周惠玲 張卓成 陳建勇 梁惠強 曹令儀

耳聾是人類常見的感覺缺陷性疾病，位列各類殘疾之首，嚴重影響患者的日常溝通交流，降低其生活質量。耳聾可發(fā)生于各年齡段，導致耳聾的原因主要有環(huán)境因素和遺傳因素，其中60%以上與遺傳因素有關［1］，而遺傳性耳聾是由基因或染色體異常等遺傳缺陷導致的，具有高度的遺傳異質性［2］。根據(jù)臨床表型是否伴有耳外其他器官功能障礙和異?？煞譃榫C合征性耳聾（syndromic hearing loss，SHI）和非綜合征性耳聾（non-syndromic hearing loss，NSHI），其中NSHI 占60%～70%［3］。根據(jù)遺傳方式不同耳聾可分為常染色體隱性遺傳（約占80%）、常染色體顯性遺傳（約占15%）、線粒體突變母系遺傳（約占1%）或X 連鎖遺傳（占2%～5%）［4］。

近年來，隨著現(xiàn)代科學技術的進步以及分子生物學和分子遺傳學的飛速發(fā)展，人類已克隆了50 多個遺傳性耳聾基因，定位了100 多個NSHL 相關基因位點。但國內耳聾基因的分子流行病學研究表明，我國大部分NSHI 由為數(shù)不多的幾個基因突變引起［5］，其中GJB2 和SLC26A4 基因是導致NSHI 常染色體隱性遺傳的主要致病基因，SLC26A4 基因突變僅次于GJB2 基因［6-9］。目前對耳聾的治療效果并不顯著，因此及時發(fā)現(xiàn)耳聾并且明確其病因，給予早期治療及科學指導，從而延緩病情進展就顯得尤為重要［10］。本研究通過收集廣東省部分地區(qū)100 例NSHI 患者的臨床資料，并采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）-熒光雜交發(fā)法檢測GJB2和SLC26A4 基因的14 個突變位點，分析該地區(qū)耳聾基因的流行情況，為遺傳性耳聾的防治工作提供理論依據(jù)，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象 選擇2022年5月—2023年4月在本院耳鼻喉科就診的感音神經(jīng)性耳聾患者中，經(jīng)病史采集、體格檢查、聽力學及影像學檢查確診為NSHI的100 例患者作為研究對象。其中男性39 例，女性61 例；年齡8～87 歲，平均（50.19±19.45）歲。

1.1.1 納入標準 ① 患者籍貫均為廣東地區(qū)，主要包括江門、中山、珠海等地；② 患者本人或監(jiān)護人均對本研究內容知情同意。

1.1.2 排除標準 SHI 或其他中樞性及外周性明確致病因素導致的耳聾患者。

1.1.3 倫理學 本研究符合醫(yī)學倫理學標準，并經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審批（審批號：2023-102），所有檢測均獲得過受檢對象或家屬的知情同意。

1.2 儀器與試劑 本研究使用的核酸提取試劑盒為廣州美基生物科技有限公司提供的DNA 提取試劑盒（證書編號：粵穗械備20150062 號），擴增儀器為ABI Proflex梯度PCR儀（美國應用生物系統(tǒng)公司），使用Luminex MagPix 多功能懸浮點陣檢測儀（美國Luminex 公司）進行檢測并分析結果。

1.3 聽力學診斷 采用電生理檢測方法，使用丹麥國際聽力公司提供的ECLISPE 聽覺腦干誘發(fā)電位測試儀對患者在隔音屏蔽室內進行測試。囑患者取舒適平臥位，閉目休息，保持平靜；給予短聲交替波刺激，刺激速率21.1 次/s，平均疊加次數(shù)為1 024 次，采用刺激強度為90 dBnHL 的記錄曲線，以兩次穩(wěn)定波形的疊加標識Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波；以Ⅴ波反應閾值作為2～4 kHz 聽力參考指標，Ⅴ波反應閾值＜30 dBnHL為正常聽力指標。根據(jù)聽力損傷程度分級標準［11］，輕度聾：波V 反應閾值為31～50 dBnHL；中度聾：51～70 dBnHL；重度聾：71～90 dBnHL；極重度聾：≥91 dBnHL。

1.4 影像學檢查 對疑似前庭水管病變的患者行64 排顳骨CT 平掃，診斷標準及分類按照Sennaroglu分類標準，分為單純前庭水管擴大、大前庭導水管綜合征（large vestibular aqueduct syndrome，LVAS）、其他內耳畸形及內耳結構正常［12］。

1.5 耳聾基因檢測 收集患者2 mL 外周血〔以乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetra-acetic acid，EDTA）抗凝〕，使用核酸提取試劑盒提取DNA。應用PCR 儀對GJB2基因（包括508_511dup、299_300del、35delG、109 G＞A、176_191del、235delC位點）和SLC26A4基因（包括754T＞C、IVS7-2A＞G、1174A＞T、1229C＞T、1692dup、1975G＞C、2086C＞T、2168A＞G 位點）的14 個常見突變位點進行擴增，將擴增產(chǎn)物與試劑盒微珠進行雜交，使用多功能懸浮點陣檢測儀及配套軟件進行檢測及信號收集，根據(jù)野生型探針/突變型探針信號（normal/mutation，N/M）的高低對檢測結果進行判讀。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間比較使用χ2檢驗，如果n＜40，采用Fisher精確檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 聽力學檢查結果 49 例研究對象為輕度至極重度感音神經(jīng)性聾，雙側聽力下降28 例，單側聽力下降21 例。見表1。

表1 100 例NSHL 患者聽力學耳聾分類

2.2 耳聾基因檢測結果 100 例NSHL 患者中檢出34 例耳聾基因突變，突變檢出率為34.00%（34/100），其中單基因純合突變11 例，單基因雜合突變23 例，多基因復合突變2 例。雙側聽力下降組基因突變陽性檢出率為51.78%（29/56），單側聽力下降組陽性檢出率為11.36%（5/44），比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝17.91，P＝0.00）。

本研究檢出GJB2 基因突變攜帶者34 例，檢出率為34.00%（34/100）。雙側聽力下降組陽性檢出率為51.78%（29/56），單側聽力下降組陽性檢出率為11.36%（5/44），差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝17.91，P＝0.00）。其中單基因純合突變11 例，單基因雜合突變23 例。突變位點主要為c.109 G＞A，占比為91.17%（31/34），其次為c.235delC 突變，占比為8.82%（3/34），其中1 例為c.235delC 純合突變。檢出SLC26A4 基因突變攜帶者2 例，檢出率為2.00%（2/100），檢出c.IVS7-2A＞G 和c.1229C＞T 突變各1 例，均為雙側聽力下降組，且合并GJB2 突變，多基因復合突變率為2.00%。耳聾基因突變的檢出情況見表2。

表2 NSHL 患者基因突變位點的檢出情況

2.3 GJB2 基因c.109 G＞A 位點分析 GJB2 基因的c.109G＞A 位點突變在本研究中的檢出率較高，其中雜合突變21 例，純合突變10 例，患者受累耳數(shù)目與突變類型的關系無統(tǒng)計學意義（P＝0.576）。見表3?；紓榷犃φ系K嚴重程度與突變類型的關系見表4。c.109G＞A 位點純合突變者以中、重度耳聾為主，雜合突變者以輕度耳聾為主。

表3 NSHL 患者受累耳數(shù)目與突變類型的關系

表4 NSHL 患者患側耳聽力障礙程度與突變類型的關系

GJB2 基因的c.109 G＞A （p.Val37Ile）位點突變是一種錯義突變，導致其編碼的37 位氨基酸發(fā)生突變（纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔?。檢索ClinVar 數(shù)據(jù)庫，致病性突變評分見圖1，將該點突變定義為致病性突變。使用SWISS-MODLE 數(shù)據(jù)庫預測突變位點模型，見圖2～3。

圖1 ClinVar 數(shù)據(jù)庫致病性突變評分

圖2 野生型GJB2 分子模型

圖3 GJB2 基因c.109 G ＞A（p.Val37Ile）位點分子模型

3 討論

遺傳性耳聾是臨床上常見的遺傳病，其發(fā)生由基因或染色體異常等遺傳缺陷導致，具有高度的遺傳異質性，不同國家、地區(qū)和人群中耳聾基因的突變方式、突變頻率和突變位點均存在巨大差異，且不同人種和民族也有其自身特點。在我國的遺傳性耳聾患者中，約有35.5%與GJB2 或SLC26A4 基因突變有關［13］。本研究通過對廣東省部分地區(qū)NSHI患者的GJB2 及SLC26A4 基因突變位點進行分析，了解該地區(qū)耳聾基因的突變熱點，從而為防聾治聾工作提供指導。

GJB2 基因突變是最常見的致聾原因，NSHI 患者攜帶率高達28%，常見的突變形式包括235delC、176-191dell、167delT、35delG 等位點［14］。GJB2 基因主要編碼縫隙連接蛋白26（connexin26，Cx26），該蛋白以六聚體形式結合，形成縫隙連接，是耳蝸內鉀離子的運輸通道，可維持耳蝸內較高的水平電位，GJB2 基因突變可導致Cx26 蛋白出現(xiàn)功能缺陷，影響細胞間信號傳遞，減少鉀離子的再循環(huán)效率，導致患者聽力受損［15］。本研究中GJB2 基因的突變率為34.00%，高于全國GJB2 總致病突變率（12.88%）［16］，且明顯高于王蒙等［17］報道的廣東地區(qū)NSHI 患者的GJB2 基因突變攜帶率為9.47%，這可能是由于本研究檢測的突變位點數(shù)量較多，因此增加了檢出率。本研究可檢的GJB2 基因突變位點雖多，但100 例患者中只檢出c.235delC 和c.109G＞A 兩種突變，可能是納入研究的患者數(shù)量較少，導致突變檢出類型較少，且入組的患者年齡偏大，可能與遲發(fā)型耳聾相關。本研究中GJB2 基因c.235delC 位點的突變檢出率為3.00%，與王蒙等［17］報道一致。GJB2 基因突變所致的耳聾多發(fā)生于嬰幼兒時期，如本研究中年齡最小的患兒8 歲，為GJB2 基因c.235delC 位點純合突變攜帶者，較早出現(xiàn)嚴重的聽力損傷。一般不認為GJB2 基因c.235delC 位點單雜合突變能致病，但本研究中有1 例35 歲患者攜帶c.235delC 位點單雜合突變，出現(xiàn)雙耳中度聽力下降，與李琦等［18］研究一致，c.235delC 位點單雜合突變攜帶者中年時即可出現(xiàn)中/高頻聽力損失。

GJB2 基因c.109 G＞A（p.Val37Ile）突變是一種錯義突變，導致其編碼的氨基酸發(fā)生變化（纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔?。該變異在我國人群中有較高的檢出率（8%～12%），本研究中NSHI 患者的檢出率為34.00%（34/100），明顯高于人群攜帶率。過去認為該突變是一種多態(tài)性改變，并不會直接導致遺傳性耳聾的發(fā)生［19］。但隨著研究深入，當c.109 G＞A（p.Val37Ile）位點純合或單雜合變異與另一個單雜合致病突變同時存在時，可導致耳聾疾病發(fā)生［20］。Li等［21］研究表明，c.109 G＞A 位點純合或雜合突變可導致患者出生時輕度聽力下降，并隨著年齡的增長進行性加重，這可能是由于該位點突變增加了由不良環(huán)境因素導致的耳聾概率。查閱ClinVar 數(shù)據(jù)庫，將此突變定義為致病性突變，應用SWISS-MODLE數(shù)據(jù)庫預測突變位點模型，可以看出突變的氨基酸導致肽鏈空間結構發(fā)生變化，這可能導致蛋白質功能的改變，從而引起一系列病變。本研究中NSHI患者的c.109 G＞A 位點突變攜帶率較高，表明該基因突變可能是出生后聽力下降的高危因素。

SLC26A4 基因是在我國第二高發(fā)的突變致聾基因，約有14.5%的耳聾患者攜帶該基因突變［22］。SLC26A4 基因有21 個外顯子，能夠編碼溶脂蛋白（Pendrin 蛋白），異常的Pendrin 蛋白失去正常離子轉運功能，導致耳蝸內淋巴離子環(huán)境失衡，進而導致耳聾。SLC26A4 基因突變可導致LVAS、NSHI 和先天性耳聾伴甲狀腺腫綜合征［23］。本研究SLC26A4基因突變率為2.00%，低于全國檢出水平，可能是由于廣東地區(qū)SLC26A4 基因突變攜帶率低或標本量少導致的低檢出率。SLC26A4 基因檢出了在我國居民中較常見的突變熱點c.IVS7-2A＞G 和少見的c.1229C＞T 突變各1 例，均為雙側聽力下降組，且合并GJB2 突變，為雙基因雜合突變。翻查CT 報告，兩例攜帶者均無前庭導水管擴大，但臨床醫(yī)生應叮囑患者避免頭部外傷，預防呼吸道感染，不進行潛水活動，避免乘坐飛機等，以免壓力變化導致疾病的發(fā)生發(fā)展。

本研究使用的PCR-流式熒光檢測技術又稱液態(tài)懸浮點陣檢測技術，是一種新的適用于臨床的高通量、自動化分析技術［24-25］。該方法的優(yōu)勢為在核酸擴增的基礎上，將產(chǎn)物與標記微珠進行雜交染色，提高檢測結果的敏感度和特異度；高通量可將多個基因突變整合到同一檢測系統(tǒng)中，一次性完成多個位點的檢測；實驗步驟簡單，大大縮短檢測時間。

4 結論

綜上所述，廣東省部分地區(qū)NSHI 患者主要的致病基因為GJB2，主要的突變位點為c.109 G＞A，該地區(qū)耳聾基因與其他地區(qū)有明顯差異。在臨床工作中，應早期開展耳聾基因檢測，明確病因，預測病情變化，協(xié)助耳聾預防及治療，同時應指導并阻斷耳聾遺傳，預防下一代耳聾發(fā)生。而在耳聾基因檢測中，應用PCR-流式熒光檢測技術可以實現(xiàn)高通量、便捷等優(yōu)點，作為現(xiàn)有檢測方法的一種補充，具有廣闊的臨床應用前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突