周翔 ,許明山 ,祝波 ,鄭其山 ,鄭育秀

1海南省東方市人民醫(yī)院麻醉科 海南省東方市,572600 2海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科 ?？谑?570311

糖尿病性心肌病是一種糖尿病誘發(fā)的病理生理狀況,可導(dǎo)致心力衰竭,其早期特征是左心室舒張功能障礙、左心室肥大等,晚期會出現(xiàn)明顯的收縮功能降低、心力衰竭[1-2]。這種情況的發(fā)病機制是多因素的,目前認(rèn)為高血糖是主要促進因素[3]。盡管在過去10 年中糖尿病性心肌病的臨床研究數(shù)量呈指數(shù)增長,但尚未就糖尿病性心肌病或糖尿病相關(guān)心衰的最有效預(yù)防或治療方法達成共識。異氟醚是常用的鹵代類吸入麻醉藥,在臨床上已被廣泛使用[4]。越來越多的證據(jù)表明,除了用作麻醉劑外,異氟醚還具有非麻醉生理特性如抗炎癥、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡[5]。異氟醚通過激活脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞中的HO-1 通路來引發(fā)其抗炎活性[6]。磷脂酰肌醇3 激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B,AKT) 信號通路通過控制靶蛋白磷酸化參與細(xì)胞的生長、增殖等過程,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,mTOR) 作為該信號通路的下游靶基因之一,與細(xì)胞的生長過程密切相關(guān)[7]。但異氟醚能否通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR 通路影響高糖誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞損傷尚未報道。本實驗旨在探討異氟醚對高糖誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞損傷及PI3K/Akt/mTOR 通路的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

中國科學(xué)院生命科學(xué)研究院提供H9C2 心肌細(xì)胞。

1.2 主要試劑及儀器

異氟醚(上海瀚思化工有限公司);CCK-8 試劑盒 (默沙克生物科技有限公司);PI3K/Akt/mTOR 通路抑制劑-LY294002、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 (Sigma 公司);p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 一抗(Santa Cruz 公司);Beclin1、p-mTOR、mTOR 一抗(Cell Signaling Technology 公司);B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)蛋白(B lymphocytoma-2 associated protein,Bax) 一抗(Abcam 公司)。Fax-20100 酶標(biāo)儀 (美國INStat 公司);流式細(xì)胞儀(Thermo Fisher Scientific 公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

用含10 %胎牛血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2 心肌細(xì)胞,放置于37 ℃,5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行常規(guī)傳代培養(yǎng),2 d 換一次培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期細(xì)胞,根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果及參考文獻[8-9]進行細(xì)胞處理和分組: 對照組(未處理的H9C2 心肌細(xì)胞)、高糖組(35 mmol/L 葡萄糖);在高糖組的基礎(chǔ)上,分別加入異氟醚、PI3K/Akt/mTOR 通路抑制劑-LY294002 處理,標(biāo)記為異氟醚低濃度組(1 %異氟醚)、異氟醚高濃度組(2 %異氟醚)、異氟醚高濃度+LY294002 組(2 % 異氟醚+50 μmol/L LY294002 共同處理)。

1.4 CCK-8 法檢測各組細(xì)胞增殖情況

收集處理24 h 后的各組細(xì)胞,以2 ×105個/mL 接種至96 孔板中,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行檢測,向每孔中加入10 % CCK-8 溶液,2 h 后,在波長為450 nm 處,用酶標(biāo)儀檢測吸光度(A),按照細(xì)胞增殖率(%)=(實驗組A450nm-空白組A450nm)/ (對照組A450nm-空白組A450nm) ×100 %,得出細(xì)胞增殖率。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集各組細(xì)胞,PBS 洗滌兩次后,加入胰酶消化,懸浮后的細(xì)胞,加入5 μL Annecin Ⅴ-FITC,避光孵育20 min 后,加入10 μL PI 溶液混勻孵育5 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.6 透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞自噬情況

收集各組細(xì)胞,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5 %的戊二醛溶液、1 %鋨酸溶液進行過夜固定,加入濃度不同的丙酮溶液進行梯度脫水,然后分別進行滲透、包埋、切片和染色等常規(guī)操作步驟,最后于透射電子顯微鏡下觀察各組細(xì)胞自噬形態(tài)。

1.7 Western 印跡檢測相關(guān)蛋白表達水平

以RIPA 裂解緩沖液裂解各組細(xì)胞,離心后收集總蛋白,利用BCA 試劑盒對各組蛋白質(zhì)定量,然后以12 % SDS-PAGE 凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)膜、封閉。加入稀釋 (1 ∶2 000) 的p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Beclin1、p-mTOR、mTOR、Bax 一 抗,4 ℃過夜孵育,然后加入稀釋(1∶5 000) 的二抗室溫孵育2 h,顯色、拍照,以GAPDH 為內(nèi)參,ImageJ 軟件分析各個蛋白的灰度值。

1.8 統(tǒng)計分析

SPSS 軟件(22.0 版) 用于統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù),以表示所有數(shù)據(jù),多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗;P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異氟醚對各組H9C2 細(xì)胞增殖率的影響

高糖組H9C2 細(xì)胞增殖率較對照組顯著下降(P＜0.05);與高糖組相比,異氟醚低、高濃度組H9C2 細(xì)胞增殖率顯著增加(P＜0.05);與異氟醚高濃度組相比,異氟醚高濃度+LY294002 組H9C2細(xì)胞增殖率顯著下降(P＜0.05,表1)。

表1 比較異氟醚對各組細(xì)胞增殖率的影響(,n=6)

表1 比較異氟醚對各組細(xì)胞增殖率的影響(,n=6)

與對照組比較,aP＜0.05;與高糖組比較,bP＜0.05;與異氟醚低濃度組相比,c P＜0.05;與異氟醚高濃度組相比,d P＜0.05

2.2 異氟醚對各組H9C2 細(xì)胞凋亡率的影響

高糖組H9C2 細(xì)胞凋亡率較對照組顯著增加(P＜0.05);與高糖組相比,異氟醚低、高濃度組H9C2 細(xì)胞凋亡率顯著下降(P＜0.05);與異氟醚高濃度組相比,異氟醚高濃度+LY294002 組H9C2細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05) (圖1、表2)。

表2 異氟醚對各組細(xì)胞凋亡率的影響(,n=6)

表2 異氟醚對各組細(xì)胞凋亡率的影響(,n=6)

與對照組相比,aP＜0.05;與高糖組相比,bP＜0.05;與異氟醚低濃度組相比,c P＜0.05;與異氟醚高濃度組相比,d P＜0.05

2.3 透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞自噬形態(tài)

高糖組明顯可見形成的自噬小體;與高糖組相比,異氟醚低、高濃度組H9C2 細(xì)胞中自噬小體逐漸減少;與異氟醚高濃度組相比,異氟醚高濃度+LY294002 組H9C2 細(xì)胞中自噬小體顯著增加(圖2)。

圖2 各組細(xì)胞自噬形態(tài)(×10 000)

2.4 異氟醚對各組H9C2 細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)蛋白的影響

高糖組H9C2 細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 表達水平較對照組顯著下降(P＜0.05);與高糖組相比,異氟醚低、高濃度組H9C2 細(xì)胞 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 顯著增加(P＜0.05);與異氟醚高濃度組相比,異氟醚高濃度+LY294002 組H9C2 細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 顯著下降(P＜0.05,表3、圖3)。

圖3 H9C2 細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)蛋白Western 印跡圖

表3 各組H9C2 細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)蛋白的比較(,n=6)

表3 各組H9C2 細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)蛋白的比較(,n=6)

與對照組相比,aP＜0.05;與高糖組相比,bP＜0.05;與異氟醚低濃度組相比,cP＜0.05;與異氟醚高濃度組相比,dP＜0.05

2.5 異氟醚對各組H9C2 細(xì)胞中自噬、凋亡相關(guān)蛋白的影響

高糖組H9C2 細(xì)胞Bax、Beclin1 較對照組顯著增加(P＜0.05);與高糖組相比,異氟醚低、高濃度組H9C2 細(xì)胞Bax、Beclin1 顯著下降 (P＜0.05);與異氟醚高濃度組相比,異氟醚高濃度+LY294002 組H9C2 細(xì)胞Bax、Beclin1 顯著增加(P＜0.05,圖4、表4)。

圖4 H9C2 細(xì)胞中Bax、Beclin1 蛋白Western 印跡圖

表4 各組H9C2 細(xì)胞中Bax、Beclin1 蛋白的比較(,n=6)

與對照組相比,aP＜0.05;與高糖組相比,bP＜0.05;與異氟醚低濃度組相比,cP＜0.05;與異氟醚高濃度組相比,dP＜0.05

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病患者在沒有高血壓心臟病、冠狀動脈疾病和瓣膜性心臟病的情況下,產(chǎn)生的微血管病變、心肌間質(zhì)增生、心肌代謝紊亂等特異性疾病[10]。研究表明氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎性反應(yīng)、糖尿病微血管病、自噬、心肌代謝異常和細(xì)胞凋亡與糖尿病心肌病的發(fā)展有關(guān)[11]。糖尿病心肌病已被確認(rèn)為糖尿病患者住院和死亡的主要原因。盡管糖尿病分子病因?qū)W取得了進展,但目前的治療方法未能預(yù)防糖尿病患者產(chǎn)生的特異性疾病,因此探尋新治療策略顯得尤為重要[12]。

異氟醚屬于一種鹵代烴類吸入麻醉劑,在臨床上已被廣泛使用。在宮頸癌U14 細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)異氟醚可以抑制宮頸癌細(xì)胞增殖,誘發(fā)其凋亡[13]。在氯化鉀誘導(dǎo)的老年2 型糖尿病大鼠模型中,異氟醚以劑量依賴性方式抑制KCl 誘導(dǎo)的主動脈血管收縮[14]。Lin 等[15]研究發(fā)現(xiàn)異氟醚預(yù)處理抑制了視網(wǎng)膜中NLRP3 炎性體的活化,可以在中風(fēng)引起的糖尿病視網(wǎng)膜損傷中提供實質(zhì)性的視網(wǎng)膜保護。葡萄糖毒性引起的胰腺β 細(xì)胞損傷是2 型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM) 的一個重要因素,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致β 細(xì)胞功能障礙和胰島素抵抗的原因,研究發(fā)現(xiàn)異氟醚通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕葡萄糖誘導(dǎo)的大鼠胰島β 細(xì)胞凋亡,可能作為糖尿病的潛在療法[16]。但異氟醚對于糖尿病心肌病的研究尚未報道,本研究發(fā)現(xiàn)高糖組細(xì)胞增殖率顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著增加。經(jīng)不同濃度的異氟醚處理后,細(xì)胞增殖率顯著增加,細(xì)胞凋亡率顯著降低,提示異氟醚可能抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞凋亡,避免細(xì)胞受損,但具體機制需進一步探索。

研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 通路參與心肌細(xì)胞的保護,mTOR 作為PI3K/AKT 通路的下游靶因子,參與細(xì)胞生長、蛋白質(zhì)合成等多種生物學(xué)過程,其中饑餓和缺氧、生長因子等均是其上游刺激因素,另外mTOR 通路與脂質(zhì)合成、自噬、線粒體功能等密切相關(guān)[17-18]。在高糖心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中[19],通過PI3K/Akt/mTOR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化可以抑制自噬,減少細(xì)胞受損。另外,趙瑞翔等[20]研究發(fā)現(xiàn)在高糖誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞中,下調(diào)miR-1 可以活化PI3K/Akt/mTOR 通路,減少細(xì)胞自噬。本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 顯著降低,自噬及凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Beclin1) 表達顯著增加,自噬小體增加。經(jīng)異氟醚處理后,增加了p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 水平,降低了自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達,表明異氟醚可以通過激活PI3K/Akt/mTOR 通路,降低細(xì)胞自噬和凋亡,改善細(xì)胞損傷。為進一步驗證該猜想,本實驗引入PI3K/Akt/mTOR 通路抑制劑-LY294002,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LY294002 可以消弱異氟醚對高糖誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞損傷的保護作用。

綜上所述,異氟醚通過激活PI3K/Akt/mTOR通路可以抑制細(xì)胞凋亡、自噬,改善高糖誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞受損,為治療糖尿病心肌病提供潛在方案,但后續(xù)仍需通過動物實驗進行深入研究。