湯曉青 ,郭璽 ,萬焱 ,王潔 ,徐斌 ,陳瑾 ,黨富濤,付海艷,羅煜

昆明市第三人民醫(yī)院,云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心1腫瘤科,2醫(yī)務(wù)科 昆明市,650041

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC) 是最常見的惡性腫瘤,在全球癌癥相關(guān)死亡中排名第四[1]。HCC 的主要原因是肝硬化,它主要是由乙型肝炎、丙型肝炎感染、飲酒過度等因素引起[2]。目前,HCC 的常規(guī)治療包括放療、化療、部分手術(shù)和肝移植,由于治療過程中會出現(xiàn)各種并發(fā)癥,HCC 患者的5 年生存率仍然很低[3-4]。因此,闡明HCC 發(fā)展的分子機制對于開發(fā)更有效的治療方案尤為重要。

代謝重編程是腫瘤的一個重要特征[5-6]。Warburg 效應(yīng)表明,即使在充足的氧氣條件下,大多數(shù)腫瘤細(xì)胞也依賴糖酵解來產(chǎn)生能量[7]。能量代謝的改變已被認(rèn)為是解釋腫瘤細(xì)胞典型的快速增殖、轉(zhuǎn)移和化學(xué)抗性的關(guān)鍵機制[8]。因此,該關(guān)鍵特征為癌癥的治療干預(yù)提供了新的靶點。越來越多的研究證實抑制糖酵解成為癌癥治療的新策略,例如Ma 等[9]研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA FGF13-AS1 通過FGF13-AS1/胰島素樣生長因子2 mRNA 結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA binding proteins,IGF2 BPs)/骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因(myelocytomatosis,MYC) 軸抑制乳腺癌細(xì)胞的糖酵解和干細(xì)胞特性發(fā)揮腫瘤抑制作用。Qin 等[10]研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5 (protein arginine methyltransferase 5,PRMT5) 通過F-box 和WD 重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白7 (F-box and WD repeat domain-containing 7,FBW7)/MYC 軸通過調(diào)節(jié)糖酵解促進(jìn)胰腺癌的發(fā)展。

另外,在HCC 中的研究發(fā)現(xiàn),熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90) 通過M2 型丙酮酸激酶 (recombinant pyruvate kinase isozymes M,PKM2) 促進(jìn)肝癌細(xì)胞的糖酵解過程,從而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長[11]。以上這些結(jié)果提示糖酵解與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。值得注意的是,目前關(guān)于HCC 進(jìn)展與糖酵解的之間關(guān)系尚未完全明晰,因此,本研究旨在深入探究肝癌與糖酵解的關(guān)系。

醛酮還原酶家族1 成員B10 (aldo-keto reductase family 1 member B10,AKR1B10),是人類醛酮還原酶 (aldo-keto reductase,AKR) 超家族的一員,通過將醛酮羰基化合物還原為醇來保護細(xì)胞[12]。AKR1B10 通過穩(wěn)定乙酰輔酶A 羧化酶α[13]來調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成,在癌癥脂質(zhì)代謝中發(fā)揮中心作用。在最近的研究中,AKR1B10 被報道可能參與許多癌癥的發(fā)生發(fā)展,其高表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者和胃癌患者預(yù)后不佳密切相關(guān)[14-15]。據(jù)報道,AKR1B10 通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B,AKT)/核因子κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB) 信號通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移[16]。另一項研究報道,甲基轉(zhuǎn)移酶樣3 (methyltransferase like 3,METTL3) 通過介導(dǎo)AKR1B10的N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A) 修飾促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖和糖酵解[17]。盡管有諸多研究證實AKR1B10 在多種癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,但關(guān)于AKR1B10 在HCC 細(xì)胞糖酵解中的詳細(xì)功能和潛在分子機制尚不清楚。

1 材料方法

1.1 生信分析

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/) 下載HCC 的mRNA 數(shù)據(jù)(正常樣本50個,癌癥樣本374 個) 的表達(dá)量數(shù)據(jù)。通過edgeR差異分析(| logFC | ＞2,Padj＜0.05),獲得差異表達(dá)mRNA,通過查閱文獻(xiàn)確定研究對象為AKR1B10。分析AKR1B10 在癌癥組織中的表達(dá)情況。對目的基因進(jìn)行GSEA 通路富集分析。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人HCC 細(xì)胞HepG2、HCCLM3、Hep3B 和人正常肝細(xì)胞系L-02 均購自青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司(China)。將上述細(xì)胞系在含10 %胎牛血清(FBS) 的DMEM 培養(yǎng)基中于37 ℃,5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

si-AKR1B10、oe-AKR1B10 以及對應(yīng)的陰性對照購自于Ribobio (China)。2-DG (20 mmol/L)和DMSO (20 mmol/L) 均購自Sigma (USA)。使用Lipofectamine 2000 試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA),并根據(jù)試劑盒操作說明書將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HCC 細(xì)胞中。

1.3 qRT-PCR

利用Trizol 法提取總RNA,RNA (1 mg) 通過Qiagen One-Step RT-PCR kit (Qiagen Gmbh,Germany) 一步逆轉(zhuǎn)錄法將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA 并進(jìn)行qRT-PCR 實驗。具體引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)

加入裂解液從細(xì)胞中提取總蛋白,然后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白。隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上后,使用5 %脫脂奶粉封閉1 h。將膜與一抗4 ℃孵育過夜,然后和二抗孵育2 h,使用增強化學(xué)發(fā)光(ECL) 底物試劑盒以及凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白表達(dá)。本研究使用的抗體包括: 一抗兔抗 AKR1B10 (1 ∶1 000,ab192865,Abcam,UK)、β-actin (1 ∶ 1 000,ab179467,Abcam,UK);二抗山羊抗兔IgG (1 ∶2 000,ab205718,Abcam,UK)。

1.5 CCK-8

細(xì)胞以2 ×103個/孔的密度接種到96 孔板中,并孵育0、24、48、72 和96 h。加入10 μL CCK-8溶液(Sigma,USA),繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h。用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測吸光度。

1.6 Transwell

將細(xì)胞接種到Transwell 實驗裝置(Corning,USA) 的上室(無血清培養(yǎng)基),隨后在下室加入含有10 % FBS 的PRMI-1640 培養(yǎng)基,在37 ℃下培養(yǎng)1 d 后,除去上室中未遷移的細(xì)胞。用4 %多聚甲醛固定遷移的細(xì)胞,用結(jié)晶紫染色30 min。在顯微鏡下觀察并計算細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲能力的檢測,在向上室接種細(xì)胞前,先在上室底部涂抹30 μL 的Matrigel,其余步驟同遷移實驗基本一致。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

對于HCC 細(xì)胞凋亡水平的測定,將各組細(xì)胞正常消化后,用PBS 洗滌細(xì)胞兩次,然后在500 μL 結(jié)合緩沖液中重新懸浮,與5 μL Annexin VFITC 和10 μL PI 混合,并在室溫下暗染色15 min。通過流式細(xì)胞術(shù)[FCM,BD FACS Calibur,?？松?北京) 科技有限公司,China] 檢測凋亡率。

1.8 糖酵解途徑活性的測定

使用Seahorse Biosciences XF96 分析儀檢測糖酵解能力和耗氧量。細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中24 h,然后在37 ℃的XF 培養(yǎng)基中孵育2 h。按照XF Cell Mito Stress Test Profile 操作說明書檢測耗氧率(oxygen consumption rate,OCR)。按照XF Glycolysis Stress Test Profile 操作說明書檢測胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR)。

1.9 丙酮酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸水平檢測

根據(jù)制造商的說明書,使用丙酮酸檢測試劑盒(Catl.No.A081) 檢測丙酮酸的產(chǎn)生,使用乳酸檢測試劑盒(Catl.No.K951) 檢測乳酸的產(chǎn)生,使用檸檬酸檢測試劑盒(Catl.No.A128) 檢測檸檬酸的產(chǎn)生,使用蘋果酸檢測試劑盒(Catl No.K637) 檢測蘋果酸的產(chǎn)生。乳酸檢測試劑盒和蘋果酸檢測試劑盒均購自BioVision (USA),丙酮酸檢測試劑盒和檸檬酸檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(中國)。

1.10 統(tǒng)計分析

本研究的數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD) 表示,并使用GraphPad Prism 進(jìn)行分析并繪圖。本研究所有實驗均設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。多組間差異均使用ANOVA 方差分析檢驗差異顯著性,兩組間差異的比較均使用Studentt-test 檢驗差異的顯著性。P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AKR1B10 在HCC 組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)

從TCGA-HCC 數(shù)據(jù)下載mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù),進(jìn)行差異分析,結(jié)果顯示AKR1B10 在HCC 組織中高表達(dá)(圖1A)。利用qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡實驗進(jìn)一步證實AKR1B10 在HCC 細(xì)胞系HepG2、HCCLM3、Hep3B 中顯著上調(diào) (圖1B、C),其在HepG2 細(xì)胞中的表達(dá)最高,在HCCLM3 細(xì)胞中表達(dá)最低,因此后續(xù)實驗選擇這兩個細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞功能實驗的驗證。以上結(jié)果表明AKR1B10 在HCC組織和細(xì)胞中顯著高表達(dá)。

圖1 AKR1B10 在HCC 組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)

2.2 敲低AKR1B10 抑制HCC 細(xì)胞的惡性進(jìn)展

我們基于HepG2 細(xì)胞構(gòu)建AKR1B10 敲低表達(dá)的HCC 細(xì)胞,基于HCCLM3 細(xì)胞構(gòu)建AKR1B10過表達(dá)的HCC 細(xì)胞,并利用qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡檢測轉(zhuǎn)染效率(圖2A、B)。CCK-8 和Transwell實驗結(jié)果顯示敲低AKR1B10 顯著下降會顯著降低HCC 細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力(圖2C～G)。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示敲低AKR1B10 后細(xì)胞凋亡比例顯著提高,而過表達(dá)AKR1B10 則顯著抑制細(xì)胞凋亡率(圖2H)。以上結(jié)果表明敲低AKR1B10 能抑制HCC 細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲,并促進(jìn)凋亡。

圖2 敲低AKR1B10 抑制HCC 細(xì)胞的惡性進(jìn)展

2.3 AKR1B10 促進(jìn)HCC 細(xì)胞糖酵解途徑

為了進(jìn)一步探究AKR1B10 影響HCC 細(xì)胞惡性行為的潛在機制,通過GSEA 通路富集分析發(fā)現(xiàn),AKR1B10 高表達(dá)可能參與糖酵解/糖異生通路(圖3A)。由此猜測AKR1B10 可能影響HCC 細(xì)胞糖酵解。因此,我們采用qRT-PCR 檢測細(xì)胞中糖酵解代謝途徑相關(guān)的特定基因MYC、HK2、PGK1 的表達(dá)水平,結(jié)果表明與si-NC 相比,si-AKR1B10 組細(xì)胞中的MYC、HK2 和PGK1 的表達(dá)顯著降低(圖3B)。利用 Seahorse XP96 分析 si-NC 和 si-AKR1B10 組細(xì)胞的ECAR 和OCR 后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照相比,si-AKR1B10 組細(xì)胞中ECAR 顯著降低,說明AKR1B10 敲低表達(dá)能夠顯著抑制HepG2 細(xì)胞糖酵解(圖3C)。而si-AKR1B10 組細(xì)胞中OCR 增高,說明AKR1B10 敲低表達(dá)能夠顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞的線粒體氧化呼吸(圖3D)。利用試劑盒檢測HepG2 細(xì)胞中丙酮酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照相比,敲低AKR1B10 抑制了HepG2 細(xì)胞中丙酮酸、乳酸、檸檬酸和蘋果酸的產(chǎn)生,說明敲低AKR1B10 可以導(dǎo)致HepG2 細(xì)胞糖酵解過程阻斷(圖3E～H)。以上結(jié)果表明,敲低AKR1B10 可以抑制HepG2 細(xì)胞糖酵解。

圖3 敲低AKR1B10 可以抑制HepG2 細(xì)胞糖酵解

2.4 AKR1B10 通過靶向糖酵解途徑促進(jìn)HCC 細(xì)胞惡性進(jìn)展

為了探究AKR1B10 是否通過靶向糖酵解途徑影響HCC 細(xì)胞惡性進(jìn)展。我們設(shè)置如下分組: oe-NC+DMSO 組、oe-AKR1B10+DMSO 組、oe-AKR1B10 +2-DG 組。qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡分析表明,與對照組相比,過表達(dá)AKR1B10 可以提高細(xì)胞中AKR1B10 的表達(dá)(圖4A、B)。CCK-8 實驗和Transwell 實驗表明,過表達(dá)AKR1B10 使HCC細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力顯著下降;而進(jìn)一步添加2-DG 可以逆轉(zhuǎn)以上過表達(dá)AKR1B10 對HCC 細(xì)胞表型的影響(圖4C～E)。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示過表達(dá)AKR1B10 后細(xì)胞凋亡比例顯著下降,而過表達(dá)AKR1B10 的同時添加2-DG 可以使HCC 細(xì)胞凋亡率回復(fù)到對照組水平(圖4F)。綜上,AKR1B10 通過靶向糖酵解途徑促進(jìn)HCC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,并抑制細(xì)胞凋亡。

圖4 AKR1B10 通過靶向糖酵解途徑促進(jìn)HCC 細(xì)胞惡性進(jìn)展

3 討論

AKR1B 亞群與許多疾病有關(guān),如糖尿病和癌癥。AKR1B10 是AKR1B 中包含的亞組之一[18]。AKR1B10 主要在消化道組織中表達(dá),如胃、小腸和結(jié)直腸。在肝臟、胸腺和前列腺中,表達(dá)可能較低,但在其他正常組織中,表達(dá)為零[18-21]。此外,研究發(fā)現(xiàn),AKR1B10 對包括視黃醛[22]和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物在內(nèi)的底物具有酶活性[23]。

AKR1B10 對腫瘤的發(fā)展是不可或缺的,是一些腫瘤的診斷生物標(biāo)志物[24]。據(jù)報道,AKR1B10高表達(dá)與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較差的預(yù)后相關(guān),同時新輔助化療的反應(yīng)較差,這表明AKR1B10 可能是局部進(jìn)展期癌癥治療反應(yīng)的潛在預(yù)測因子[25]。因此,抑制AKR1B10 可能是一種理想的治療策略[26-27]。最近,一種廣泛用于腫瘤治療的AKR1B10 抑制劑最近引起了越來越多的關(guān)注[28-30]。Jin 等[31]報道AKR1B10 抑制劑增強索拉非尼對肝癌移植瘤的抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)引起了研究人員的注意,并導(dǎo)致AKR1B10 靶向抑制對腫瘤細(xì)胞的不同作用[32-34]。

在本研究中,我們探討了AKR1B10 在HCC 中的作用及其分子機制。我們的結(jié)果表明,AKR1B10 在人HCC 組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào)。此外,沉默AKR1B10 抑制了HCC 細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲,并抑制細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果與Li 等[35]報道的結(jié)果相似,該研究表明AKR1B10 通過激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK) 信號促進(jìn)乳腺癌癥細(xì)胞遷移和侵襲。以上這些結(jié)果提示AKR1B10 在HCC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本研究通過生信分析發(fā)現(xiàn)AKR1B10 高表達(dá)參與糖酵解信號通路。Warburg 等[36]研究發(fā)現(xiàn)即使在充足的氧氣條件下,大多數(shù)腫瘤細(xì)胞也依賴糖酵解途徑來提供能量。有氧糖酵解不僅可以給腫瘤細(xì)胞提供所需的能量,而且可以提供細(xì)胞合成所需的大量中間產(chǎn)物[37-38]。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)癌細(xì)胞的糖酵解速率都有所增加,比正常細(xì)胞高200 倍[39]。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn),線粒體代謝功能失調(diào)被認(rèn)為是癌癥的主要原因[39]。因此,抑制糖酵解成為癌癥治療的新策略。Bai 等[40]研究發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)載體家族25 成員 20 (solute carrier family 25 member 20,SLC25A51) 通過激活沉默調(diào)節(jié)蛋白5 (recombinant sirtuin 5,SIRT5) 的轉(zhuǎn)錄驅(qū)動有氧糖酵解,從而促進(jìn)HCC 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Zhou 等[41]研究發(fā)現(xiàn)三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白4 (guanosine triphosphate binding protein 4,GTPBP4) 通過PKM2 依賴性葡萄糖代謝促進(jìn)HCC 的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)AKR1B10 導(dǎo)致HCC 細(xì)胞的糖酵解水平和糖酵解能力顯著提高,并降低了細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧率和最大耗氧率。由此可知,AKR1B10 過表達(dá)可以通過調(diào)控HCC 細(xì)胞糖酵解,進(jìn)而促進(jìn)HCC 的發(fā)生和發(fā)展。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步驗證了Cui 等[42]和Chen 等[43]的研究,即AKR1B10 可以調(diào)控糖酵解控制HCC 細(xì)胞代謝重編程促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。

綜上所述,本研究表明AKR1B10 在HCC 中顯著上調(diào),AKR1B10 的下調(diào)可顯著抑制HCC 細(xì)胞有氧糖酵解,進(jìn)而抑制HCC 細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。雖然,本研究在實驗設(shè)計和論據(jù)上較為合理,但未從動物和臨床層面上進(jìn)行驗證,且沒有進(jìn)一步挖掘在肝癌中AKR1B10 所影響的下游信號通路及上游調(diào)控分子。因此本團隊擬繼續(xù)挖掘AKR1B10 的下游的信號通路及上游潛在調(diào)控分子,并探究其在HCC 進(jìn)展中的功能。總之,我們的研究加深了我們對HCC 的發(fā)生發(fā)展分子機制的認(rèn)識,這些發(fā)現(xiàn)表明AKR1B10 可能是治療HCC 的新靶點。