劉麗嫻, 郭 栗, 楊官品

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)及其在微藻中的應(yīng)用

劉麗嫻, 郭 栗, 楊官品

(中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003)

微藻是單細胞光合原生生物的統(tǒng)稱。微藻富含高價值的產(chǎn)物, 如蛋白質(zhì)、DHA、蝦青素等, 廣泛用于食品、保健品、化妝品和飼料生產(chǎn)?；蚓庉嫾夹g(shù)是微藻遺傳學(xué)研究和遺傳改良的新工具。目前, 廣泛使用的基因編輯技術(shù)有鋅指蛋白-核酸酶系統(tǒng)(zinc-finger nucleases system, ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)蛋白-核酸酶系統(tǒng)(transcription activator-like effector nucleases system, TALEN)和成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)(CRISPR)-CRISPR合作蛋白系統(tǒng)[clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas) system], 簡稱CRISPR/Cas系統(tǒng)。ZFN和TALEN融合了DNA特定序列識別蛋白和核酸內(nèi)切酶, 需要根據(jù)擬識別DNA序列修改識別蛋白氨基酸序列, 過程繁瑣, 效率低, 而CRISPR/Cas系統(tǒng)操作簡便, 只需設(shè)計擬識別DNA序列小引導(dǎo)RNA即可, 編輯效率高, 可同步編輯多個基因。目前, 已有編輯干擾、編輯激活、編輯敲除、編輯插入等衍生系統(tǒng), 還有引導(dǎo)編輯、堿基編輯等, 也可以編輯RNA分子。CRISPR/Cas在微藻中應(yīng)用廣泛。本文綜述了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在微藻中的應(yīng)用現(xiàn)狀。

微藻; 基因編輯; CRISPR/Cas9系統(tǒng)

成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)于1987年在大腸桿菌中首次被發(fā)現(xiàn)[1-4]。之后陸續(xù)在許多細菌中也發(fā)現(xiàn)了CRISPR序列, 并逐漸闡明了其生物學(xué)意義。CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛用于動植物遺傳育種, 微生物工程, 合成生物學(xué)等研究, 并在不斷改進, 以滿足多樣化的研究和應(yīng)用需求。近年來, CRISPR/Cas9系統(tǒng)在微藻中的應(yīng)用越來越多。本文簡要介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng), 重點綜述了CRISPR/ Cas9系統(tǒng)在微藻中的應(yīng)用, 以期為微藻的相關(guān)研究提供參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列由前導(dǎo)、重復(fù)和間隔序列構(gòu)成。前導(dǎo)序列長20～534 bp, 腺嘌呤和胸腺嘧啶含量高, 是CRISPR的啟動子[5-6]。重復(fù)序列長21～48 bp, 其轉(zhuǎn)錄本可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)[7-8]。間隔序列各異, 長26～72 bp, 是免疫外源DNA的效應(yīng)序列。病毒或外源DNA的部分序列可插入到CRISPR引導(dǎo)序列端, 形成新的間隔序列。當(dāng)相應(yīng)的病毒或外源DNA再次入侵時, CRISPR便會發(fā)揮免疫作用[5, 7, 9-11]。

CRISPR合作蛋白Cas的編碼基因位于CRISPR基因附近[5]。CRISPR和Cas協(xié)同發(fā)揮作用, 使細菌免疫有特定間隔序列的病毒或外源DNA的效應(yīng)序列, 防止入侵。CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫過程分為適應(yīng)、表達和干擾3步, 參與的蛋白各異。表1列出適應(yīng)過程Cas1和Cas2將入侵的DNA片段整合到CRISPR基因座中, 進入表達步驟, CRISPR被轉(zhuǎn)錄成前體crRNA (pre-crRNA), 前體crRNA結(jié)合到Cas蛋白上并經(jīng)RNase切割, 最終形成成熟的crRNA (CRISPR RNA)。當(dāng)外源DNA再次侵入時, 干擾步驟發(fā)揮作用, crRNA與外源DNA互補, Cas蛋白行使核酸酶功能切割外源DNA[1, 12-14], 實現(xiàn)免疫。CRISPR/ Cas系統(tǒng)存在于約一半已測序細菌基因組和幾乎所有的古細菌基因組中。但在真核生物和病毒中卻不存在[5, 8, 11, 15-16]。

表1 CRISPR/Cas系統(tǒng)分類及其特征[17-18]

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

Sapranauskas等[19]證明嗜熱鏈球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)可轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中發(fā)揮免疫作用, 保護轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染的噬菌體。2012年, 雙RNA分子被發(fā)現(xiàn)可引導(dǎo)Cas9切割細菌基因組任意位置[20], Cas9的可操縱性和編輯功能在許多生物中通用, 僅需改變與靶DNA互補結(jié)合的引導(dǎo)RNA分子。這種高效、通用的系統(tǒng)迅速獲得許多研究者的青睞, 他們也因此獲得2020年諾貝爾化學(xué)獎。這一劃時代的發(fā)現(xiàn)推動了各種生物的基因編輯進程。

常用的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)屬于Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)。參與CRISPR/Cas作用的各組分如下: (1) crRNA。crRNA5′端的20個核苷酸各不相同, 結(jié)合不同的靶DNA。該部分由外源的DNA序列插入CRISPR序列的間隔區(qū), 先轉(zhuǎn)錄形成pre-crRNA, 再切割成crRNA[12, 21]。(2) tracrRNA(-activating crRNA)。tracrRNA通過RNase Ⅲ觸發(fā)pre-crRNA加工, 隨后通過Cas9激活crRNA引導(dǎo)的靶DNA切割[20-21](圖1a)。(3) sgRNA(single guide RNA)。crRNA和tracrRNA連接, 形成長約100 bp的單分子引導(dǎo)RNA[22], GC含量約40%～60%[23](圖1b)。(4) Cas9蛋白。Cas9蛋白是2個RNA引導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶。Cas9有2個結(jié)構(gòu)域。HNH結(jié)構(gòu)域切割與crRNA互補的DNA鏈, RuvC結(jié)構(gòu)域切割非互補DNA鏈[20]。Cas9識別crRNA互補的20 bp DNA序列和三核苷酸[12]。(5) PAM(protospacer-adjacent motif)序列。PAM序列與目的基因常為NGG, 是Cas9核酸酶特異性識別位點。PAM序列對間隔區(qū)的選擇有CRISPR類型特異性[24]。質(zhì)粒DNA會在PAM序列上游3個堿基對的位置切割并產(chǎn)生平末端。而短線型雙鏈DNA, 與crRNA序列互補的目的基因DNA鏈在PAM序列上游3個堿基對的位置被切割, 非互補DNA鏈在PAM上游的3～8個堿基對內(nèi)的1個或多個位點被切割。非互補DNA鏈?zhǔn)紫缺缓怂醿?nèi)切酶切割, 隨后被3′-5′端的外切核酸酶切割[20]。PAM序列在平均每 16 個堿基中出現(xiàn)1次, 限制了可以建立的目標(biāo)數(shù)量[25]。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割原理

3 微藻中CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用

2014年, CRISPR/Cas9技術(shù)首次在微藻中成功應(yīng)用。Jiang等[26]將sgRNA和Cas9基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻, 證明Cas9和sgRNA在萊茵衣藻中能正常發(fā)揮作用, 介導(dǎo)靶向基因修飾。表達CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化進藻細胞后, sgRNA與目標(biāo)DNA結(jié)合, 引導(dǎo)Cas9切割DNA, 產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂(double strand break, DSB)。DSB經(jīng)過非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)或同源重組修復(fù)(homologous recombination, HR), 引入插入或缺失, 敲除基因(基因失活)。若外源DNA和表達CRISPR/Cas構(gòu)建物同時轉(zhuǎn)化, 則可插入編輯的基因[27]。可根據(jù)不同目的設(shè)計特定的sgRNA, 獲得編輯藻株或轉(zhuǎn)化藻株。Cas9和sgRNA也可以純化后融合成復(fù)合物, 轉(zhuǎn)化進細胞, 實現(xiàn)編輯。

實現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯的微藻越來越多。表2根據(jù)Cas9的表達位置, 可以將微藻CRISPR/Cas9基因編輯的方式可以分為3類: (1) Cas9基因整合到微藻基因組中發(fā)揮功能, 常用細菌質(zhì)粒為構(gòu)建物進行轉(zhuǎn)化。(2) Cas9以游離蛋白方式在微藻基因組中發(fā)揮功能, 通常是先形成核糖核蛋白復(fù)合體(Cas9-gRNA ribonucleoprotein)再導(dǎo)入微藻細胞。(3) 構(gòu)建游離的附加體(episome)轉(zhuǎn)入微藻細胞。附加體上Cas9和gRNA表達后發(fā)揮功能, 但附加體不整合進基因組, 去除抗生素選擇壓后, 附加體因生物稀釋而消失, 如圖2所示。

注: A, 以細菌質(zhì)粒為擴增方法構(gòu)建Cas9基因和gRNA表達構(gòu)建物, 整合進微藻基因組, 組成型表達; B, 合成和純化Cas9和gRNA, 形成核糖核蛋白復(fù)合物, 瞬時發(fā)揮功能; C, 以episome為載體構(gòu)建Cas9和gRNA表達構(gòu)建物轉(zhuǎn)入微藻, 但不整合進基因組, 基因表達后瞬時發(fā)揮作用, 去除抗生素選擇壓, 附加體因生物稀釋而消失。

3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因組整合-細菌質(zhì)粒載體構(gòu)建物轉(zhuǎn)化

細菌質(zhì)粒是常用的表達Cas9-gRNA基因的構(gòu)建物。質(zhì)粒是細菌體系, 構(gòu)建方便, 分子量小, 在植物、動物等的基因工程研究中使用廣泛。在微藻中應(yīng)用CRISPR/Cas系統(tǒng), 要用細菌質(zhì)粒為框架, 構(gòu)建Cas9-gRNA基因表達構(gòu)建物, 把Cas9基因和sgRNA單元表達元件集中在同一質(zhì)?；虿煌|(zhì)粒上, 用合適的轉(zhuǎn)化方法, 將細菌質(zhì)粒構(gòu)建物(重組質(zhì)粒)轉(zhuǎn)入微藻細胞并整合在微藻基因組DNA中, 實現(xiàn)Cas9蛋白基因和sgRNA的組成型表達(圖2A)。

2014年, Jiang等[26]構(gòu)建CRISPR/Cas9細菌質(zhì)粒構(gòu)建物, 實現(xiàn)萊茵衣藻內(nèi)源基因靶向敲除。這是CRISPR/Cas9技術(shù)在微藻中的首次應(yīng)用。雖然獲得了突變體, 但是萊茵衣藻的編輯效率并不很高。為了提高萊茵衣藻的編輯效率, 2017年, 該研究團隊又將sgRNA表達組件插入Cas9基因的內(nèi)含子中, 實現(xiàn)兩個成員共享一套表達控制元件, 使萊茵衣藻的編輯效率提高50倍[28]。

在微藻中, CRISPR/Cas9技術(shù)是新興的技術(shù), 需要通過對已知基因的編輯, 證明其可行性。Lin等[29]首次在小球藻中實現(xiàn)CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用, 他們把表達Cas9和sgRNA的細菌質(zhì)粒構(gòu)建物轉(zhuǎn)化進小球藻(), 敲除其3(omega-3 fatty acid desaturase, ω-3脂肪酸去飽和酶)基因, 突變株與野生型相比, 染色后脂質(zhì)積累熒光增加了67%。Ortega- Escalante等[30]將表達sgRNA和Cas9基因的細菌質(zhì)粒構(gòu)建物首次轉(zhuǎn)入團藻()細胞, 獲得了發(fā)育基因(gonidialess A, 無性腺A)基因缺陷突變株, 驗證了CRISPR/Cas9技術(shù)在團藻基因編輯中的可行性。三角褐指藻()是硅藻的研究模式藻。Nymark等[31]構(gòu)建含CRISPR/Cas9系統(tǒng)的細菌質(zhì)粒構(gòu)建物并轉(zhuǎn)化進三角褐指藻, 是CRISPR/ Cas9在硅藻中的首次嘗試, 獲得(chloroplast signal recognition particle 54, 葉綠體信號識別因子54)基因缺陷的突變藻株, 突變體對強光敏感。

CRISPR/Cas9技術(shù)編輯微藻已知基因成功后, 就可以用來研究微藻未知基因功能功能, 獲得有益突變株。Vogler等[32]將編碼Cas9-GFP融合蛋白基因的細菌質(zhì)粒構(gòu)建物轉(zhuǎn)入微擬球藻()細胞, 獲得了β-葡萄糖合成酶和糖基化酶基因缺陷的突變株, 突變株中不溶于甲醇的水溶性碳水化合物積累減少但無生長缺陷, β-葡聚糖合酶基因的敲除可導(dǎo)致細胞自發(fā)熒光顯著變化。Slattery等[33]和Hopes等[34]分別利用CRISPR/Cas技術(shù)靶向敲除三角褐指藻和假微型海鏈藻的urease(脲酶)基因, 突變株無法利用尿素作為生長的氮源, 藻細胞生長量降低, 藻細胞尺寸減小。

另外, 因Cas9組成型表達對某些藻類, 如萊茵衣藻, 有毒性。因此, 誘導(dǎo)型啟動子的應(yīng)用可解決Cas9的毒性問題[26, 35]。

3.2 Cas9蛋白基因和sgRNA瞬時表達

附加體(episome)類似質(zhì)粒, 通常比細菌質(zhì)粒大, 在微藻中有一定程度的自我復(fù)制能力, 是真核生物染色體外遺傳結(jié)構(gòu)。與細菌質(zhì)粒構(gòu)建物的最大區(qū)別是, episome不整合到基因組中。在微藻中轉(zhuǎn)化含CRISPR/Cas9系統(tǒng)的episome構(gòu)建物, 可發(fā)揮編輯作用但不整合到宿主基因組中, 在去除抗生素選擇壓后, 因生物稀釋作用, 附加體隨微藻繁殖而逐漸消失[36](圖2C)。目前, 在微擬球藻和三角褐指藻中, 微藻附加體構(gòu)建物均有應(yīng)用。

Wang等[37]通過構(gòu)建含有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的附加體, 實現(xiàn)微擬球藻30號染色體中精確連續(xù)切除約10 kb的大片段。缺失大片段的突變株生長與野生型相比沒有顯著變化。因此, 用此方法可得到最小的微擬球藻功能基因組(底盤基因組)。Poliner等[38]構(gòu)建有抗生素選擇標(biāo)記和有CRISPR系統(tǒng)的附加體構(gòu)建物,CRISPR/Cas9系統(tǒng)可精確地在微擬球藻目標(biāo)位置產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂, 引入插入突變, 去除抗生素選擇壓力后, 消除附加體, 從而產(chǎn)生無標(biāo)記的非轉(zhuǎn)基因藻株。Moosburner等[39]將人工構(gòu)建的episome(Cas9-ShBle: sgRNA)轉(zhuǎn)化到含有Pta-MOB質(zhì)粒的大腸桿菌中, 再通過細菌轉(zhuǎn)染將episome轉(zhuǎn)入三角褐指藻, 實現(xiàn)單基因和多基因敲除, 效率分別是48%和25%。

利用構(gòu)建附加體方式進行CRISPR/Cas9基因編輯, 不整合到基因組中, 能產(chǎn)生定點突變并可以避免Cas9基因?qū)υ寮毎拈L期毒害。但是, 構(gòu)建附加體方式在微藻中應(yīng)用不多, 大多都是在模式微藻中進行的。

3.3 核糖核蛋白復(fù)合體(Ribonucleoproteins, RNP)直接導(dǎo)入

RNP直接導(dǎo)入是將Cas9蛋白體外表達純化并與sgRNA融合形成RNP復(fù)合物后, 將RNP共同導(dǎo)入細胞(圖2B)。復(fù)合物的直接導(dǎo)入需充分考慮半衰期、轉(zhuǎn)化效率等問題[40]。對于低等植物和單細胞生物, RNP直接導(dǎo)入成功率高。微藻是單細胞低等生物, RNP直接導(dǎo)入非常適合在微藻中使用。有研究表明, 萊茵衣藻轉(zhuǎn)化Cas9基因表達靶向敲除低效率可能是載體驅(qū)動的Cas9基因長期在細胞內(nèi)表達誘導(dǎo)的毒性造成的[41]。RNP直接轉(zhuǎn)入瞬時表達, 可以避免Cas9基因表達相關(guān)的細胞毒性效應(yīng)和脫靶效應(yīng)。

2016年, Shin等[41]將Cas9蛋白和sgRNA復(fù)合體導(dǎo)入萊茵衣藻, 證明這種方法顯著提高了CRISPR/ Cas9系統(tǒng)在衣藻中的誘變效率和特異性, 與轉(zhuǎn)化含Cas9基因的質(zhì)粒相比, 靶向突變效率提高了100倍, 能最大限度減少脫靶, 同時降低Cas9蛋白毒性。

同步敲除萊茵衣藻已知功能的(色氨酸合酶β亞基基因)、(葉綠體SRP43觸角組裝基因)和(葉綠素生物合成基因), 可建立基于5-氟吲哚和利用菌落顏色的篩選方法[41]。將RNP導(dǎo)入膠球藻(sp), 敲除了(葉綠體信號識別因子基因), 藻落呈淡綠色[42]。靶向敲除微綠藻()(硝酸還原酶基因)和(類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因), 獲得基因“功能喪失”敲除藻株[43], 突變株不能利用硝酸鹽作為氮源。Serif等[44]鑒定并用RNP敲除了三角褐指藻2個內(nèi)源性標(biāo)記基因和光感受器轉(zhuǎn)錄因子, 實現(xiàn)了多基因同步敲除, 證明了RNP直接導(dǎo)入可實現(xiàn)硅藻的基因編輯; Kim等[45]選擇同時使用質(zhì)粒表達Cas9的方法和RNP方法轉(zhuǎn)化小球藻, 分別敲除其和(腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因)。

進行科學(xué)研究的最終目的是要能夠應(yīng)用到實際生產(chǎn)中, RNP直接導(dǎo)入可編輯篩選高生產(chǎn)力藻株。Baek等[46]用RNP敲除萊茵衣藻(葉綠體信號識別因子基因), 光合效率大幅提升, 生產(chǎn)力提高。后又敲除(玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因), 實現(xiàn)萊茵衣藻黃斑色素光合自養(yǎng)生產(chǎn), 并用做蛋雞飼料[47]。Shin等[48]用RNP敲除萊茵衣藻PLA2(磷脂酶A2)基因, 提高了萊茵衣藻脂質(zhì)生產(chǎn)力。Chang等[49]用RNP編輯扁藻(sp.)AGP(ADP葡萄糖焦磷酸化酶)基因, 提高了脂質(zhì)生產(chǎn)力。Hu等[40]用RNP編輯杜氏鹽藻()β-胡蘿卜素羥化基因, 使β-胡蘿卜素含量比野生株提高2.2倍。Nomura等[50]用RNP編輯細小裸藻()(葡聚糖合酶基因), 實現(xiàn)單鏈寡核苷酸精準(zhǔn)敲入, 使裸藻儲存更少但更大的副淀粉顆粒。

RNP直接導(dǎo)入已成功應(yīng)用于許多微藻的基因標(biāo)記, 瞬時存在的Cas9蛋白, 不會對目標(biāo)微藻產(chǎn)生長期毒害。這種方式也有局限性, RNP復(fù)合物的形成需要Cas9純度較高, 但其獲得較為困難。因此, 選擇用細菌質(zhì)粒為框架, 構(gòu)建Cas9基因和gRNA單元表達構(gòu)建物會更加簡便。

續(xù)表

4 應(yīng)用于微藻的其他CRISPR/Cas系統(tǒng)

與Cas9核酸酶有相同作用的Cas12a(Cpf1)也是被單RNA引導(dǎo)的酶。與Cas9識別PAM序列不同, Cpf1內(nèi)切酶識別富含胸腺嘧啶的DNA序列, 如5′-TTTN-3′, 產(chǎn)生黏性雙鏈斷裂[51]。Cas12a(Cpf1)核酸內(nèi)切酶在距PAM 18～23 bp的位置切開DNA, 引入DSB。因此, 非同源末端修復(fù)可能不影響Cas9需要的PAM和識別序列, Cas12a可再次切割同一位點[52]。用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的RNP復(fù)合物和單鏈寡核苷酸高效編輯萊茵衣藻(葉綠體信號識別因子基因)、(參與葉綠素捕光復(fù)合物的組裝)和(磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因) 3個基因, 獲得淡綠色、小型化、生長慢的藻株[53]。Naduthodi等[52]純化的Cas12a (FnCas12a)蛋白(Cpf1), 將crRNA與Cas12a組合成RNP復(fù)合物, 實現(xiàn)了海洋微擬球藻硝酸還原酶基因敲除。

除了Cpf1和Cas9外, 還有其他Cas9變體, 如Cas9n(Cas9 nickase)可以造成單鏈DNA的斷裂, 類似限制性核酸酶功能, 產(chǎn)生一個切口, 減少脫靶效應(yīng)的發(fā)生。

5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的驗證

CRISPR/Cas9系統(tǒng)每一個元件都是基因編輯不可或缺的。表達Cas9的重組質(zhì)粒常有整合失敗的情況, Cas9基因成功表達需要驗證。與Cas9基因共表達一個報告基因, 如、基因等, 通過熒光可初步確定Cas9 的成功表達[36, 38]。Jiang等[26]設(shè)計的Cas9基因表達構(gòu)建物上有一個20 bp位點, 可被ApaL Ⅰ酶切消化。如果Cas9基因成功整合, PCR擴增產(chǎn)物不含這段序列, 因而抗ApaL Ⅰ消化。Wang等[54]對轉(zhuǎn)化后的微藻基因組DNA進行巢式PCR擴增片段, 用限制酶Pvu Ⅱ處理。Pvu Ⅱ可將野生型PCR片段消化成2條帶, 而突變型無限制酶位點, 抗限制酶消化。

編輯微藻肉眼或顯微鏡可辨表型的對應(yīng)基因就是驗證CRISPR/Cas9系統(tǒng)的直接方法。萊茵衣藻和基因分別編碼葉綠體SRP43觸角組裝和Mg-原卟啉IXS-腺苷甲硫氨酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶編輯成功后獲得肉眼可辨的淺綠色、黃色或棕色藻落[41]。常用的和分別編碼硝酸還原酶和亞硝酸還原酶, 敲除后藻株無法利用硝酸鹽或亞硝酸鹽氮源, 肉眼上識別藻落呈黃色, 但能在含銨鹽的f/2培養(yǎng)基中正常生長, 藻落呈正常綠色[45, 55]。

因此, 通過驗證可辨表型的基因編輯方法, 在很大程度上減少了抗生素的使用, 不僅可以節(jié)省實驗成本, 而且可以減少對環(huán)境的污染。

6 微藻中CRISPR介導(dǎo)的表達干擾(CRISPR-interference, CRISPRi)

CRISPRi仍用gRNA引導(dǎo)突變的Cas9(deficient Cas9, dCas9)識別和結(jié)合DNA, 干擾基因轉(zhuǎn)錄和基因表達[56]。dCas9的RuvC和HNH2個核酸酶結(jié)構(gòu)域沉默突變, D10A和H840A, 失去內(nèi)切酶活性, 但保留了DNA識別和結(jié)合活性, 與sgRNA共表達時可形成DNA識別復(fù)合體, 特異性干擾基因轉(zhuǎn)錄[20, 56-57]。CRISPRi可以同時干擾多個靶基因轉(zhuǎn)錄, 干擾作用可逆[56, 58]。CRISPRi在藍細菌中較早運用。Gordon等[59]用CRISPRi實現(xiàn)了藍藻中心碳代謝動態(tài)調(diào)節(jié)和通量操控。Huang等[60]用CRISPRi調(diào)控藍藻基因表達, 增加了琥珀酸合成。成功應(yīng)用CRISPRi的第一個真核微藻是三角褐指藻。Nymark等[31]構(gòu)建含dCas9基因的質(zhì)粒構(gòu)建物, 轉(zhuǎn)化三角褐指藻, 實現(xiàn)了(葉綠體信號識別因子基因)基因沉默, 突變藻株對強光敏感。Kao等[61]在萊茵衣藻中用CRISPRi干擾了(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)表達, 降低了葉綠素含量, 提高了脂質(zhì)積累。Ajjawi等[62]用CRISPR/Cas9系統(tǒng)引入反向遺傳學(xué)插入突變, 調(diào)控微擬球藻()基因表達, 在半連續(xù)生長條件下, 使脂質(zhì)含量較野生型提高2倍, 但突變株生長緩慢。Stukenberg等[63]構(gòu)建編碼dCas9基因的細菌質(zhì)粒構(gòu)建物, 轉(zhuǎn)化三角褐指藻, 沉默了(液泡轉(zhuǎn)運伴侶復(fù)合體基因, vacuolar transport chaperone complex gene)和(假定存在的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因, putative phosphate transporter gene), 突變體在磷限制的條件下,基因表達上調(diào)10倍, 而基因表達下調(diào)2倍。

dCas9仍具有結(jié)合sgRNA的功能, 而不具備剪切功能。sgRNA結(jié)合至基因的轉(zhuǎn)錄起始位點會沉默基因功能, sgRNA結(jié)合至轉(zhuǎn)錄抑制物或活化物, 會激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。因此, 可以根據(jù)需要設(shè)計不同的sgRNA實現(xiàn)研究目的。CRISPRi和CRISPRa(轉(zhuǎn)錄激活, CRISPR activation)均是可逆的, 不會對基因組DNA產(chǎn)生永久性的改變。

7 討論和展望

在微藻中, 研究目標(biāo)基因的功能, 在不影響其生長的情況下, 最優(yōu)的方法是實現(xiàn)基因的完全敲除, 再進行表型或生化指標(biāo)的后續(xù)驗證。利用同源重組方法可以實現(xiàn)這種目的, 但是真核生物同源重組受非同源性末端修復(fù)抑制, 僅存在于細胞周期的特定階段。我們可以通過干擾非同源末端修復(fù)的特異DNA連接酶, 或在細胞周期同源重組特定階段進行轉(zhuǎn)化, 來提高同源重組效率。在設(shè)計同源重組敲除基因過程中有RNP參與, 定點切割可提高轉(zhuǎn)化效率[27]。有證據(jù)表明ZFN在萊茵衣藻中HDR(homology- directed repair)效率高于CRISPR/Cas9系統(tǒng)[64]。ZFN和Cas9定點敲除可實現(xiàn)目標(biāo)微藻同源敲除驗證微藻中絕大多數(shù)基因的功能, 將有益基因過表達, 可獲得高生產(chǎn)力的藻株。同樣, 組合使用Cas9和Cre重組酶, 在微擬球藻中已實現(xiàn)連續(xù)敲除內(nèi)源基因和敲入新基因[35], 敲除生化過程中的酶基因, 可增加上游產(chǎn)物的積累。

在CRISPR/Cas9設(shè)計的過程中g(shù)RNA側(cè)翼增加有核酶(ribozyme)HH和HDV, 可以更加精確切割[37], 用內(nèi)源核定位信號(nuclear located signals, NLSs)替代哺乳動物NLSs提高Cas9靶向精度[54], 在設(shè)計sgRNA時提高特異性, 降低Cas蛋白與其它類似sgRNA分子結(jié)合, 避免非特異性切割[51], 選擇GC含量低于70%的靶序列可降低脫靶效應(yīng)[65]。模式微藻萊茵衣藻, 化膿性鏈球菌Cas9(Cas9)對其毒性較強, 而金黃色葡萄球菌Cas9(Cas9)毒性較弱, 因此更適合萊茵衣藻的基因編輯[30]。但是,Cas9的精確靶向度不如Cas9。最新鑒定出的Cas9-HF是Cas9的變體, 提高了Cas9的精確度, 應(yīng)用于人體細胞, 將脫靶活性降低了大約90％[66], 而Cas9的變體MiCas9也顯著提高單鏈寡核苷酸介導(dǎo)的精確編輯, 提高長片段基因插入效率, 減少缺失突變的產(chǎn)生[67]。在微藻中我們也可以利用這些高精確靶向的Cas9蛋白, 獲得更高的編輯效率。

Cas9n(Cas9 nickase)與修飾單堿基酶連用構(gòu)成CRISPR 堿基編輯系統(tǒng), 可以避免轉(zhuǎn)化過程中引入缺失突變, 精確地對單鏈DNA中的堿基進行編輯[68]。此系統(tǒng)可檢驗微藻單堿基改變對微藻性狀的影響。Cas9n(Cas9 nickase)和反轉(zhuǎn)錄酶連用構(gòu)成引導(dǎo)編輯(CRISPR prime edition)系統(tǒng), 可打斷特定DNA位點的一條鏈, 引入一段序列, 高效造成插入突變。Cas9n是單鏈內(nèi)切酶, 不產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂, 最高只能精確插入約40 bp, 刪除最高約80 bp[68-69]。

微藻生長快, 易培養(yǎng), 基因組相對簡單。萊茵衣藻、三角褐指藻、微擬球藻、小球藻等許多微藻都是基因工程研究常用微藻藻種。優(yōu)秀藻種是高效生產(chǎn)多種多樣物質(zhì)的基礎(chǔ)?；蚓庉嫾夹g(shù)就是微藻藻種遺傳改良的技術(shù)之一。CRISPR/Cas9技術(shù)成功率高、易操作、成本低, 比TALEN、ZFN等應(yīng)用更廣泛。目前, 以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基礎(chǔ)而衍生出的多種基因調(diào)控, 例如CRISPR激活、CRISPR prime編輯、CRISPR堿基編輯、編輯組蛋白標(biāo)記、甲基化編輯等, 都可以成為日后進行微藻基因編輯的有力工具。因此, 如何整合現(xiàn)有編輯技術(shù)、修飾現(xiàn)有編輯技術(shù)、闡明微藻經(jīng)濟性狀遺傳基礎(chǔ)、培育優(yōu)質(zhì)微藻藻種是重要的研究領(lǐng)域之一。

[1] Horvath P, Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea[J]. Science, 2010, 327(5962): 167-170.

[2] Jansen R, Van Embden J, Gaastra W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular Microbiology, 2002, 43: 1565-1575.

[3] Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, et al. Nucleotide sequence of thegene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in, and identification of the gene product[J]. Journal of Bacteriology, 1987, 169(12): 5429-5433.

[4] Mojica F J, Díez-Villase?or C, Soria E, et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria[J]. Molecular Microbiology, 2000, 36(1): 244-246.

[5] Jansen R, Embden J D, Gaastra W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular Microbiology, 2002, 43(6): 1565-1575.

[6] Horvath P, Romero D A, Co?té-Monvoisin A C, et al. Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in[J]. Journal of Bacteriology, 2008, 190(4): 1401-1412.

[7] Deveau H, Garneau J E, Moineau S. CRISPR/ Cas system and its role in phage-bacteria interactions[J]. Annual Review of Microbiology, 2010, 64: 475-493.

[8] Al-Attar S, Westra E R, van der Oost J, et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes[J]. Biological Chemistry, 2011, 392(4): 277-289.

[9] Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science, 2007, 315(5819): 1709-1712.

[10] Mojica F J, Díez-Villase?or C, García- Martínez J, et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J]. Journal of Molecular Evolution, 2005, 60(2): 174-182.

[11] Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats[J]. BMC Bioinformatics, 2007, 8: 172.

[12] Howard J A, Delmas S, Ivan?i?-Ba?e I, et al. Helicase dissociation and annealing of RNA-DNA hybrids byCas3 protein[J]. Biochemical Journal, 2011, 439(1): 85-95.

[13] Brouns S J, Jore M M, Lundgren M, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes[J]. Science, 2008, 321(5891): 960-964.

[14] Hale C R, Zhao P, Olson S, et al. RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex[J]. Cell, 2009, 139(5): 945-956.

[15] Sorek R, Kunin V, Hugenholtz P. CRISPR-a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea[J]. Nature Reviews Microbiology, 2008, 6(3): 181-186.

[16] Karginov F V, Hannon G J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea[J]. Molecular Cell, 2010, 37(1): 7-19.

[17] Makarova K S, Haft D H, Barrangou R, et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems[J]. Nature Reviews Microbiology, 2011, 9(6): 467-477.

[18] Makarova K S, Zhang F, Koonin E V. SnapShot: Class 1 CRISPR-Cas Systems[J]. Cell, 2017, 168(5): 946-946, e941.

[19] Sapranauskas R, Gasiunas G, Fremaux C, et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in[J]. Nucleic Acids Research, 2011, 39(21): 9275-9282.

[20] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA─guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science, 2012, 337 (6096): 816.

[21] Deltcheva E, Chylinski K, Sharma C M, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase Ⅲ[J]. Nature, 2011, 471(7340): 602-607.

[22] Shojaei S, Gardanova Z R, Zekiy A O, et al. Optimizing sgRNA to improve CRISPR/Cas9 knockout efficiency: Special focus on human and animal cell[J]. Frontiers in Bioengineering & Biotechnology, 2021, 9: 775309.

[23] Liu X X, Homma A, Sayadi J, et al. Sequence features associated with the cleavage efficiency of CRISPR/Cas9 system[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 19675.

[24] Mojica F J M, Díez-Villase?or C, García- Martínez J, et al. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system[J]. Microbiology, 2009, 155(Pt 3): 733-740.

[25] Scollan M E. Chapter 2 - CRISPR-Cas orthologs and variants[C]//Tsang Stephen H. CRISPR genome surgery in stem cells and disease tissues. United States: Academic Press, 2022: 7-38.

[26] Jiang W Z, Brueggeman A J, Horken K M, et al. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in[J]. Eukaryot Cell, 2014, 13(11): 1465-1469.

[27] Angstenberger M, de Signori F, Vecchi V, et al. Cell synchronization enhances nuclear transformation and genome editing via Cas9 enabling homologous recombination in[J]. ACS Synthetic Biology, 2020, 9(10): 2840-2850.

[28] Jiang W Z, Weeks D P. A gene-within-a-gene Cas9/ sgRNA hybrid construct enables gene editing and gene replacement strategies in[J]. Algal Research, 2017, 26: 474-480.

[29] Lin W R, Ng I S. Development of CRISPR/Cas9 system inFSP-E to enhance lipid accumulation[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2020, 133: 109458.

[30] Ortega-Escalante J A, Jasper R, Miller S M. CRISPR/Cas9 mutagenesis in[J]. Plant Journal, 2019, 97(4): 661-672.

[31] Nymark M, Sharma A K, Sparstad T, et al. A CRISPR/Cas9 system adapted for gene editing in marine algae[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 24951.

[32] Vogler B W, Ashford A, Posewitz M C. CRISPR/Cas9 disruption of glucan synthase inattenuates accumulation of β-1, 3-glucose oligomers[J]. Algal Research, 2021, 58: 102385.

[33] Slattery S S, Diamond A, Wang H, et al. An expanded plasmid-based genetic toolbox enables Cas9 genome editing and stable maintenance of synthetic pathways in[J]. ACS Synthetic Biology, 2018, 7(2): 328-338.

[34] Hopes A, Nekrasov V, Kamoun S, et al. Editing of the urease gene by CRISPR-Cas in the diatom[J]. Plant Methods, 2016, 12: 49.

[35] Verruto J, Francis K, Wang Y, et al. Unrestrained markerless trait stacking inthrough combined genome editing and marker recycling technologies[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(30): E7015.

[36] Naduthodi M I S, Südfeld C, Avitzigiannis E K, et al. Comprehensive genome engineering toolbox for microalgaebased on CRISPR-Cas systems[J]. ACS Synthetic Biology, 2021, 10(12): 3369-3378.

[37] WANG Q T, GONG Y H, HE Y H, et al. Genome engineering ofwith hundred-kilobase fragment deletions by Cas9 cleavages[J]. Plant Journal, 2021, 106(4): 1148-1162.

[38] Poliner E, Takeuchi T, Du Z Y, et al. Nontransgenic marker-free gene disruption by an episomal CRISPR system in the oleaginous microalga,CCMP1779[J]. ACS Synthetic Biology, 2018, 7(4): 962-968.

[39] Moosburner M A, Gholami P, McCarthy J K, et al. Multiplexed knockouts in the model diatomby episomal delivery of a selectable Cas9[J]. Frontiers in Microbiology, 2020, 11: 5. doi: 10.3389/fmicb.2020.00005.

[40] Hu L N, Feng S Y, Liang G F, et al. CRISPR/Cas9- induced β-carotene hydroxylase mutation inCCAP19/18[J]. AMB Express, 2021, 11(1): 83.

[41] Shin S E, Lim J M, Koh H G, et al. CRISPR/Cas9- induced knockout and knock-in mutations in[J]. Scientific Reports, 2016, 6(1): 27810.

[42] Yoshimitsu Y, Abe J, Harayama S. Cas9-guide RNA ribonucleoprotein-induced genome editing in the industrial green alga. strain KJ[J]. Biotechnology for Biofuels, 2018, 11(1): 326.

[43] Krishnan A, Cano M, Burch T A, et al. Genome editing using Cas9-RNA ribonucleoprotein complexes in the high-productivity marine alga[J]. Algal Research, 2020, 49: 101944.

[44] Serif M, Dubois G, Finoux A L, et al. One-step generation of multiple gene knock-outs in the diatomby DNA-free genome editing[J]. Nature Communication, 2018, 9(1): 3924.

[45] KIM J, CHANG K S, LEE S, et al. Establishment of a genome editing tool using CRISPR-Cas9 inUTEX395[J]. International Journal?of?Molecular Sciences, 2021, 22(2): 480.

[46] Baek K, Kim D H, Jeong J, et al. DNA-free two-gene knockout invia CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins[J]. Scientific Reports, 2016, 6(1): 30620.

[47] Baek K, Yu J, Jeong J, et al. Photoautotrophic production of macular pigment in astrain generated by using DNA-free CRISPR-Cas9 RNP- mediated mutagenesis[J]. Biotechnology Bioengineering, 2018, 115(3): 719-728.

[48] Shin Y S, Jeong J, Nguyen T H T, et al. Targeted knockout of phospholipase A(2) to increase lipid productivity infor biodiesel production[J]. Bioresource Technology, 2019, 271: 368-374.

[49] Chang K S, Kim J, Park H, et al. Enhanced lipid productivity in AGP knockout marine microalgasp. using a DNA-free CRISPR-Cas9 RNP method[J]. Bioresource Technology, 2020, 303: 122932.

[50] Nomura T, Inoue K, Uehara-Yamaguchi Y, et al. Highly efficient transgene-free targeted mutagenesis and single-stranded oligodeoxynucleotide-mediated precise knock-in in the industrial microalgausing Cas9 ribonucleoproteins[J]. Plant Biotechnology Journal, 2019, 17(11): 2032-2034.

[51] Kim D, Kim J, Hur J K, et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells[J]. Nature Biotechnology, 2016, 34(8): 863-868.

[52] Naduthodi M I S, Mohanraju P, Südfeld C, et al. CRISPR-Cas ribonucleoprotein mediated homology-directed repair for efficient targeted genome editing in microalgaeIMET1[J]. Biotechnology for Biofuels, 2019, 12: 66.

[53] Ferenczi A, Pyott D E, Xipnitou A, et al. Efficient targeted DNA editing and replacement inusing Cpf1 ribonucleoproteins and single-stranded DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017, 114(51): 13567.

[54] Wang Q T, Lu Y D, Xin Y, et al. Genome editing of model oleaginous microalgaespp. by CRISPR/Cas9[J]. Plant Journal, 2016, 88(6): 1071-1081.

[55] Kilian O, Benemann C S E, Niyogi K K, et al. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing algasp.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108(52): 21265.

[56] Qi L S, Larson M H, Gilbert L A, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression[J]. Cell, 2013, 152(5): 1173-1183.

[57] Bikard D, Jiang W Y, Samai P, et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system[J]. Nucleic Acids Research, 2013, 41(15): 7429-7437.

[58] Lv L, Ren Y L, Chen J C, et al. Application of CRISPRi for prokaryotic metabolic engineering involving multiple genes, a case study: Controllable P(3HB-co-4HB) biosynthesis[J]. Metabolic Engineering, 2015, 29: 160-168.

[59] Gordon G C, Korosh T C, Cameron J C, et al. CRISPR interference as a titratable, trans-acting regulatory tool for metabolic engineering in thesp. strain PCC 7002[J]. Metabolic Engineering, 2016, 38: 170-179.

[60] Huang C H, Shen C R, Li H, et al. CRISPR interference (CRISPRi) for gene regulation and succinate production in cyanobacteriumPCC 7942[J]. Microbial Cell Factories, 2016, 15(1): 196.

[61] Kao P H, Ng I S. CRISPRi mediated phosphoenolpyruvate carboxylase regulation to enhance the production of lipid in[J]. Bioresource Technology, 2017, 245: 1527-1537.

[62] Ajjawi I, Verruto J, Aqui M, et al. Lipid production inis doubled by decreasing expression of a single transcriptional regulator[J]. Nature Biotechnology, 2017, 35(7): 647-652.

[63] Stukenberg D, Zauner S, Dell'Aquila G, et al. Optimizing CRISPR/Cas9 for the diatom[J]. Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 740.

[64] Greiner A, Kelterborn S, Evers H, et al. Targeting of photoreceptor genes invia zinc-finger nucleases and CRISPR/Cas9[J]. Plant Cell, 2017, 29(10): 2498-2518.

[65] Russo M T, Aiese Cigliano R, Sanseverino W, et al. Assessment of genomic changes in a CRISPR/ Cas9mutant through whole genome resequencing[J]. PeerJ, 2018, 6: e5507.

[66] Tan Y, Chu A H Y, Bao S, et al. Rationally engineeredCas9 nucleases with high genome-wide specificity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2019, 116(42): 20969- 20976.

[67] Ma L Y, Ruan J X, Song J, et al. MiCas9 increases large size gene knock-in rates and reduces undesirable on-target and off-target indel edits[J]. Nature Communication, 2020, 11(1): 6082.

[68] Kim H K, Yu G, Park J, et al. Predicting the efficiency of prime editing guide RNAs in human cells[J]. Nature Biotechnology, 2021, 39(2): 198-206.

[69] Anzalone A V, Randolph P B, Davis J R, et al. Search-and-replace genome editing without double- strand breaks or donor DNA[J]. Nature, 2019, 576(7785): 149-157.

Application of the CRISPR/Cas9 gene editing system in microalgae

LIU Li-xian, GUO Li, YANG Guan-pin

(College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Microalgae are a group of photosynthetic protists. They synthesize diverse high value-added materials, such as protein, docosahexaenoic acid, and astaxanthin, which are widely used as food additives and in health products, cosmetics, and animal feeds. Gene editing may serve as a novel tool for microalgal genetic studies and genetic improvement. The currently available gene editing tools include zinc-finger nucleases (ZFNs) system, transcription activator-like effector nucleases (TALENs) system, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) system (CRISPR/Cas). ZFN and TALEN are fusion proteins, which include an effector (DNA sequence recognizer) and an endonuclease. They target a specific region of DNA and cut the surrounding sequence. This editing system is tedious as the effector must be modified for diverse editing sites. In comparison, the newly emerging CRISPR/Cas technology is easy to operate and highly efficient. It requires only a small guide RNA to be designed for each site. It can simultaneously knock out a single or a set of genes, mediate the insertion of a DNA fragment into a specific site, and its variants can interfere, activate, or switch off and switch on the expression of a gene. Prime editing and RNA editing have been developed, and diverse editing tools are being established for microalgae. In this paper, we reviewed the current status and application of the CRISPR/Cas9 editing system in microalgae.

microalgae; gene editing; CRISPR/Cas9

Oct. 14, 2022

[Supported by Key R&D Program of Shandong Province, China, No. 2022LZGC004, National Key R&D Program of China, No. 2022YFF1102300 and the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 202262001]

Q789

A

1000-3096(2023)8-0101-11

10.11759/hykx20221014001

2022-10-14;

2022-11-08

山東省重點研發(fā)計劃(2022LZGC004), 國家重點研發(fā)計劃(2022YFF1102300), 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(202262001)資助

劉麗嫻(1998—), 女, 山東青島人, 碩士, 主要從事海洋微藻遺傳學(xué)研究, E-mail: liulxouc@163.com; 楊官品(1963—), 通信作者, 男, 湖北荊州人, 主要從事海洋生物方面的研究 E-mail: yguanpin@ouc.edu.cn

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)