛋白,10 %的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在100 V電壓分離,0.65 mA/cm2恒定電流轉移1.5 h 至聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride,PVDF) 膜,使用5 %的脫脂奶粉恒溫封閉2 h,加入各需要檢測蛋白的一抗、二抗,孵育2 h,Tris 緩沖鹽水與吐溫20 (Tris Buffered Saline with Tween 20,TBST)洗凈,以β-actin 為內參蛋白,實驗重復3 次。

1.10 裸鼠體內移植瘤實驗

收集對數期的MCF-7 細胞,將MCF-7 細胞懸液(3.5 ×107個/mL) 于裸鼠腋下注射,4 μL/只,待成瘤后(成瘤標準: 移植瘤直徑＞5 mm),將成瘤裸鼠隨機數字表法分為空白對照組(Control)和干擾組(sh BCYRN1),每組各20 只,干擾組、空白對照組分別給予sh-BCYRN1 質粒轉染、無義序列shRNA 質粒轉染移植瘤,繼續(xù)飼養(yǎng)4 周,麻醉處死裸鼠,分離移植瘤,RT-PCR 檢測移植瘤BCYRN1 表達,稱重腫瘤質量,蛋白質印跡法檢測移植瘤Ki67、N-cadherin 蛋白表達。

1.11 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗;兩組間差異比較用t檢驗;檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織BCYRN1 表達情況及轉染效率檢測結果

乳腺癌組織、癌旁組織BCYRN1 表達的RTPCR 實驗結果表明,乳腺癌組織BCYRN1 表達顯著高于癌旁組織(P＜0.05),說明BCYRN1 在乳腺癌組織中呈高表達趨勢 (圖1A)。轉染細胞BCYRN1 表達的RT-PCR 實驗結果表明,陰性對照組、空白對照組BCYRN1 表達無顯著變化(P＞0.05),比較空白對照組和陰性對照組,干擾組BCYRN1 表達顯著降低(P＜0.05),說明細胞轉染成功(圖1B)。

圖1 乳腺癌組織BCYRN1 表達及MCF-7 細胞轉染后的BCYRN1 表達

2.2 干擾LncRNA BCYRN1 對MCF-7 細胞Ki67 蛋白表達的影響

Edu 實驗結果表明,與空白對照組比較,陰性對照組Edu 陽性細胞百分比無顯著變化 (P＞0.05);比較空白對照組和陰性對照組,干擾組Edu 陽性細胞百分比顯著減少(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能抑制乳腺癌MCF-7 細胞增殖(圖2A、B)。

圖2 Edu 結果及細胞Ki67 蛋白表達情況

蛋白質印跡實驗結果表明,與空白對照組比較,陰性對照組Ki67 蛋白表達無顯著變化(P＜0.05);與空白對照組和陰性對照組比較,干擾組Ki67 蛋白表達顯著降低(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能降低乳腺癌MCF-7 細胞Ki67 蛋白表達(圖2C)。

2.3 干擾LncRNA BCYRN1 對MCF-7 細胞侵襲的影響

Transwell 實驗結果表明,與空白對照組比較,陰性對照組單個視野細胞侵襲數目無顯著變化(P＞0.05)。

與空白對照組和陰性對照組比較,干擾組單個視野細胞侵襲數目顯著降低(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能抑制乳腺癌MCF-7 細胞侵襲(圖3)。

圖3 各組細胞侵襲情況

2.4 干擾LncRNA BCYRN1 對MCF-7 細胞遷移的影響

劃痕實驗結果表明,與空白對照組比較,陰性對照組細胞遷移率無顯著變化(P＞0.05);與空白對照組和陰性對照組比較,干擾組細胞遷移率顯著下降(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能抑制乳腺癌MCF-7 細胞遷移(圖4)。

圖4 各組細胞遷移情況

2.5 干擾LncRNA BCYRN1 對MCF-7 細胞運動能力的影響

蛋白質印跡實驗結果表明,與空白對照組比較,陰性對照組E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達無顯著變化(P＞0.05);比較空白對照組和陰性對照組,干擾組N-cadherin 蛋白表達顯著降低,Ecadherin 蛋白表達升高(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能通過降低N-cadherin 蛋白表達,升高E-cadherin 蛋白表達,抑制乳腺癌MCF-7 細胞運動能力(圖5A)。免疫熒光實驗結果表明,與空白對照組比較,陰性對照組Vimentin 陽性率無顯著變化(P＞0.05);與空白對照組和陰性對照組比較,干擾組Vimentin 陽性率顯著降低(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能抑制Vimentin 表達來影響乳腺癌MCF-7 細胞運動(圖5B)。

圖5 MCF-7 細胞運動能力檢測結果

2.6 干擾LncRNA BCYRN1 對裸鼠移植瘤生長的影響

移植瘤RT-PCR 實驗結果表明,與空白對照組比較,干擾組BCYRN1 表達顯著降低(P＞0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 裸鼠移植瘤構建成功(圖6A)。移植瘤質量稱重實驗表明,干擾組裸鼠移植瘤質量低于空白對照組(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能抑制裸鼠移植瘤生長(圖6B),移植瘤蛋白質印跡實驗結果表明,與空白對照組比較,干擾組移植瘤組織Ki67、N-cadherin 蛋白表達降低 (P＜0.05),說明干擾 LncRNA BCYRN1 可能通過降低Ki67、N-cadherin 蛋白表達來抑制移植瘤生長(圖6C、D)。

圖6 干擾LncRNA BCYRN1 對裸鼠移植瘤生長的影響

3 討論

LncRNA BCYRN1 在非小細胞肺癌患者血清中呈高表達趨勢且與患者不良預后存在密切關系[8],還能通過調節(jié)細胞侵襲信號通路調節(jié)結直腸癌細胞的侵襲轉移能力[9],BCYRN1 高表達能促進卵巢癌細胞增殖和轉移[10]。本研究結果顯示,乳腺癌癌組織BCYRN1 表達明顯高于癌旁組織,說明BCYRN1 可能參與乳腺癌發(fā)病或進展過程。本研究通過shRNA 沉默MCF-7 細胞中BCYRN1 表達,結果顯示LncRNA BCYRN1 低表達MCF-7 細胞的Edu陽性細胞百分比降低,且Ki67 蛋白表達降低。Ki67 在細胞增殖過程中占據重要作用,在多種腫瘤組織呈高表達趨勢[11-12],Ki67 高表達與乳腺癌組織微血管密度存在關系[13]。說明shRNA 干擾LncRNA BCYRN1 能降低乳腺癌MCF-7 細胞增殖能力,可能是通過降低細胞Ki67 蛋白表達實現對癌細胞增殖抑制作用。

LncRNA 可通過調節(jié)瘤細胞增殖、運動能力、凋亡以及耐藥性等參與原發(fā)性腫瘤進展,LncRNA參與乳腺癌細胞生物學行為過程[14-15],具有潛在診斷價值。乳腺癌經根治術治療后仍存在術后復發(fā)、遠處轉移風險,這與乳腺癌細胞較強侵襲、遷移能力有關。本研究結果顯示,LncRNA BCYRN1低表達MCF-7 細胞的單個視野細胞侵襲數目、細胞遷移率均呈明顯降低趨勢,與Zhou 等[16]研究結果趨勢,說明shRNA 干擾LncRNA BCYRN1 會降低乳腺癌MCF-7 細胞侵襲和遷移能力。乳腺癌細胞侵襲、遷移能力強于正常組織細胞,與上皮間質轉化有關,有研究表明阻斷乳腺癌細胞上皮間質轉化過程可以降低乳腺癌細胞侵襲、遷移能力[17]。E-cadherin 為上皮細胞標志蛋白,N-cadherin 參與細胞間的黏附過程,N-cadherin 在上皮間質轉化中表達上調[18]。Vimentin 為細胞骨架組成部分,同時也是間質細胞標志蛋白,其表達水平升高提示腫瘤細胞的浸潤能力增強[19]。本研究結果顯示,LncRNA BCYRN1 低表達MCF-7 細胞N-cadherin 蛋白表達和Vimentin 陽性率均呈明顯降低趨勢,而Ecadherin 蛋白表達呈明顯升高趨勢,與皮亞平等[20]研究結果相似,說明shRNA 干擾LncRNA BCYRN1可能通過調節(jié)上皮間質轉化中的E-cadherin、Ncadherin、Vimentin 蛋白表達來調節(jié)乳腺癌細胞侵襲、遷移能力。裸鼠成瘤實驗在腫瘤學、免疫學以及藥物安全性評估、篩選方面有著特殊意義,本研究通過裸鼠移植瘤實驗發(fā)現LncRNA BCYRN1 低表達裸鼠移植瘤質量和移植瘤組織Ki67、N-cadherin蛋白表達降低,說明shRNA 干擾LncRNA BCYRN1能抑制乳腺癌移植瘤生長,與降低移植瘤組織Ki67、N-cadherin 蛋白表達有關。

綜上所述,shRNA 干擾LncRNA BCYRN1 對乳腺癌MCF-7 細胞增殖、侵襲、遷移能力有抑制作用,其作用機制可能與調節(jié)細胞增殖、上皮間充質轉化相關蛋白表達有關,還能抑制裸鼠移植瘤生長。乳腺癌惡性行為機制復雜,調控途徑多樣,本研究還存在未能闡明LncRNA BCYRN1 是通過何種信號途徑調節(jié)乳腺癌惡性行為,后續(xù)將開展深入探究。