毛佩芝 吳紀恒 王龍虎 嚴熒燕 汪志春

1 寧波市婦女兒童醫(yī)院 浙江 寧波 315000

2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院 浙江 杭州 310058

3 浙江大學(xué)藥學(xué)院 浙江 杭州 310058

4 江蘇京蟾生物資源開發(fā)有限公司 江蘇 盱眙 211700

非小細胞肺癌（NSCLC）是目前發(fā)病率和死亡率均排前列的惡性腫瘤[1]。臨床試驗以及實踐證明，中藥在提高放化療效果、改善腫瘤耐藥反應(yīng)、降低術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、延長病人生存期、提升生存質(zhì)量等方面具有明顯的優(yōu)勢[2，3]。蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍（Bufobufo gargarizans）或黑框蟾蜍（BufomelanostictusSchneider）的干燥分泌物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材。研究顯示，蟾酥的主要藥效物質(zhì)是蟾毒配基類成分，其在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)以及減輕癌痛等方面有顯著療效[4，5]。因此，蟾酥及其制劑廣泛用于抗腫瘤，治療肺癌效果尤佳[6-8]。然而蟾酥抗腫瘤的作用機制復(fù)雜，作用靶點尚未明確，加上它又是毒性中藥，其應(yīng)用受到限制[9，10]。因此，探索蟾酥抗腫瘤的結(jié)合靶點及其作用機制，對其精準用藥具有重要意義。

分子對接技術(shù)可以通過算法模擬小分子與受體大分子蛋白之間的結(jié)合作用方式。在計算機輔助藥物設(shè)計中，模擬分子對接是關(guān)鍵步驟，即通過算法預(yù)測藥物分子與靶點結(jié)合互相作用的方式和過程[11]。分子對接技術(shù)在中藥活性成分篩選和靶點確證方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

本文在前期研究的基礎(chǔ)上[12]，采用半柔性分子對接技術(shù)，研究蟾酥有效成分與PARP 蛋白間的相互結(jié)合方式，從結(jié)合自由能、疏水作用、構(gòu)象穩(wěn)定性、結(jié)合親和力等方面探討配體抑制活性的概率，初步探究蟾酥抗腫瘤作用機制。然后，在虛擬分析的基礎(chǔ)上，開展流式細胞術(shù)檢測沙蟾毒精引起的A549 細胞凋亡實驗，并檢測沙蟾毒精給藥后A549 細胞中cleaved PARP 的表達量，以達到與分子對接預(yù)測結(jié)果相互佐證的目的。本文研究的意義在于為蟾酥的精準用藥和新藥開發(fā)提供新的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑：A549和H157細胞由浙江大學(xué)中藥藥理實驗室提供。標準品沙蟾毒精（CAS：464-74-4）、遠華蟾毒精（CAS：472-26-4）、華蟾毒它靈（CAS：1108-68-5）購自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均高于98%。噻唑藍（MTT）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒（中國Biosharp 公司）；PARP 一抗（Abcam 公司，批號：ab227244）；山羊抗兔二抗（Abcam公司，批號：ab7090）。

1.2 儀器：酶標儀（美國BIO-TEK 公司）；FC 500MCL 流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）；化學(xué)發(fā)光成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 軟件和數(shù)據(jù)：Autodock 軟件由美國斯克利普斯研究所開發(fā)，免費授權(quán)。PARP 蛋白晶體結(jié)構(gòu)來源于數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）。三維結(jié)構(gòu)來源于（https：//zinc.docking.org/substances/home/）。軟件運行于Windows操作系統(tǒng)下。相關(guān)軟件均已授權(quán)或免授權(quán)。

2 方法

2.1 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)處理：在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，搜索PARP-1 蛋白（蛋白號：5DS3）晶體結(jié)構(gòu)文件，基源為大腸桿菌。利用Pymol軟件去除水分子和多余的配體，得到PARP-1蛋白結(jié)構(gòu)。之后添加電荷和極性氫原子，應(yīng)用Autodock軟件對小分子化合物進行能量優(yōu)化，檢查可旋轉(zhuǎn)的化學(xué)鍵，另存為pdbqt[Protein Data Bank，Partial Charge（Q），& Atom Type（T）]文件。

2.2 Autodock 分子對接：Autodock 4.2 軟件運行于Windows 系統(tǒng)下，依次加載蛋白晶體結(jié)構(gòu)（受體）和小分子化合物（配體）。用Auto Grid 計算格點能量，采用拉馬克遺傳算法對接運算，用半經(jīng)驗的自由能評價方法評價各配體與蛋白之間的結(jié)合情況。參數(shù)設(shè)置：將參數(shù)“能量最大評價次數(shù)”確定為2500000，運行次數(shù)確定為100，其他參數(shù)為默認設(shè)置。根據(jù)相關(guān)文獻[13]報道，確定蛋白活性口袋的氨基酸殘基和中心點坐標（X、Y、Z）：Gly 863、Ser 904、Tyr 907、Tyr 896、Lys 903 和Arg 878，中心坐標為（30.571，15.384，44.088）。

2.3 PILP 分析：PILP（Protein-Ligand Interaction Profiler）是一個在線的蛋白配體非共價聯(lián)系的分析工具。將Autodock 生成的PDB 文件導(dǎo)入PILP，經(jīng)算法處理，以展示受體與配體之間的非共價鍵作用，包括氫鍵、π-π堆積、疏水作用等。

2.4 細胞培養(yǎng)及MTT檢測：選用第3代至第8代的A549和H157 細胞置于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔12h觀察并記錄細胞生長狀態(tài)1 次，以確保細胞狀態(tài)良好。在細胞培養(yǎng)72h 后，加入MTT 20μL，再孵育4h 后于酶標儀490nm 處測定吸光度值，并計算細胞抑制率。

2.5 Western Blot：將培養(yǎng)的細胞用PBS 沖洗細胞2次，再加入蛋白酶抑制劑和RIPA預(yù)混液，提取A549細胞總蛋白樣本，并檢測蛋白濃度；將蛋白樣本上樣在10%SDS-PAGE 凝膠梳孔中，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗（1∶899）中孵育；過夜后，洗膜，二抗孵育，洗膜；ECL 發(fā)光顯影，凝膠成像儀曝光，拍照，應(yīng)用ImageJ軟件檢測條帶灰度值，將目的條帶灰度值對比內(nèi)參條帶灰度值，得到目的蛋白的相對表達量。

2.6 Annexin V-FITC 檢測細胞凋亡：將對數(shù)生長期細胞用胰酶消化制得懸液并將細胞接種于24 孔板，分組同上。藥物處理24h后消化、離心，預(yù)冷PBS重懸，將細胞密度調(diào)至1×105/mL，1000r/min 離心5min，棄上清，加入500μL 結(jié)合液輕輕重懸細胞，加入5μL Annexin VFITC，輕輕混勻；再加入5μL 碘化丙啶，輕輕混勻，室溫下避光孵育10min，上流式細胞儀檢測。

3 結(jié)果

3.1 分子對接結(jié)果：蟾酥主成分與PARP-1 蛋白靶點對接結(jié)果見表1。對接結(jié)果綜合了半經(jīng)驗化的自由能評價評分抑制常數(shù)值（Ki）參與對接的氨基酸殘基等數(shù)據(jù)。PARP-1 分別與沙蟾毒精、嚏根草配基、嚏根草醇、華蟾毒它靈、遠華蟾毒精、19-氧代華蟾毒它靈和19-氧代華蟾酥毒基相互作用的最低結(jié)合自由能分別為-5.72、-6.47、-6.52、-5.81、-6.25、-6.16、-6.80 KJ/mol。通過拉馬克算法分析，得到了PARP 蛋白（5DS3）和小分子配體的最佳對接方式，如圖1 所示。

圖1 有效成分與PARP-1對接模式圖

表1 蟾酥抗腫瘤活性成分與PARP蛋白的分子對接結(jié)果

3.2 體外活性試驗結(jié)果：為了驗證上述分析結(jié)果，本文選擇其中代表性化合物（沙蟾毒精、遠華蟾毒精和華蟾毒它靈），考察有效成分對癌細胞（A549和H157）的生長抑制作用，如表2所列。試驗結(jié)果表明，它們都能顯著抑制腫瘤細胞的生長，這與虛擬分析的結(jié)論相吻合。

表2 3種活性成分對A549、H157肺癌細胞的抑制作用（±s，n=3）

表2 3種活性成分對A549、H157肺癌細胞的抑制作用（±s，n=3）

IC50（ng/mL）A549 H157沙蟾毒精12.37±3.61 8.89±1.43遠華蟾毒精27.79±17.52 23.72±7.27華蟾毒它靈23.40±4.28 131.32±21.16

與空白對照比較，給藥干預(yù)A549 細胞、H157 細胞72h，各組細胞增殖受到抑制，細胞增殖抑制率隨給藥濃度上升而增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且500ng/mL濃度組增殖抑制效果最佳（圖2）。

圖2 三種化合物對A549、H157細胞的增殖抑制作用

3.3 沙蟾毒精誘導(dǎo)A549 細胞凋亡結(jié)果：我們進一步測試了蟾酥抗腫瘤成分沙蟾毒精誘導(dǎo)A549細胞凋亡的效果。結(jié)果如圖3所示。與對照組（0ng/mL）比較，處理組細胞的凋亡率明顯升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性，其中25ng/mL濃度組細胞凋亡比例最高。

圖3 沙蟾毒精誘導(dǎo)A549細胞凋亡實驗結(jié)果

3.4 誘導(dǎo)PARP 蛋白裂解結(jié)果：圖4 是免疫印跡法探究沙蟾毒精誘導(dǎo)A549 細胞的PARP 蛋白裂解的實驗結(jié)果。由圖4 可知，與對照組（0ng/mL）相比，處理組的cleaved PARP 表達量明顯增加且呈濃度依賴性。分子生物學(xué)實驗結(jié)果與Autodock軟件模擬結(jié)果相一致。

圖4 免疫印跡法測定PARP蛋白的表達量

4 討論

PARP-1 是近年來腫瘤治療的一個熱門靶點，而PARP-1抑制劑能夠靶向抑制DNA損傷修復(fù)過程，體外試驗和臨床試驗均證實PARP-1 抑制劑具有較強的抗腫瘤效果，其已進入臨床使用并取得了一系列令人滿意的療效[14]。由于腫瘤細胞基因組不穩(wěn)定，其存活非常依賴DNA 損傷應(yīng)答修復(fù)機制[15]。PARP-1 最重要的功能是參與堿基切除與修復(fù)，在單鏈DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[16]。PARP 在細胞DNA 損傷后可以被激活，并識別DNA單鏈損傷缺口，最終結(jié)合到缺口上進行修復(fù)。根據(jù)已有文獻[17]報道，蟾酥成分單體能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡抑制其生長。

首先本研究通過Autodock分子對接技術(shù)和PILP分析平臺，模擬并預(yù)測了蟾酥有效成分的抗腫瘤作用靶點。結(jié)合表1 和圖1 所示，沙蟾毒精等7 種化合物均能與PARP-1的NAD+結(jié)合口袋中的部分氨基酸殘基發(fā)生氫鍵、鹽橋等相互作用，且與PARP-1 結(jié)合活性較強，說明這些化合物可能阻斷PARP-1 蛋白對損傷DNA 的修復(fù)作用，并以此發(fā)揮抗腫瘤活性。他們與PARP-1 結(jié)合的差異，在于各種結(jié)合自由能的差異，反映出配體與受體之間具有相當?shù)挠H和力。

其次是結(jié)合的氨基酸殘基種類和結(jié)合方式的不同，由此可能導(dǎo)致最終藥效活性的差異。這7種化合物均屬于蟾毒配基類成分。根據(jù)文獻[13]，對于蟾毒配基類分子的母核而言，在C-17位有α-吡喃環(huán)的甾體A/B順式、C/D順式結(jié)構(gòu)基本骨架對于維持其藥理活性至關(guān)重要。3-OH和5β-OH取代基能夠增加其活性，而C-3位的大取代基則不利于此類化合物的活性，可能是由于3位的大取代基會增大分子的極性。根據(jù)篩選結(jié)果，具有11α-羥基和12-羰基的沙蟾毒精表現(xiàn)出最強的藥理活性，說明此結(jié)構(gòu)特征有利于增強其活性；對于19-氧代華蟾酥毒基、19-氧代華蟾毒它靈和華蟾毒它靈而言，16β-乙酰氧基有利于其分子活性增強；此外，嚏根草醇的C-10位羥甲基；嚏根草配基，19-氧代華蟾毒它靈和19-氧代華蟾酥毒基的C-10位的醛基能夠增強其化合物活性，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[18]，說明相對于蟾酥中的其他成分，我們篩選出的化合物具有對藥效活性更有利的取代基團，使得這些化合物在蟾酥對肺癌細胞產(chǎn)生細胞毒作用。

本研究通過分子對接技術(shù)成功預(yù)測PARP-1 有可能為蟾酥抗肺癌的腫瘤靶點，隨后通過對沙蟾毒精、遠華蟾毒精和華蟾毒它靈進行藥效驗證，證明3種成分具有顯著的肺癌細胞抑制作用。它們在細胞毒活性強弱排序為沙蟾毒精、遠華蟾毒精、華蟾毒它靈。參考已上市的靶向PARP 蛋白的小分子藥物奧拉帕利（Olaparib）對A549 細胞的IC50 值：（13.38±1.2）μg/mL[19]，以及現(xiàn)行質(zhì)量標準中的脂蟾毒配基對A549 細胞的IC50 值：（8.83±2.1）μg/mL[20]。對比實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，本文篩選出的小分子的IC50值顯著低于奧拉帕利和脂蟾毒配基，意味著更強的抑制作用。

最后本研究選擇其中含量最高的沙蟾毒精，探究其對細胞凋亡的作用及誘導(dǎo)PARP蛋白裂解的作用。結(jié)果表明，沙蟾毒精可以顯著誘導(dǎo)PARP蛋白發(fā)生裂解，并誘導(dǎo)A549細胞凋亡，由此抑制腫瘤細胞增殖，該結(jié)果與分子對接預(yù)測結(jié)果相互佐證。