劉俊豪,熊永斌,何永好綜述,李春亮審校

0 引 言

脂肪組織中含有多種類型的細(xì)胞,其中包括前脂肪細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和常駐單核細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等[1]。2001年,Zuk等[2]首次從脂肪組織中分離出脂肪干細(xì)胞,并發(fā)現(xiàn)其通過誘導(dǎo)分化,具有成骨、成軟骨、成脂肪和神經(jīng)表型的能力。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cell,ADSCs)來源豐富、取材方便、免疫原性低、增殖速度快、表型穩(wěn)定、具有多向分化潛能,是骨組織工程中一種理想的種子細(xì)胞[3]。如今,ADSCs已成為成為干細(xì)胞領(lǐng)域中最受歡迎的干細(xì)胞群之一,并廣泛應(yīng)用于組織工程研究[4]。外泌體是一種由細(xì)胞分泌的直徑為30～150 nm的微小囊泡,含有蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA、脂質(zhì)及信號(hào)因子,能夠傳遞多種生物學(xué)活性物質(zhì),促進(jìn)細(xì)胞間交流,參與體內(nèi)生物學(xué)活動(dòng),對(duì)身體各系統(tǒng)具有再生修復(fù)作用[5]。近五年,骨組織工程研究對(duì)外泌體進(jìn)行了大量研究,發(fā)現(xiàn)其在組織損傷修復(fù)中具有積極作用。外泌體不僅與干細(xì)胞具有相似生物學(xué)效能,還比干細(xì)胞更為安全穩(wěn)定,具有強(qiáng)大的細(xì)胞因子調(diào)控能力,在組織再生和組織修復(fù)方面表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用潛力[6-7]。本文就脂肪干細(xì)胞來源外泌體在骨組織工程方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 ADSCs來源外泌體概述

1.1 ADSCs特征及優(yōu)勢(shì)干細(xì)胞是一種具有多向分化及自我復(fù)制能力的細(xì)胞,能夠分化為多種子代細(xì)胞。自2001年Zuk等[2]首次分離出ADSCs后,研究發(fā)現(xiàn)相比其他間充質(zhì)干細(xì)胞,ADSCs具有諸多優(yōu)點(diǎn),主要包括:①?gòu)V泛存在于脂肪組織,來源充足;②通過吸脂術(shù)獲取脂肪組織,即可從中提取ADSCs,取材方便,代價(jià)較小;③相比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived stem, BMSC),ADSCs產(chǎn)量較高,獲取率達(dá)1%～2%(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲取率僅為0.001%～0.002%),且使用膠原酶消化法或直接離心法等較為簡(jiǎn)單的方式即可進(jìn)行分離[8];④穩(wěn)定性好,安全性高,免疫排斥性低?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn),多項(xiàng)研究聚焦于ADSCs向多種細(xì)胞的分化能力,探究其對(duì)不同組織的修復(fù)能力。

隨著對(duì)ADSCs研究的不斷深入,大量研究表明ADSCs在體內(nèi)、體外均具備多向分化潛能,如向骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等的分化[9]。陸詩(shī)等[10]研究發(fā)現(xiàn),黃精多糖能夠通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin的表達(dá),促進(jìn)ADSCs成骨分化,治療小鼠骨質(zhì)疏松。Kayabolen等[11]聯(lián)合脂肪組織和纖維蛋白混合制備水凝膠三維支架,并發(fā)現(xiàn)ADSCs在該支架中能夠引起缺氧,加速血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),促進(jìn)血管生成。

1.2 ADSCs外泌體種類及功能外泌體是由多泡體與細(xì)胞膜融合后,釋放至外環(huán)境中的30～150 nm的生物囊泡,可攜帶細(xì)胞特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì),并選擇性地被細(xì)胞吸收。外泌體作為一種非侵入性的診斷生物標(biāo)志物和治療性的納米載體,具有生物學(xué)意義和研究?jī)r(jià)值[12]。同樣,ADSCs來源外泌體攜帶豐富的細(xì)胞活性物質(zhì),如蛋白質(zhì)、mRNA及microRNA等,可通過介導(dǎo)細(xì)胞間信息溝通,促進(jìn)受損組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫、抵御炎癥等[13]。研究表明,ADSCs來源外泌體可以:①通過促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞增殖遷移,促進(jìn)血管再生,加速膠原合成,修復(fù)創(chuàng)面[14];②促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞增殖遷移,抑制神經(jīng)瓦氏變性,控制內(nèi)啡肽酶活性,減緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展[15];③誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化,提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性,抑制藥物敏感性,干擾細(xì)胞發(fā)展周期,抑制腫瘤生長(zhǎng),同時(shí)還可同靶向蛋白共同作用,精準(zhǔn)遞送治療藥物[16];④促進(jìn)血管生成,抑制心臟纖維化,保護(hù)心肌細(xì)胞[17];⑤促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化,調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞,抑制炎癥因子,進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)[18];⑥減輕腎小管損傷,抑制炎癥,抑制氧化應(yīng)激,保護(hù)腎臟功能[19];⑦促進(jìn)破骨細(xì)胞增值分化,抑制破骨細(xì)胞活性活性,維持骨環(huán)境穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)骨與軟骨組織損傷。

2 ADSCs來源外泌體促進(jìn)骨再生的機(jī)制

ADSCs來源外泌體可通過抑制低氧缺血環(huán)境誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡,促進(jìn)骨再生。研究發(fā)現(xiàn),ADSCs來源外泌體可顯著抑制低氧缺血環(huán)境下MLO-Y4細(xì)胞中骨細(xì)胞的凋亡率[20]。對(duì)ADSCs進(jìn)行24h低水平激光照射,將該來源外泌體加入缺氧缺血環(huán)境下的MLO-Y4細(xì)胞,可使抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)水平上升,抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)[21]。ADSCs來源外泌體不僅可以通過降低RANKL以及RANKL/OPG表達(dá),抑制破骨細(xì)胞生成[22];還可抑制骨細(xì)胞中IL-1b和IL-18的分泌,從機(jī)制上看,就是抑制了破骨細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活,進(jìn)而減少骨吸收,恢復(fù)骨質(zhì)流失[23]。

ADSCs來源外泌體可促進(jìn)干細(xì)胞的增殖、遷移和成骨向分化,進(jìn)而促進(jìn)成骨。如ADSCs來源外泌體可調(diào)控骨鈣素蛋白和骨橋蛋白表達(dá)升高,促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞增殖和成骨分化[24]。此外,該來源外泌體可顯著增強(qiáng)hADSCs中RUNX2和ALP表達(dá),誘導(dǎo)hADSCs成骨分化[25]。實(shí)驗(yàn)表明,ADSCs來源外泌體能夠在1～14 d內(nèi)被hADSCs有效內(nèi)化,能讓外泌體發(fā)揮最大效能的濃度在15 μg/mL[25]。ADSCs來源外泌體也可通過增強(qiáng)ALP、RUNX2的表達(dá),促進(jìn)BMSC的增殖、遷移和成骨分化[26]。Wnt/β-catenin通路參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡,尤其在成骨細(xì)胞的分化中具有重要作用。ADSCs來源外泌體可通過調(diào)控β-catenin蛋白水平,促進(jìn)ADSCs向成骨分化[27]。該研究還發(fā)現(xiàn),加入DKK-1蛋白,抑制Wnt/β-catenin通路后,ADSCs成骨分化能力雖減弱,但仍較無外泌體處理的空白組強(qiáng),說明脂肪干細(xì)胞來源外泌體并非通過單一通路促進(jìn)骨修復(fù),而是通過多個(gè)通路協(xié)同作用。

預(yù)調(diào)整外泌體的細(xì)胞因子表達(dá),靶向成骨分化相關(guān)信號(hào)通路,是ADSCs來源外泌體促進(jìn)骨再生的重要機(jī)制。經(jīng)miR-130a-3p預(yù)處理的ADSCs來源外泌體可降低miR-130a-3p靶點(diǎn)SIRT7的蛋白及mRNA水平,顯著提升成骨信號(hào)通路Wnt/β-catenin的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)成骨[28]。類似地,上調(diào)ADSCs來源外泌體中miR-375的表達(dá),應(yīng)用于小鼠骨缺損模型,可發(fā)現(xiàn)RUNX2,ALP,COL1A1和骨鈣素蛋白表達(dá)上調(diào),BMSC的成骨分化能力得到促進(jìn)[29]。另有研究建立蛋白多糖誘導(dǎo)的強(qiáng)直性脊柱炎模型,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)miR-21過表達(dá)的ADSCs來源外泌體可下調(diào)脊柱中白細(xì)胞介素(IL)-6表達(dá)水平,減少破骨細(xì)胞數(shù)量,增加骨礦物質(zhì)含量和密度,有效改善強(qiáng)制性脊柱炎小鼠的骨質(zhì)疏松癥[30]。經(jīng)miR-378修飾的ADSCs來源外泌體可負(fù)向調(diào)控融合抑制因子(Sufu),激活Sonic Hedgehog (Shh)信號(hào)通路,促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞血管生成和骨生成,對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死有治療作用[31]。使用腫瘤壞死因子-α(TNF-α)預(yù)處理的ADSCs來源外泌體中Wnt-3a表達(dá)水平顯著提升,增加了外泌體對(duì)人原代成骨細(xì)胞 (HOBs) 的營(yíng)養(yǎng)功能,進(jìn)而促進(jìn)HOBs的增殖與成骨分化[32]。使用長(zhǎng)鏈非編碼RNA-KCNQ1OT1 (lnc-KCNQ1OT1) 修飾ADSCs,并提取外泌體作用于TNF-α誘導(dǎo)過的HOBs,發(fā)現(xiàn)經(jīng)lnc-KCNQ1OT1處理的ADSCs來源外泌體對(duì)經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的HOBs的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用,其作用靶點(diǎn)為 miR-141-5p[33]。

3 ADSCs來源外泌體促進(jìn)軟骨修復(fù)的作用機(jī)制

ADSCs來源外泌體還可通過抑制抗炎因子表達(dá),提升巨噬細(xì)胞遷移能力等方式,促進(jìn)軟骨修復(fù)。實(shí)驗(yàn)研究表明,ADSCs來源外泌體可靶向調(diào)控軟骨細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)自噬細(xì)胞遷移,進(jìn)而起到軟骨修復(fù)的作用[34]。注射ADSCs來源外泌體的關(guān)節(jié)內(nèi)移植物與骨的愈合界面間隙更小,纖維軟骨更多,在八周時(shí)有更多的纖維組織和成熟膠原蛋白,且具有明顯巨噬細(xì)胞分化趨勢(shì),其中促炎性M1巨噬細(xì)胞明顯較少,修復(fù)性M2巨噬細(xì)胞數(shù)量增多[35]。體外和體內(nèi)研究均表明ADSCs來源外泌體可介導(dǎo)M1/M2極化,促使M2極化增強(qiáng),明顯改善小鼠肌腱的炎癥狀態(tài),其組織學(xué)特征和生物力學(xué)強(qiáng)度也有所提高[36]。

Li等[37]不僅驗(yàn)證了ADSCs來源外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用,還發(fā)現(xiàn)該外泌體是通過上調(diào)miR-451a表達(dá),通過靶向巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF),促進(jìn)巨M1向M2的極化。Wu等[38]發(fā)現(xiàn)髕下脂肪墊間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體可通過上調(diào)miR-100-5p,抑制mTOR的表達(dá),明顯提高軟骨細(xì)胞自噬水平,進(jìn)而對(duì)軟骨產(chǎn)生保護(hù)作用,并改善步態(tài)異常。另有研究發(fā)現(xiàn),ADSCs來源外泌體可以降低有關(guān)細(xì)胞衰老的β-半乳糖苷酶活性及γH2AX foci的形成,還可減少IL- 6和前列腺素E2等炎癥因子的表達(dá),對(duì)關(guān)節(jié)炎癥有相當(dāng)?shù)闹委煗摿39]。此外,lnc-Gm37494高表達(dá)可抑制 miR-130b-3p表達(dá),促進(jìn)過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPARγ) 表達(dá),從而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化,抑制炎癥因子表達(dá),促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)[40]。

4 ADSCs來源外泌體的治療方法

根據(jù)納入文獻(xiàn)結(jié)果總結(jié),ADSCs來源外泌體治療方法主要分為兩種,一種是注射法,第二種是使用組織工程支架負(fù)載ADSCs來源外泌體,作用于缺損部位。因注射法操作繁瑣,且因外泌體易流失,治療效果難以維持,因此近5年的研究多從組織工程學(xué)角度對(duì)ADSCs來源外泌體治療方法進(jìn)行創(chuàng)新,使用絲素/殼聚糖、水凝膠或金屬有機(jī)框架等組織工程支架負(fù)載外泌體,對(duì)骨缺損部位進(jìn)行治療。該方法可將外泌體與支架進(jìn)行良好結(jié)合,充分發(fā)揮外泌體的治療效果,具有促進(jìn)骨再生,治療骨缺損的潛力,在骨組織修復(fù)領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景。

將ADSCs來源外泌體與絲素/殼聚糖三維支架復(fù)合物結(jié)合,可促進(jìn)ADSCs的成骨分化,絲素/殼聚糖三維支架材料的多孔結(jié)構(gòu)使得細(xì)胞更易在材料空隙及表面黏附和增殖,且濃度為為5 μg/μL的外泌體礦化效果最強(qiáng),對(duì)ADSCs的增殖作用也最強(qiáng)[41]。陳義慶等[42]制備含殼聚糖、納米羥基磷灰石、膠原和β-甘油磷酸鈉 (CS/nHAC/β-GP) 的水凝膠,負(fù)載ADSCs來源外泌體,并檢測(cè)外泌體作用于該水凝膠的成骨能力。該研究發(fā)現(xiàn),二維培養(yǎng)水凝膠不利于細(xì)胞生長(zhǎng),抑制細(xì)胞分化,三維培養(yǎng)的CS/nHAC/β-GP水凝膠更利于細(xì)胞黏附、增殖和分化,且外泌體負(fù)載的水凝膠成骨能力有顯著提升,ALP活性和礦化作用更為明顯。

Gandolfi等[43]使用聚乳酸、硅酸鈣和硅酸二鈣制備多孔支架 (PLA-10CaSi-10DCPD和PLA-5CaSi-5DCPD),用以負(fù)載ADSCs來源外泌體,并測(cè)定在該支架周圍培養(yǎng)的ADSCs成骨分化能力。結(jié)果顯示,支架在模擬體液內(nèi)培養(yǎng)28d后,支架孔隙率下降,形成了一個(gè)適合骨形成的微環(huán)境,增加了所培養(yǎng)ADSCs的成骨分化能力。Li等[44]將ADSCs來源外泌體與聚乳酸-乙醇酸 (PLGA) 支架相結(jié)合,發(fā)現(xiàn)能夠加速小鼠小腿骨缺陷恢復(fù)。外泌體固定于聚多巴胺包裹的PLGA支架,得以緩慢而穩(wěn)定地釋放,促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移,促進(jìn)骨再生能力,在修復(fù)骨缺損方面具有良好潛力。

此外,Kang等[45]將焦點(diǎn)轉(zhuǎn)向金屬有機(jī)框架 (MOF) ,利用其裝在ADSCs來源外泌體,用于骨缺損修復(fù)。該研究利用PLGA、Mg2和GA構(gòu)建了一種具有獨(dú)特納米表層的無細(xì)胞支架 (PLGA/Exo-Mg-GA MOF) ,發(fā)現(xiàn)其負(fù)載的外泌體可以持續(xù)緩慢釋放長(zhǎng)達(dá)10天,被所培養(yǎng)細(xì)胞穩(wěn)定吸收,血液供應(yīng)充足,植骨環(huán)境穩(wěn)定,促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成以及RAW264.7的抗炎作用。

5 ADSCs來源外泌體在骨組織工程的應(yīng)用前景和挑戰(zhàn)

外泌體相較于干細(xì)胞更便于存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)移,所面臨的免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)更低,且具有較高生物安全性,在骨組織工程領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景,目前也有相當(dāng)數(shù)量的外泌體研究取得了令人振奮的成果[46]。在促進(jìn)骨再生方面,ADSCs來源外泌體可減少缺血和缺氧微環(huán)境的骨細(xì)胞凋亡,抑制破骨細(xì)胞生成[20-22],還可通過調(diào)控Wnt/β-catenin,RUNX2等成骨相關(guān)信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨向分化[24,26-27]。此外,通過對(duì)ADSCs外泌體進(jìn)行預(yù)處理,使得特定的細(xì)胞因子過表達(dá),或者改變外泌體的誘導(dǎo)環(huán)境,增加其促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力[28-29,32,40]。骨關(guān)節(jié)炎作為一個(gè)非常復(fù)雜的多因素疾病,目前并無十分良好的治療方法。ADSCs來源外泌體可以通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化、抑制抗炎因子表達(dá)等方式,促進(jìn)軟骨修復(fù),同時(shí)在骨質(zhì)疏松和肌腱-骨愈合等方面具有治療效果[23,34-35]。盡管ADSCs外泌體對(duì)于促進(jìn)骨再生的效果十分顯著,但是其具體作用機(jī)制,以及究竟是外泌體中哪些被選分子發(fā)揮作用仍待研究。此外,有研究發(fā)現(xiàn),ADSCs外泌體并非通過單一信號(hào)通路,而是通過通路網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化,這些通路是哪些,如何協(xié)同促進(jìn)成骨分化,仍有待研究[27]。

骨組織工程的研究進(jìn)展離不開對(duì)合適種子細(xì)胞和支架材料的篩選和優(yōu)化,將ADSCs來源外泌體與組織工程支架材料相結(jié)合,是一種新的治療手段,具有極大的應(yīng)用前景。使用絲素-殼聚糖、三維培養(yǎng)水凝膠和金屬有機(jī)框架等材料構(gòu)建組織工程支架,并負(fù)載ADSCs來源外泌體,可以構(gòu)建更為穩(wěn)定的植骨環(huán)境,使外泌體在骨缺損部位持久穩(wěn)定釋放,更為有效地促進(jìn)骨組織再生[42-43]。但是,組織工程支架對(duì)干細(xì)胞培養(yǎng)的毒性和不良反應(yīng)仍待進(jìn)一步研究,其與組織和細(xì)胞的相容性,以及在人體內(nèi)的降解情況等問題仍尚未解決[41]。

值得注意的是,盡管ADSCs來源外泌體在組織工程的應(yīng)用前景十分廣闊,但關(guān)于外泌體的提取、鑒定及大規(guī)模量化生產(chǎn)仍是一個(gè)挑戰(zhàn),無法滿足現(xiàn)有的臨床需求[47]。現(xiàn)有的ADSCs來源外泌體的提取方法有超速離心法和ExoQuick試劑盒法,研究發(fā)現(xiàn),在ExoQuick試劑盒法前加一步超速離心法,可提高外泌體的提取效率,且能夠提取更高純度、誘導(dǎo)效果更好的外泌體[48]。在ADSCs來源外泌體方面,目前有形貌鑒定、透射電子顯微鏡、免疫磁珠法和流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)等鑒定方式[49-50]。此外,在ADSCs來源外泌體的應(yīng)用中,其安全使用劑量以及最佳使用劑量仍待進(jìn)一步探究。有研究表明,ADSCs外泌體濃度過高時(shí),會(huì)降低巨噬細(xì)胞的存活率,不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[51]。

6 結(jié) 語(yǔ)

ADSCs來源外泌體可通過促進(jìn)骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)低氧缺血環(huán)境下骨組織再生,還可以提高間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及成骨向分化能力。通過對(duì)外泌體的細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,可提升外泌體促進(jìn)BMSC、ADSCs和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等的成骨分化和生成血管能力。在軟骨修復(fù)方面,ADSCs外泌體可通過調(diào)控自噬細(xì)胞遷移能力,抑制炎癥因子表達(dá),調(diào)控抗炎因子表達(dá)水平,進(jìn)而促進(jìn)軟骨修復(fù),達(dá)到保護(hù)軟骨的治療效果。其與骨組織工程材料的有效結(jié)合,可構(gòu)建更適于骨組織生長(zhǎng)、骨重建的環(huán)境,為未來骨組織工程研究提供廣闊的研究方向,但是ADSCs外泌體在骨組織工程的研究仍面臨諸多挑戰(zhàn),尤其是如何更為安全、有效且廣泛的應(yīng)用于臨床,仍有待更深入的研究。