吳忠坤 ,宋平輝 ,張毅 ,李春博 ,李勤新

1陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院普通外科 陜西省咸陽市,712000 2興平市人民醫(yī)院兒科 陜西省興平市,713199

肝癌(liver cancer) 是一種起源于肝臟的惡性腫瘤,可分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌,其中后者更為常見[1-3]。肝癌在癌癥死亡中排名第三,在惡性腫瘤發(fā)病中排名第四,嚴重危害患者生命安全[4]。既往流行病學調(diào)查顯示,肝癌與寄生蟲、病毒性肝炎、飲酒等因素相關。但這些因素對肝癌發(fā)生和發(fā)展的影響機制尚未明晰。目前,已有大量針對肝癌發(fā)病機制的分子生物學研究,并取得一定成果。研究已證實,肝癌發(fā)生發(fā)展與Wnt/β-catenin、PI3 K/Ras 信號通路異常、P53 調(diào)控的細胞周期異常、染色體重組、氧化應激等機制明顯相關[5-8]。Guichard 等[9]研究結(jié)果顯示,肝癌中Wnt/β-catenin 信號通路異常的發(fā)生率最高,其占比超過30 %。其中,β-catenin 隸屬ARM 重復蛋白超家族,由CTNNB1 基因編碼。雖然這種蛋白在進化上高度保守,但能通過Wnt/β-catenin 信號通路輸出信號,并對下游效應器功能產(chǎn)生多樣且廣泛的影響。既往研究表明,這條信號通路被發(fā)現(xiàn)在胚胎細胞、體細胞和肝細胞的生長過程中扮演重要角色,保證組織器官正常發(fā)育和再生[10-11]。其通路異常產(chǎn)生一系列連鎖反應,引起細胞異常生長發(fā)育,甚至發(fā)生癌變。近期Hirotsu 等[12]研究發(fā)現(xiàn),16 種肝癌突變基因中頻率最高的分別為TP53 和CTNNB1基因突變,其中CTNNB1 基因點突變以G34R 和H36P 為主。但目前鮮有關于H36P 位點突變的研究,因此本研究擬討論β-catenin 蛋白H36P 突變與肝癌細胞的增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝Huh7 和HepG2 細胞株及突變體G34R 和H36P 質(zhì)粒均購于上海雅吉生物科技有限公司。全部引物均由金斯瑞生物科技有限公司。主要實驗試劑和藥品,包括細胞培養(yǎng)液(上海索萊寶生物科技有限公司)、電泳染料(武漢愛博泰克生物技術有限公司)、甲醇、乙酸等試劑(國藥集團)、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN 公司)、兔β-catenin 單克隆抗體(clone: ARC0136,武漢愛博泰克生物技術有限公司)、分子克隆試劑(美國Invitrogen 公司)、Taq DNA 聚合酶(美國Invitrogen 公司)、CCK-8 試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司) 等。

1.2 細胞復蘇及培養(yǎng)

取出保存的Huh7、HepG2 細胞株后置于冰上解凍,完全解凍后1 000 r/min 離心5 min 移除上清,加入滅菌的新鮮培養(yǎng)基,吹打混合,混勻后移至6 cm 培養(yǎng)皿,細胞融合度達到80 %后傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)時,使用DMEM 培養(yǎng)液(含10 %～15 %胎牛血清) 培養(yǎng),調(diào)整密度為3 ×106個/mL,置于37 ℃5 % CO2和95 %濕度下培養(yǎng),生長良好狀態(tài)下細胞單層貼壁生長。

1.3 構(gòu)建質(zhì)粒及瞬時轉(zhuǎn)染

CTNNB1 基因(NCBI Gene ID: 1499) 序列獲取自NCBI 官網(wǎng),并設計正反義引物鏈(F 鏈: 5′-CCTCCCAAGTCCTTTATGAATGG-3′,R 鏈: 5′-CCGTCAATATCAGCTACTTGCTCTT-3′)。通過PCR 擴增法擴增CTNNB1 基因外顯子序列,并通過雙酶切法克隆至p-CMV5 質(zhì)粒載體上。應用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染法進行瞬時轉(zhuǎn)染。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting,WB) 檢測蛋白表達檢測

使用蛋白質(zhì)印跡法檢測底物蛋白的表達情況。首先,抽提細胞樣品中的蛋白: ①將待處理細胞樣品冰上預冷,除去培養(yǎng)液后使用PBS 緩沖液沖洗;②按比例加入裂解液后冰上靜置5 min,超聲破碎處理后離心并移除上清。隨后,吸取微量處理好的樣品進行蛋白濃度檢測。其余部分加入等量2×SDS Buffer,沸水浴10 min,蛋白變性后進行WB分析。每個樣品重復3 次。

1.5 蛋白泛素化檢測

利用放線菌酮(cycloheximide,CHX) 法檢測底物(β-catenin 野生型和突變體G34R 和H36P)蛋白的降解。首先,將G34R 和H36P 突變體及WT 轉(zhuǎn)染至已培養(yǎng)的Huh7、HepG2 細胞株中。隨后每隔2 h 加入溶解在DMSO 中的CHX (100 μg/μL) 處理,提取樣品蛋白檢測其表達情況。

1.6 細胞增殖檢測

利用cell counting kit-8 (CCK-8) 法檢測細胞增殖。將處理好的細胞培養(yǎng)液中直接加入10 %體積的CCK-8,充分混合后加入10 μL 檢測試劑,培養(yǎng)1～4h。使用酶標儀在A450nm下讀數(shù)并記錄結(jié)果,每個樣品重復3 次。

1.7 蛋白核轉(zhuǎn)位檢測

使用蛋白提取試劑盒,分別抽提核蛋白、胞漿蛋白和總蛋白,使用WB 法檢測其表達情況。其中PARP 作為核蛋白內(nèi)參,GAPDH 作為全蛋白或胞漿蛋白內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 肝癌細胞中β-catenin 野生型及突變體的表達情況及其蛋白穩(wěn)定性

WB 法檢測空載對照vector、β-catenin 野生型WT-β-catenin、β-catenin 突變體G34R 和H36P 在HepG2 和Huh7 肝癌細胞株中的表達水平。結(jié)果顯示,突變體G34R、H36P 的蛋白質(zhì)表達水平,與野生型β-catenin 無明顯差異(圖1)。

圖1 肝癌細胞株中野生型、突變型β-catenin 蛋白表達

CHX 實驗檢測β-catenin 突變體在HepG2 和Huh7 肝癌細胞株中的泛素化降解情況。結(jié)果顯示,在HepG2 細胞株中,CHX 作用8 h 時WT-β-catenin幾乎完全降解,而G34R 和H36P 只降解了75 %和60 % (圖2A)。Huh7 細胞株中的情況類似,6 h時WT-β-catenin 幾乎完全降解,而G34R 和H36P只降解了約40 % (圖2B),以上結(jié)果均有顯著性差異(P＜0.05)。

圖2 β-catenin 泛素化降解量化統(tǒng)計

2.2 β-catenin 突變體對肝癌細胞增殖的影響

CCK-8 細胞增殖實驗檢測β-catenin 突變體G34R、H36P 對HepG2 和Huh7 肝癌細胞株增殖的影響。CCK-8 細胞增殖計數(shù)發(fā)現(xiàn),相較于WT-βcatenin,G34R 和H36P 促使HepG2 及Huh7 細胞增殖提升(圖3)。

圖3 β-catenin 突變體對肝癌細胞增殖的影響

2.3 β-catenin 野生型和突變體在肝癌細胞中核轉(zhuǎn)位差異分析

分離細胞核質(zhì)分離進行WB 分析了解突變體G34R、H36P 在HepG2 和Huh7 肝癌細胞株中核轉(zhuǎn)位情況。

實驗結(jié)果顯示,與WT-β-catenin、突變體G34R 相比,突變體H36P 在肝癌細胞中的核轉(zhuǎn)位明顯增加(圖4)。

圖4 β-catenin 野生型和突變體在肝癌細胞中核轉(zhuǎn)位情況

3 討論

既往研究表明,β-catenin 蛋白在Wnt/β-catenin 信號通路中扮演重要角色,在肝癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮不可替代的作用[13-15]。小鼠、大鼠和兔等動物模型研究進一步驗證了β-catenin 蛋白的生物學功能。結(jié)果表明,β-catenin 蛋白對細胞增殖、分化、遷移和極化等功能均有影響[16]。另一方面研究發(fā)現(xiàn),肝癌的發(fā)生和發(fā)展期間Wnt/β-catenin 信號通路均呈現(xiàn)異常,其中β-catenin 蛋白表達也呈異常水平[16-18]。除此之外,不僅在肝癌組織,甚至在離體肝癌細胞株及其構(gòu)建的相應的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型中都存在β-catenin 的單個位點突變。本研究為了檢查突變體的蛋白表達水平,對比了對照質(zhì)粒、野生型、陽性對照突變體G34R 和新突變體H36P的蛋白表達水平。結(jié)果顯示,在HepG2 和Huh7 肝癌細胞株中,G34R 和H36P 蛋白表達水平與WTβ-catenin 無明顯差異。這可能是體外培養(yǎng)細胞中β-catenin 內(nèi)源性高水平表達的結(jié)果,因而抑制了外源性β-catenin 的表達。

雖上述實驗未見β-catenin 野生型及其突變體的蛋白表達水平差異,但其蛋白結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變。因此接下來,本研究檢測了突變體β-catenin蛋白在肝癌細胞株中的泛素化降解情況。按時間梯度加入核糖體轉(zhuǎn)錄抑制劑CHX 處理,以分析蛋白表達情況。結(jié)果顯示,CHX 作用6～8 h 后,WTβ-catenin 蛋白幾乎完全降解,而H36P 蛋白僅降解了20 %～39 %,與同時間段陽性對照G34R 水平類似。這說明,H36P 在肝癌細胞中的泛素化降解過程受到了較大程度的抑制,也再次證實了H36P蛋白表達的穩(wěn)定性。本研究推測這可能是蛋白的空間分布改變的結(jié)果。為了了解H36P 在肝癌細胞中核轉(zhuǎn)位的情況,本研究分離了細胞質(zhì)和細胞核,WB 檢測β-catenin 在細胞核和細胞質(zhì)中的水平。結(jié)果表明,H36P 突變體在肝癌細胞的細胞核中的水平明顯高于野生型β-catenin。CCK-8 計數(shù)結(jié)果顯示,相較于WT-β-catenin,H36P 更加明顯地促使HepG2 和Huh7 細胞存活率(A值) 的變化。且在浸染72 h 內(nèi),H36P 對上述細胞存活率的影響也較陽性對照G34R 更為明顯。上述結(jié)果均說明,H36P 促進了肝癌細胞的增殖。

綜上所述,β-catenin 蛋白H36P 突變蛋白表達穩(wěn)定、泛素化降解過程受阻、核轉(zhuǎn)位情況增多,并能促進HepG2 和Huh7 肝癌細胞的增殖。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin 蛋白突變體H36P 在肝癌細胞中具有促進癌細胞增殖的作用。但本研究未了解H36P 泛素化降解受阻過程的具體機制,及H36P 與Wnt/β-catenin 信號通路中其他關鍵蛋白的相互作用情況。因此在下一步的研究中,擬探究突變體在信號通路中的作用。