劉鵬 ,曹建 ,謝梅芬 ,張映平 ,彭菲

湘潭市中心醫(yī)院1眼科,2體檢中心 湖南省湘潭市,411100

青光眼(glaucoma)是一種由多種因素引起的神經(jīng)退行性疾病,是僅次于白內(nèi)障的第二大致盲疾病[1]。視神經(jīng)萎縮、視野缺損和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)缺失是青光眼的常見表現(xiàn),而病理性眼壓升高是青光眼最重要的危險(xiǎn)因素之一[2]。眼壓的快速升高和降低導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(retinal ischemia reperfusion injury,RIRI),從而導(dǎo)致RGCs 凋亡。盡管機(jī)械損傷、谷氨酸受體激活誘導(dǎo)的興奮性毒性、神經(jīng)營養(yǎng)素剝奪、應(yīng)激反應(yīng)等多種因素可能直接或間接影響線粒體功能障礙導(dǎo)致RGCs 死亡,但青光眼RGCs 凋亡的具體機(jī)制尚不清楚。目前,青光眼的視神經(jīng)損傷已成為青光眼研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。

葛根素(puerarin)是一種C-糖苷類化合物,是常用中草藥葛根[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]的主要衍生物[3]。多項(xiàng)研究報(bào)道,葛根素可顯著提高氧化應(yīng)激過程中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和過氧化氫酶活性,從而增強(qiáng)胰島細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)能力[4]。據(jù)最近報(bào)道,葛根素還對(duì)阿爾茨海默病、帕金森病和腦缺血等各種神經(jīng)疾病發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5],葛根素與其他藥物聯(lián)合治療糖尿病視網(wǎng)膜病變[6]。

視網(wǎng)膜功能先前被描述為對(duì)活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)變化敏感,而線粒體功能障礙引起的氧化應(yīng)激也可能在青光眼發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[7-8]。核轉(zhuǎn)錄因子紅系2 相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2),是細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激和親電子劑攻擊的重要因子,其參與組成和控制氧化應(yīng)激防御的通路,與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病(包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和衰老)有關(guān)[9]。為了實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用,Nrf2與其啟動(dòng)子中的抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidative response element,ARE)結(jié)合,通過啟動(dòng)各種基因(如抗氧化蛋白和Ⅱ期代謝酶)的轉(zhuǎn)錄,保護(hù)細(xì)胞和組織免受氧化損傷[10]。值得注意的是,血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)作為Ⅱ期代謝酶,是一種眾所周知的速率限制酶,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和細(xì)胞保護(hù)特性,可以催化血紅素轉(zhuǎn)化為膽紅素、游離鐵和一氧化碳。更重要的是,Nrf2/HO-1 通路已被發(fā)現(xiàn)廣泛參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的許多組織和器官的損傷,包括心臟、大腦、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)等,它構(gòu)成了最重要的內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)之一[11]。例如,根據(jù)Xu 等[12]的研究,Nrf2 的敲除會(huì)加重RGCs在缺血再灌注中的損傷。此外,Pan 等[13]揭示了蘿卜硫素可以激活Nrf2/HO-1 抗氧化途徑,以減輕視網(wǎng)膜缺血再灌注引起的RGCs 損傷。因此,我們推測Nrf2/HO-1 信號(hào)通路可能在青光眼中起重要作用。

在本研究中,我們旨在確定葛根素對(duì)急性青光眼的緩解作用,并揭示其詳細(xì)機(jī)制。我們的研究結(jié)果表明葛根素通過Nrf2/HO-1 通路改善急性青光眼大鼠的RGCs 損傷,并減輕視網(wǎng)膜病變癥狀。總之,我們目前的結(jié)果可能為未來青光眼的治療提供一種有前景的方法。

1 材料方法

1.1 RIRI 模型的建立

6～8 周齡雄性Sprague Dawley 大鼠購自南通特洛菲飼料科技有限公司。大鼠的喂養(yǎng)和給藥嚴(yán)格遵守視覺和眼科研究協(xié)會(huì)關(guān)于在眼科和視覺研究中使用動(dòng)物的聲明。

通過腹膜內(nèi)注射用100 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉小鼠。手術(shù)前,用0.5 %鹽酸丙美卡因滴眼液局部麻醉小鼠角膜,用1 %托吡卡胺滴眼液擴(kuò)瞳。然后,使用裝有平衡鹽溶液的30 號(hào)針頭將套管插入右眼前房,以將眼壓維持在70 mmHg 達(dá)60 min。在對(duì)側(cè)眼睛進(jìn)行Sham 手術(shù),而不升高眼壓作為對(duì)照。60 min 后,通過拔針使眼壓正?；?然后使用妥布霉素眼膏預(yù)防細(xì)菌感染。

1.2 葛根素和血紅素加氧酶-1(HO-1)抑制劑

葛根素購自Sigma-Aldrich(USA)。在無菌PBS中溶解,儲(chǔ)存濃度為0.1 mol/L,并在4 ℃避光條件中儲(chǔ)存,在制備后2 d 內(nèi)使用。

血紅素加氧酶-1(HO-1)抑制劑Tin protoporphyrin Ⅸ dichloride (SnPP) 購 自 Sigma-Aldrich(USA)。在缺血再灌注前0.5 h 通過腹腔注射SnPP(40 mol/kg,Tocris Bioscience,USA)抑制體內(nèi)HO-1活性,缺血再灌注后連續(xù)3 d 每天注射一次。將SnPP 溶解在0.1 mol/L 的NaOH 中,并用PBS(pH=7.4)稀釋。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將大鼠隨機(jī)分為5 組:正常對(duì)照組(normal)、SnPP 組、I/R 組、葛根素(100 μmol/L)組和葛根素+SnPP 組。I/R、葛根素和葛根素+SnPP 組的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性缺血再灌注。正常對(duì)照組和SnPP 組在不升高眼壓的情況下進(jìn)行假插管,如上所述。SnPP 組或葛根素組大鼠的眼睛在再灌注開始前分別玻璃體內(nèi)注射1 μL 葛根素或SnPP 溶液。葛根素+SnPP組大鼠在再灌注開始前玻璃體內(nèi)注射1 μL 葛根素和1 μL SnPP 溶液。正常對(duì)照組大鼠眼睛玻璃體腔內(nèi)注射1 μL 無菌PBS。

1.4 RGCs 標(biāo)記和存活定量

通過腹腔注射用100 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉小鼠,并將其置于立體定向裝置中。暴露顱骨并用PVP-J 清潔。在上丘表面鉆雙側(cè)孔。將約1 μL 4 %Fluorogold (FG,hydroxystilbamidine;Fluorochrome,USA)溶液注入兩個(gè)上丘。注射后,將微量注射器保持靜止30 s,然后慢慢取出。最后,局部應(yīng)用妥布霉素將切開的頭皮縫合。

為了確保正確的RGCs 標(biāo)記,在殺死動(dòng)物之前,允許動(dòng)物進(jìn)行7 d 的FG 逆行運(yùn)輸。用熒光顯微鏡(Axio Imager,USA)在視網(wǎng)膜內(nèi)鑒定FG 陽性RGCs。使用ImageJ 自動(dòng)計(jì)數(shù)存活的RGCs。

1.5 組織病理學(xué)分析

缺血再灌注治療后7 d,大鼠眼球摘除并包埋在石蠟中。通過視神經(jīng)將每個(gè)石蠟塊切成4 μm 厚。切割每只眼睛的3 個(gè)切片,并用蘇木精和伊紅(H&E)染色。使用Axiovision 軟件(Carl Zeiss MicroImaging Inc.)測量距視神經(jīng)中心1 mm 范圍內(nèi)的(視網(wǎng)膜)內(nèi)網(wǎng)層(inner plexiform layer,IPL)厚度,以量化視網(wǎng)膜損傷。

1.6 RGCs 的原代培養(yǎng)

參考Winzeler 和Wang 等[14]的方法獲得原代RGCs。簡而言之,從新生大鼠身上分離視網(wǎng)膜樣本,制備單細(xì)胞懸浮液。將視網(wǎng)膜懸浮液培養(yǎng)在兔抗鼠巨噬細(xì)胞抗體涂層燒瓶(Cedarlane,USA)和山羊抗鼠巨噬細(xì)胞抗原涂層燒瓶中(Jackson Immunoresearch,USA),以去除粘附的巨噬細(xì)胞。將非粘附細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Thy1.2 單克隆抗體涂層燒瓶(Millipore Chemicon,USA)以收集粘附細(xì)胞。將粘附的RGC與含有補(bǔ)充劑的RGCs 生長培養(yǎng)基在37 ℃、5 %CO2中孵育。

1.7 原代RGCs 與BV2 細(xì)胞共培養(yǎng)

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2(ATCC,USA)與原代RGCs 在DMEM(高糖4.5 g/mL,USA)中共同培養(yǎng),DMEM 補(bǔ)充有10 % FBS,培養(yǎng)條件為37 ℃、5 %CO2。將RGCs 放置在Transwell 室的上部可滲透膜上,BV2 細(xì)胞在處理前在板的下部孔中生長24 h。

1.8 氧-葡萄糖剝奪和再灌注大鼠模型

建立氧-葡萄糖剝奪和再灌注(oxygen glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R)模型:用PBS 洗滌細(xì)胞兩次后,用無葡萄糖DMEM 替換培養(yǎng)基,然后將細(xì)胞放置在模塊化培養(yǎng)箱中,該培養(yǎng)箱充滿5 %CO2和95 % N2的混合氣體,在37 ℃孵育3 h。對(duì)照細(xì)胞在含4.5 g/L d-葡萄糖的無血清培養(yǎng)基中,在常氧條件下(5 % CO2和95 %空氣)孵育3 h。在暴露期結(jié)束時(shí),將細(xì)胞與葡萄糖一起恢復(fù)到常氧條件,并孵育12 h。

1.9 葛根素處理RGCs 細(xì)胞

原代RGCs 在處理前在六孔板或Transwell 板中培養(yǎng)。在OGD/R 或其他測定開始前6 h,以指定濃度將葛根素加入細(xì)胞上清液中。葛根素在DMEM中稀釋,并以0.1～100 μmol/L 的濃度加入。

1.10 ELISA

在BV2 細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中測定細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β。使用ELISA 試劑盒(eBioscience,Austria)進(jìn)行分析。使用OxiSelect 硝基酪氨酸免疫印跡檢測試劑盒(Cell Biolabs,Inc.,USA)測量視網(wǎng)膜勻漿中3-硝基酪氨酸蛋白的水平。

1.11 RGCs 細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡測定

使用CCK8 測定試劑盒(Beyotime Biotechnology,China) 測量梯度濃 度(0、0.1、1、10、50、100 μmol/L)葛根素處理的RGCs 細(xì)胞的細(xì)胞活力。

使用碘化丙啶(PI)和Annexin V-FITC 檢測試劑盒(BD Biosciences,New York,USA)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測OGD/R 誘導(dǎo)的RGCs 凋亡。使用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡數(shù)量。

1.12 SnPP 處理細(xì)胞

將細(xì)胞以大約70 %的融合度接種在六孔板中。將10 μmol/L SnPP 加入培養(yǎng)基中6 h。然后用葛根素處理細(xì)胞6 h,并進(jìn)行OGD/R。

1.13 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的檢測

使用熒光探針2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA;KeyGEN,China),通過熒光檢測和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 積累進(jìn)行定量。對(duì)原代RGCs進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?然后在37 ℃的黑暗中用10 μmol/L DCFH-DA 溶液孵育20 min。孵育后,在30 min 內(nèi)分析細(xì)胞。使用熒光顯微鏡測量ROS 的平均熒光強(qiáng)度,并使用Fortessa 系統(tǒng)(BD)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。使用ImageJ 和FlowJo 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.14 qRT-PCR

通過Trizol 法進(jìn)行總RNA 提取,PrimeScript RT Reagent Kit(Takara,Japan)用于cDNA 合成,隨后,使用SYBR Green PCR Kit(Takara,Japan)進(jìn)行qRTPCR 分析檢測基因表達(dá),β-actin 作為檢測目的基因表達(dá)量的內(nèi)參。使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量(引物參考表1)。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.15 蛋白質(zhì)印跡

從視網(wǎng)膜樣品和培養(yǎng)細(xì)胞中分離總蛋白。使用ProteoExtract?亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組提取試劑盒(Merck Millipore,Germany)提取核蛋白。蛋白質(zhì)在12 %聚丙烯酰胺凝膠上運(yùn)行。將總蛋白和核蛋白的表達(dá)分別標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH,然后使用ImageJ 進(jìn)行定量。所用的主要抗體和稀釋液如下:anti-Nrf2、anti-Ho-1、anti-cleaved-Caspase-8 和anti-GAPDH(Abcam,UK)。

1.16 數(shù)據(jù)分析

本研究所有數(shù)據(jù)表示為平均值±SD,然后使用SPSS17.0 進(jìn)行Bonferroni 事后檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙尾檢驗(yàn),P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對(duì)眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用

為了評(píng)估葛根素在急性青光眼中的作用,在眼壓升高前采用玻璃體內(nèi)注射葛根素。首先研究了3個(gè)處理組大鼠視網(wǎng)膜厚度的變化。與再灌注后7 d的正常視網(wǎng)膜相比,暴露于缺血再灌注的視網(wǎng)膜顯示出IPL 厚度的顯著降低;而葛根素處理的缺血再灌注視網(wǎng)膜顯示出IPL 厚度的顯著提高,改善了視網(wǎng)膜損傷(圖1A～B)。RGCs 的不可逆凋亡是視網(wǎng)膜功能損傷的另一個(gè)重要指標(biāo)。

圖1 葛根素對(duì)眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用

FG 分析表明,與對(duì)照組大鼠相比,再灌注后7 d,實(shí)驗(yàn)大鼠的RGCs 數(shù)量減少(圖1C)。玻璃體內(nèi)注射葛根素顯著降低了視網(wǎng)膜損傷的嚴(yán)重程度和RGCs 死亡的程度(圖1C)。先前的研究表明,包括ROS、TNF-α 和IL-1β 在內(nèi)的神經(jīng)毒性介質(zhì)的過量產(chǎn)生和積累在RGCs 細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[11-13]。如圖1D 所示,與對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜相比,再灌注后24 h,整個(gè)視網(wǎng)膜中硝基酪氨酸(ROS 的蛋白質(zhì)衍生物)的產(chǎn)生顯著增加,而在葛根素處理的視網(wǎng)膜中則有所下降。此外,玻璃體內(nèi)注射葛根素顯著抑制了TNF-α 和IL-1β mRNA 的表達(dá)(圖1E)。總之,這些數(shù)據(jù)表明葛根素對(duì)高眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。

2.2 葛根素可以減弱OGD/R 誘導(dǎo)的RGCs 細(xì)胞凋亡

接下來,我們進(jìn)行了一系列體外研究,以探索葛根素是否能夠直接抑制RGCs 的凋亡及其潛在機(jī)制。我們首先通過特異性標(biāo)記鑒定了原代培養(yǎng)的RGCs。免疫染色結(jié)果表明,原發(fā)性RGCs 確實(shí)表達(dá)Brn-3a、β3-tubulin 和RBPMS(圖2A)。CCK8 測定法用于檢測葛根素是否能影響細(xì)胞增殖。結(jié)果表明,當(dāng)葛根素濃度達(dá)到50 μmol/L 時(shí),細(xì)胞增殖受到影響(圖2B)。因此,我們選擇0.1～10 μmol/L 的濃度范圍進(jìn)行后續(xù)的體外研究。然后,我們將原發(fā)性RGCs 暴露于OGD/R,以在體外細(xì)胞模型中有效模擬高眼壓誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷[15-16]。OGD/R降低了細(xì)胞活力,葛根素(0.1～10 μmol/L)處理顯著增加了存活的RGCs 數(shù)量(圖2C)。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,OGD/R 暴露后加入葛根素處理顯著減少了凋亡細(xì)胞(PI+Annexin V+)的數(shù)量(圖2D)。葛根素濃度范圍為1 至10 μmol/L,被發(fā)現(xiàn)在對(duì)OGD/R 發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用方面最有效。此外,通過蛋白質(zhì)印跡分析顯示,葛根素顯著降低cleaved caspase-8 的表達(dá)(圖2E)。這些結(jié)果表明葛根素在體外降低了OGD/R 誘導(dǎo)的RGCs 細(xì)胞凋亡。

2.3 葛根素抑制暴露于OGD/R 的RGCs 中ROS 的產(chǎn)生

免疫熒光結(jié)果顯示,葛根素處理顯著減弱暴露于OGD/R 的RGCs 中ROS 的過量產(chǎn)生(圖3A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,葛根素處理顯著降低了FITC+細(xì)胞(代表具有過量ROS 的細(xì)胞)占據(jù)的峰面積(圖3B)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持葛根素在體外對(duì)RGCs 的抗氧化作用。

圖3 葛根素處理對(duì)暴露于OGD/R 的RGCs 中ROS 產(chǎn)生的影響

2.4 葛根素通過Nrf2/HO-1 信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)RGCs 細(xì)胞凋亡的影響

上述結(jié)果表明,葛根素的抗氧化作用主要參與葛根素對(duì)RGCs 的保護(hù)作用。Nrf2 是一種轉(zhuǎn)錄因子,被認(rèn)為是細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。因此,我們接下來確定了Nrf2 及其下游信號(hào)因子HO-1 是否與葛根素對(duì)RGCs 細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用有關(guān)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,葛根素(10 μmol/L)處理顯著誘導(dǎo)了OGD/R 條件下RGCs 中Nrf2 的表達(dá)(圖4A)。與對(duì)照組相比,葛根素處理也增加了HO-1 蛋白的表達(dá)(圖4B)。

為了進(jìn)一步證實(shí)Nrf2/HO-1 信號(hào)在葛根素介導(dǎo)的RGCs 神經(jīng)保護(hù)中的作用,使用HO-1 抑制劑SnPP 進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,SnPP 治療部分逆轉(zhuǎn)了葛根素對(duì)RGCs 的神經(jīng)保護(hù)作用(圖4C、D)。SnPP 部分抑制了葛根素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS 的減少(圖4E、F)?？傊?這些數(shù)據(jù)表明葛根素通過Nrf2/HO-1 依賴性機(jī)制對(duì)RGCs 細(xì)胞的保護(hù)。

2.5 Nrf2/HO-1 信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)葛根素的體外抗炎作用

我們進(jìn)行了一系列體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估葛根素的抗炎作用并確定其潛在機(jī)制。在OGD/R 條件下培養(yǎng)BV2 細(xì)胞(小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系)。在OGD/R 之前,將BV2 細(xì)胞在添加或不添加葛根素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h。使用ELISA 試劑盒檢測OGD/R 后BV2 細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-1β 的濃度。葛根素可以抑制OGD/R 誘導(dǎo)的TNF-α 和IL-1β 的過量產(chǎn)生(圖5A)。

圖5 Nrf2/HO-1 信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)葛根素介導(dǎo)的體外抗炎作用的影響

qRT-PCR 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了葛根素的抗炎作用(圖5B)。我們進(jìn)一步評(píng)估Nrf2/HO1 信號(hào)通路是否也參與葛根素介導(dǎo)的抗炎作用。如圖5C、D 所示,在OGD/R 條件下,葛根素顯著誘導(dǎo)了Nrf2 的表達(dá)升高,并增加了BV2 細(xì)胞中HO-1 的蛋白表達(dá)。我們的結(jié)果表明,SnPP 部分逆轉(zhuǎn)了葛根素介導(dǎo)的TNF-α 和IL-1β 產(chǎn)生的抑制作用(圖5E、F)。這些結(jié)果表明葛根素通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1 信號(hào)傳導(dǎo),從而在體外發(fā)揮抗炎作用。

2.6 葛根素通過Nrf2/HO-1 信號(hào)保護(hù)RGCs 損傷

我們的體外研究表明,Nrf2/HO-1 信號(hào)傳導(dǎo)在葛根素介導(dǎo)的抗氧化和抗炎作用中起著關(guān)鍵作用。我們進(jìn)一步研究Nrf2/HO-1 信號(hào)傳導(dǎo)是否也參與葛根素介導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷的神經(jīng)保護(hù)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,葛根素處理顯著誘導(dǎo)了Nrf2 的表達(dá)提高,并增加了視網(wǎng)膜中HO-1 的表達(dá)(圖6A、B)。

圖6 葛根素通過Nrf2/HO-1 信號(hào)保護(hù)高眼壓誘導(dǎo)的RGCs 損傷

在缺血再灌注前0.5 h 腹膜內(nèi)注射SnPP(40 mol/kg),在缺血再灌注后3 d 每天注射一次。HO-1抑制劑的治療顯著阻斷了葛根素對(duì)高眼壓導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷的神經(jīng)保護(hù)作用(圖6C、D)。HO-1 抑制劑還顯著降低了葛根素對(duì)ROS 積累和炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用(圖6E、F、G)。這些發(fā)現(xiàn)表明,葛根素對(duì)高眼壓導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷的神經(jīng)保護(hù),可能是通過激活Nrf2/HO-1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3 討論

急性青光眼包括一系列癥狀多樣、預(yù)后不理想的異質(zhì)性疾病[17]。盡管急性青光眼的詳細(xì)發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,但越來越多的證據(jù)表明,高眼壓、氧化應(yīng)激增加、神經(jīng)炎癥和RGCs 的不可逆凋亡促進(jìn)了急性青光眼的發(fā)展,并導(dǎo)致最終的視力下降,從而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[18]。然而,急性青光眼的治療方法十分有限,目前可以恢復(fù)視力的有效治療方法還未見報(bào)道。因此,防止視網(wǎng)膜損傷的發(fā)生,并開發(fā)有效和可信的治療策略仍迫在眉睫。

葛根素是一種天然類黃酮,是從葛根中提取的主要類黃酮化合物,對(duì)許多人類疾病具有潛在的治療作用[19-20]。據(jù)報(bào)道,葛根素可以通過抑制體內(nèi)大鼠海馬細(xì)胞凋亡來減輕淀粉樣蛋白-β 誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙[21]。此前有研究報(bào)道葛根素可以防止大鼠肝臟氧化應(yīng)激介導(dǎo)的DNA 損傷和鉛誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[22]。在眼科疾病的研究中,Wei 等[23]報(bào)道葛根素通過色素上皮衍生生長因子誘導(dǎo)的NF-κB 信號(hào)通路抑制新生血管性青光眼小鼠的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平。Xu 等[24]報(bào)道葛根素通過JNK/p38 MAPK途徑減輕N-甲基-D-天冬氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷。本研究表明,葛根素治療顯著改善了高眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷和RGCs 凋亡,視網(wǎng)膜中ROS 和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生顯著減少。葛根素主要通過其抗氧化和抗炎作用發(fā)揮其治療功效,這些結(jié)果與先前的研究一致。另外,本研究還發(fā)現(xiàn)葛根素的抗氧化和抗炎作用可能是通過激活Nrf2/HO-1 通路所致。有趣的是,葛根素治療高眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷導(dǎo)致Nrf2/HO-1 通路的明顯激活,這在葛根素對(duì)高眼壓誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)中可能起著至關(guān)重要的作用。這些發(fā)現(xiàn)表明,葛根素主要通過抗氧化和抗炎特性對(duì)急性青光眼發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 是細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激刺激反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子[25]。在正常條件下,Nrf2 是細(xì)胞質(zhì)中與Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1 的非活性復(fù)合物。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷氧化應(yīng)激時(shí),復(fù)合物被破壞,隨后Nrf2 易位到細(xì)胞核,導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄,包括HO-1,一種關(guān)鍵的血紅素降解酶[26-27]。除了眾所周知的抗氧化特性外,Nrf2/HO-1 信號(hào)通路還具有抗炎和抗凋亡特性[28-29]。在本研究中,證明葛根素處理促進(jìn)了Nrf2的蛋白表達(dá),隨后增加了原代RGCs 和BV2 細(xì)胞中HO-1 的表達(dá)。此外,HO-1 阻斷部分逆轉(zhuǎn)葛根素的抗氧化和抗炎作用。重要的是,HO-1 抑制劑還阻斷了葛根素對(duì)急性青光眼RGCs 的神經(jīng)保護(hù)作用。因此,我們目前的結(jié)果表明,Nrf2/HO-1 信號(hào)傳導(dǎo)至少部分介導(dǎo)葛根素對(duì)急性青光眼的神經(jīng)保護(hù)。

caspase-8 是一種具有良好特征的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)起始物,已被證明具有多種非凋亡功能。Burguillos 等[30]報(bào)道了胱天蛋白酶-8 促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥。先前研究表明,caspase-8 介導(dǎo)免疫細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生,包括IL-1β 和TNF-α,這些細(xì)胞因子在高眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷中發(fā)揮重要作用[15]。在本研究中,我們觀察到葛根素抑制caspase-8 介導(dǎo)的RGCs 凋亡。此外,葛根素在體外減少了caspase-8 依賴性炎性反應(yīng)。

總之,我們的研究證明了葛根素對(duì)急性青光眼大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。我們的結(jié)果表明,葛根素抑制RGCs 細(xì)胞凋亡,可能是通過抑制caspase-8 信號(hào)傳導(dǎo)。此外,我們還發(fā)現(xiàn)Nrf2-HO-1 信號(hào)傳導(dǎo)可能也參與了葛根素對(duì)急性青光眼的神經(jīng)保護(hù),進(jìn)一步確定了葛根素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)提示葛根素可能成為預(yù)防和治療急性青光眼的候選藥物。