楊 勇，葛向陽，2*，張聰芝，李燕榮，賈亞偉

(1.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800；2.宿遷學(xué)院，江蘇宿遷 223800)

大曲作為一種富含多酶多菌的微生態(tài)制品，在 中國白酒的釀造過程中起著糖化、生香、發(fā)酵、提供菌源的作用，是傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵蒸餾大曲酒的重要物質(zhì)保障，被人們評價“曲為酒之骨”[1]。對大曲中真菌微生物的研究最早是通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，葛向陽等[2]經(jīng)過多級富集、分離、純化與鑒定，從洋河傳統(tǒng)包包曲中分離得到畢赤酵母屬、異常漢遜酵母、假絲酵母等酵母菌類群以及卷枝毛霉、寄生曲霉、黑曲霉和黃曲霉等霉菌類群；羅惠波等[3]發(fā)現(xiàn)瀘州老窖大曲內(nèi)存在大量的曲霉屬、根毛霉屬、橫梗霉屬等霉菌類群以及釀酒酵母、德巴利氏酵母屬、異常威克漢姆酵母、鎖擲酵母屬等酵母菌類群。對中高溫制曲發(fā)酵過程中可培養(yǎng)微生物的消長及生化指標(biāo)的變化規(guī)律也做了相關(guān)研究[4-5]，然而，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法受到培養(yǎng)基的選擇性、微生物的生長特性等因素影響[6]，很難直接展現(xiàn)大曲中微生物的真實群落結(jié)構(gòu)。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于免培養(yǎng)的高通量測序技術(shù)已經(jīng)越來越廣泛地應(yīng)用于微生物群落的研究。譚崇堯等[7]利用高通量測序發(fā)現(xiàn)北方派濃香型白酒大曲優(yōu)勢真菌有熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬、威克漢姆酵母屬等，長江中游派優(yōu)勢真菌為曲霉屬、熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬，江淮派優(yōu)勢真菌有曲霉屬、熱子囊菌屬、耐干霉菌屬等，川派優(yōu)勢真菌有熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬、曲霉屬等；吳樹坤等[8]利用高通量測序發(fā)現(xiàn)四川不同地區(qū)濃香型白酒大曲中優(yōu)勢真菌為嗜熱真菌屬、曲霉屬、嗜熱子囊菌屬、絲衣霉屬、節(jié)擔(dān)菌屬；施思等[9]利用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)濃香型白酒大曲在貯存過程中的真菌群落結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整，畢赤酵母屬、根霉屬及橫梗霉屬成為最終的優(yōu)勢菌群；Li[10]對不同工藝的中、低溫大曲的微生物群落變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在不同環(huán)境作用下，微生物群落結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變。

基于高通量測序技術(shù)，已經(jīng)對細(xì)菌群落演替規(guī)律進(jìn)行了相關(guān)分析[11]。本文以中高溫大曲為研究對象，采用高通量測序技術(shù)對培菌發(fā)酵幾個主要階段的真菌群落進(jìn)行分析，研究各階段優(yōu)勢真菌的分布、豐度及其在培菌發(fā)酵過程中的演替規(guī)律，為進(jìn)一步剖析制曲發(fā)酵機(jī)理提供可靠的微生物信息。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

大曲樣品：中高溫大曲培養(yǎng)過程中入房（編號：RF，發(fā)酵0 天）、并房（編號：BF，發(fā)酵5 天）、上架（編號：SJ，發(fā)酵9 天）、大火（編號：DH，發(fā)酵15天）、下架（編號：XJ，發(fā)酵21 天）、出房（編號：CF，發(fā)酵35 天）各個階段的混合樣，分別粉碎、混勻、裝袋，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑耗材：TaKaRa Premix Taq?Version 2.0、E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit (Omega，USA)、NEBNext? Ultra ?II DNA Library Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs，USA）。

儀器設(shè)備：Novaseq 6000 PE250 平臺、美國Bio-Rad Laboratory S1000 型PCR 儀、Thermo Nano-Drop One。

1.2 實驗方法

按照標(biāo)準(zhǔn)流程對大曲樣品進(jìn)行DNA 提取，以ITS5-1737F 和ITS2-2043R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個樣本進(jìn)行3 個重復(fù)，并將同一樣本的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行混合，然后電泳檢測、切膠純化、建庫測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序有效性分析

中高溫制曲各階段真菌的richness 曲線如圖1所示。結(jié)果顯示，隨著測序深度的增加，各樣本的richness 指數(shù)曲線都是先增加后逐步趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映中高溫制曲各階段樣本中的絕大多數(shù)物種信息。

2.2 Alpha多樣性分析

對中高溫制曲各階段的真菌群落進(jìn)行Alpha多樣性分析，結(jié)果見表1。所有樣本的coverage 均大于0.99，說明該結(jié)果能夠真實反映真菌群落結(jié)構(gòu)。剛?cè)敕繒r，真菌豐度與菌群多樣性都較低，說明自然接種的微生物種類與數(shù)量都較低；主發(fā)酵期，曲心溫度升高，真菌大多不耐熱，導(dǎo)致并房后真菌的豐度與菌群多樣性都降至最低；此后進(jìn)入潮火期，隨著曲心溫度進(jìn)一步升高，能夠適應(yīng)高溫的真菌種類在大曲中不斷富集，因此上架時的真菌豐度與菌群多樣性都開始升高；隨著曲心溫度保持60 ℃左右進(jìn)入占火，嗜熱真菌進(jìn)一步增殖，曲皮水分也喪失殆盡，大火期的真菌豐度與菌群多樣性進(jìn)一步升至最高值；經(jīng)過大火期的高溫馴化與淘汰，下架時的真菌豐度與大火期相當(dāng)，但菌群多樣性降低；此后進(jìn)入養(yǎng)曲期，曲心水分進(jìn)一步降低，干燥缺水的環(huán)境逐漸不適合真菌的生長，因此出房時的真菌豐度基本不變，菌群多樣性也進(jìn)一步降低。

表1 大曲培養(yǎng)各階段真菌Alpha多樣性指數(shù)

2.3 OTU分布Venn分析

通過對中高溫制曲各階段的OTU 進(jìn)行統(tǒng)計分類，Venn 分析結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果顯示，真菌有11 個OTUs 是共有的；從入房到并房，真菌無變化；上架時緩慢增加；進(jìn)入大火期，真菌快速增加至最高點(diǎn)；下架時，真菌緩慢下降；出房時，真菌有所回升。

圖2 大曲培養(yǎng)各階段真菌OTUs交疊Venn圖

2.4 不同分類水平的物種變化

通過合并相同物種分類的OTUs，從門、綱、目、科、屬不同分類水平，統(tǒng)計平均含量前15 的物種，其余的物種歸于others 中，根據(jù)百分比繪制真菌的分布柱狀圖，結(jié)果見圖3與圖4。

圖3 大曲培養(yǎng)各階段真菌在門、綱、目與科水平上的分布變化

圖4 大曲培養(yǎng)各階段真菌在屬水平上的分布變化

從圖3 中可以看出，不同培養(yǎng)階段大曲中的真菌都是以子囊菌門和毛霉門為主，兩者占比超過90%以上，其中子囊菌門包括半子囊菌綱的酵母目和散囊菌綱的散囊菌目，毛霉門即毛霉綱的毛霉目。毛霉目前期很少，上架后才大量繁殖，豐度占比高達(dá)42 %，大火期間降至11 %，下架后回升至32%，出房后又緩落至20%；酵母目的豐度則先緩升后不斷下降，入房時即高達(dá)88 %，并房后升至99%以上，之后開始快速下降，上架、大火、下架時分別下降至52%、31%、6%，出房時回升至8%；散囊菌目則先下降后上升，入房時占比10%，而后緩慢下降至3 %，大火后迅速生長繁殖，豐度占比高達(dá)57 %，而后維持較高水平，下架、出房時分別為53%、70%。

從科水平看，以相對豐度1 %為下限，共檢測到12 個真菌科。入房時以酵母科、發(fā)菌科、曲霉科和法夫酵母科為主，占比分別為25%、22%、18%、16 %，此外還有豐度不足5 %的雙足囊菌科、德巴列酵母科、根霉科、橫梗霉。酵母科在并房后消失殆盡；發(fā)菌科先快速減少后逐漸增加，并房時消失殆盡，上架后開始逐漸增加，各個階段的豐度分別為2%、26%、54%、70%；曲霉科先減少、后增加、而后又減少，僅大火期高達(dá)32%，其他階段豐度都在1%～2%；法夫酵母科呈減少趨勢，并房時占比6 %，之后降至1 %以下；雙足囊菌科從入房時的4%增加至并房時的11%，而后降至1%以下，出房時回升至5%；德巴列酵母科在大曲培養(yǎng)各階段呈先增加后減少趨勢，上架和大火期豐度較高，分別為32 %、28 %；根霉科則呈波浪式變化，出房時豐度達(dá)10 %；屬于毛霉目的橫梗霉也大致呈先增加后減少趨勢，上架時豐度最高達(dá)56 %，出房時為11%。

在屬分類水平上，以相對豐度1 %為下限，共檢測到16 個真菌屬，結(jié)果如圖4 所示。入房時以孢圓酵母屬、嗜熱真菌屬、威克漢姆酵母屬和曲霉屬為主，占比分別為26%、21%、17%、14%；并房后，微生物群落發(fā)生顯著變化，主體微生物調(diào)整為柯達(dá)酵母屬、根毛霉屬、橫梗霉屬、威克漢姆酵母屬、生絲畢赤酵母屬、假絲酵母屬，豐度分別為35 %、19%、10%、6%、5%、5%；上架后，根毛霉屬、生絲畢赤酵母屬、橫梗霉屬的豐度分別增長至45 %、31 %、11 %；大火期，主體微生物轉(zhuǎn)變?yōu)?0 %的曲霉屬、29%的生絲畢赤酵母屬、27%的嗜熱真菌屬和7%的根霉屬；下架后，嗜熱真菌屬、根毛霉屬大量增長至54 %、31 %；出房后，嗜熱真菌屬占據(jù)絕對優(yōu)勢，豐度高達(dá)73%，此外還包括11%的根毛霉屬和10%的根霉屬。

2.5 群落分布特征

通過PCoA 主坐標(biāo)分析與豐度聚類熱圖研究中高溫制曲各階段真菌群落分布特征，結(jié)果顯示，圖5 中的第一軸能夠解釋數(shù)據(jù)64.6%的變量，第二軸能夠解釋數(shù)據(jù)18.5 %的變量，兩軸和為83.1 %。結(jié)合樣品在分布圖中的距離及其豐度聚類熱圖，可將真菌變化趨勢的類型分為四類：（1）在入房和并房階段，距離接近、同處于第二象限且聚為一類，說明這兩個階段的真菌群落結(jié)構(gòu)相似，可歸為同一階段，其中孢圓酵母屬主要在入房階段，柯達(dá)酵母屬主要在并房階段；（2）上架時，樣本與入房和并房階段距離較遠(yuǎn)，且單獨(dú)位于第三象限，可單獨(dú)歸為一類，此時伴隨溫濕度等環(huán)境因子的變化，大曲中水分營養(yǎng)充足，微生物結(jié)構(gòu)不斷進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，橫梗霉屬大量生長至最高豐度，假絲酵母屬、粉狀米勒氏酵母屬等豐度也升高；（3）大火期，樣本與入房、并房和上架階段的距離都較遠(yuǎn)，且單獨(dú)位于第四象限，結(jié)合豐度聚類熱圖，也單獨(dú)歸為一類，此時溫度等環(huán)境因素達(dá)到極限，不耐熱微生物逐漸被淘汰，生絲畢赤酵母屬、曲霉屬、節(jié)擔(dān)菌屬、青霉屬大量生長至最高豐度；（4）下架雖然與大火期距離較近，但下架和出房樣本同位于第一象限且距離不遠(yuǎn)，結(jié)合豐度聚類熱圖可將下架和出房樣本聚為一類，兩者可歸為同一階段，此時隨著品溫等環(huán)境因子漸趨溫和，微生物利用曲心殘留的水分和營養(yǎng)進(jìn)行生長繁殖與演替，根毛霉屬、粉狀米勒氏酵母屬、橫梗霉屬及未知屬在下架時豐度占據(jù)絕對優(yōu)勢，柯達(dá)酵母屬、假絲酵母屬、威克漢姆酵母屬、根霉屬在出房時豐度占據(jù)絕對優(yōu)勢，嗜熱真菌屬、紅曲霉屬、羅薩氏菌豐度在下架和出房時都較高。

圖5 大曲培養(yǎng)各階段真菌主坐標(biāo)分析圖

圖6 大曲培養(yǎng)各階段真菌群落豐度聚類熱圖

圖7 理化因子及酶活指標(biāo)與真菌優(yōu)勢屬的RDA分析

2.6 真菌群落與理化因子關(guān)聯(lián)分析

利用R 語言中RDA 分析和作圖，分析中高溫制曲過程中的真菌群落結(jié)構(gòu)與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性。理化因子關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，水分、糖化力、酯化力與真菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性較高，發(fā)酵力其次，酸度與真菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性較低，說明真菌主要對水分和酶活有較大影響，對酸度的影響較小。就主要優(yōu)勢屬看，發(fā)酵力與生絲畢赤酵母屬相關(guān)性較高，與曲霉屬、青霉屬也有一定的相關(guān)性；酯化力與嗜熱真菌屬、紅曲霉、威克漢姆酵母屬相關(guān)性較高，與羅薩氏菌、柯達(dá)酵母屬、根霉屬也有一定的相關(guān)性；水分和糖化力則與孢圓酵母屬的相關(guān)性較高。

3 總結(jié)與展望

本研究采用高通量基因測序技術(shù)對中高溫制曲培養(yǎng)各階段真菌不同分類水平的組成與豐度進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明：在門水平上以子囊菌門和毛霉門為主，其中子囊菌門包括半子囊菌綱的酵母目和散囊菌綱的散囊菌目，毛霉門即毛霉綱的毛霉目；在科水平上，以酵母科、發(fā)菌科、曲霉科和法夫酵母科為主；屬水平上，嗜熱真菌屬、根毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、生絲畢赤酵母屬、橫梗霉屬、威克漢姆酵母屬分別在制曲過程不同時期占據(jù)主導(dǎo)地位，前期主要是酵母屬，為大曲的釀酒和生香提供菌源，后期主要是耐高溫霉菌類微生物，為大曲提供糖化、液化以及生香相關(guān)的微生物。唐清蘭等[12]采用高通量測序技術(shù)跟蹤濃香型白酒大曲制曲過程真菌群落結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)伊薩酵母屬、嗜熱子囊菌屬、曲霉屬分別在制曲過程不同時期占據(jù)主導(dǎo)地位。不難發(fā)現(xiàn)，兩類大曲的真菌種類及其豐度存在明顯差異，這是由于大曲采用開放式生產(chǎn)、自然接種，環(huán)境、原料、工藝等對大曲微生物區(qū)系均有直接影響。

此外，本文通過RDA 分析首次發(fā)現(xiàn)真菌與水分和酶活關(guān)系密切。其中發(fā)酵力與生絲畢赤酵母屬相關(guān)性較高，生絲畢赤酵母屬是白酒發(fā)酵中的重要功能微生物，可以代謝產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，如乙酸乙酯、4-羥基-2-丁酮等[13-14]。酯化力與嗜熱真菌屬、紅曲霉、威克漢姆酵母屬相關(guān)性較高，其中嗜熱真菌屬耐高溫，最高生長溫度為50 ℃或以上，可產(chǎn)生嗜熱酶，包括纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等[12]；紅曲霉能分泌大量酯酶，對碳酸十四乙酯和苯乙醇的形成有促進(jìn)作用[15]；威克漢姆酵母屬能夠?qū)⒃现械那绑w物質(zhì)轉(zhuǎn)化成酯、酸、醇、醛等風(fēng)味物質(zhì)，對白酒風(fēng)味形成有重要作用[16]。水分與孢圓酵母屬的相關(guān)性較高，孢圓酵母屬是非釀酒酵母菌，但通過其獨(dú)特的次生代謝物也可對酒的感官特性作出積極貢獻(xiàn)[15]。

通過研究，明確了中高溫制曲過程中真菌群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律，并首次解析了真菌種類與大曲的發(fā)酵和生香之間的潛在關(guān)系，有助于中高溫大曲真菌多樣性形成機(jī)制的解析，從而提高對大曲微生物認(rèn)識的深度和廣度，為中高溫大曲生產(chǎn)提供參考與借鑒。下一步，我們將結(jié)合微生物與非生物因素進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，如溫度、濕度、氧氣、門窗管控等，以全面準(zhǔn)確地研究中高溫大曲微生態(tài)演變的內(nèi)在驅(qū)動力。