賈紅梅

結(jié)直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，也是全世界癌癥患者死亡的第二大原因，在2020 年有超過180 萬例新病例和90 萬例患者死亡［1］。結(jié)直腸癌的早期診斷率普遍較低，大多數(shù)患者在中晚期才被確診，結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移受淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響，也是預(yù)后的關(guān)鍵因素［2］。因此，對結(jié)直腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的深入研究十分必要。結(jié)直腸癌主要由環(huán)境因素、遺傳因素及其相互作用引起，與至少三種不同的遺傳途徑相關(guān)，包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、染色體不穩(wěn)定性和CpG 二核苷酸（CpG 島）甲基化表型［3］。其中，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的特征是DNA 甲基化或基因突變引起，導(dǎo)致短重復(fù)序列長度的廣泛改變。錯配修復(fù)蛋白是結(jié)直腸癌的特異性分子標(biāo)志物，錯配修復(fù)蛋白的種系突變可引起錯配修復(fù)基因失活，進(jìn)而造成無法修復(fù)的錯誤DNA 復(fù)制，導(dǎo)致正常細(xì)胞的基因組發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞。

有研究表明，錯配修復(fù)蛋白是影響結(jié)直腸癌發(fā)生的風(fēng)險因素。MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 均為常見錯配修復(fù)蛋白，但其與結(jié)直腸癌患者淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)性尚不明確［4］。人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）是一種與惡性腫瘤密切相關(guān)的大分子，與癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)有關(guān)，可能會影響結(jié)直腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［5］?；诖?，本研究分析錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 表達(dá)及Her-2 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象及一般資料 選擇2020 年12 月—2023 年1 月東營市河口區(qū)中醫(yī)院收治的116 例結(jié)直腸癌患者作為研究對象。其中男性64 例，女性52 例，年齡32～78 歲，平均（52.11±6.62）歲；體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）18.9～26.7 kg/m2，平均（22.17±0.86）kg/m2；腫瘤直徑0.9～67.7 mm，平均（34.1±5.6）mm；TNM分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期46例，Ⅲ期34 例，Ⅳ期23 例；病理組織學(xué)診斷：黏液腺癌50 例，非黏液腺癌66 例；腫瘤部位：左半結(jié)腸39 例，右半結(jié)腸33 例，直腸44 例；侵襲程度：黏膜及下層2 例，肌層19 例，漿膜及其外部95 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57 例。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ① 符合《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2020 年版）》［6］診斷標(biāo)準(zhǔn)；② 經(jīng)組織病理學(xué)診斷確診為結(jié)腸癌或直腸癌；③ 切除前未進(jìn)行化療或放療；④ 資料完整；⑤ 意識與認(rèn)知功能無異常，可正常交流；⑥ 愿意接受隨訪。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ① 腫瘤復(fù)發(fā)；② 合并其他惡性腫瘤；③ 患有精神疾??；④ 患有嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)、肝臟、腎臟或心血管疾病。

1.1.3 倫理學(xué) 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)東營市河口區(qū)中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過（審批號：20230809），患者與家屬均知情同意。

1.2 儀器與試劑 MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 抗體試劑盒均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供，Her-2 表達(dá)檢測試劑盒由圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司公司提供。

1.3 研究方法 研究對象均通過兩名病理醫(yī)師診斷為結(jié)腸癌或直腸癌，收集術(shù)后腫瘤組織和鄰近組織，使用4%中性甲醛液固定，進(jìn)行石蠟包埋（石蠟切片厚度為3～4 μm）及蘇木素-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色。采用Max Vision 二步法進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)，于65 ℃烤片2 h，石蠟切片，脫蠟、水化，使用磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行3 次沖洗（每次30 min），使用過氧化物酶阻斷劑對內(nèi)源性過氧化酶活性進(jìn)行封閉10 min，加入一抗至組織完全覆蓋。在室溫下孵育至恢復(fù)室溫，加入生物素標(biāo)記的二抗至組織被完全覆蓋，向其中滴加DAB 顯色試劑，放置5 min，使用蘇木素復(fù)染1 min，流水沖洗，常規(guī)脫水、透明和封片。

1.3.1 錯配修復(fù)蛋白表達(dá)檢測 使用免疫組化法抗體試劑盒檢測MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 蛋白的陽性表達(dá)率。判斷標(biāo)準(zhǔn)：錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 均定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核（間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、浸潤淋巴細(xì)胞）呈黃色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，細(xì)胞核不著色為缺失。在400 倍顯微鏡下隨機(jī)選擇每張切片10 個視野，記錄陽性細(xì)胞占比。染色強(qiáng)度為深棕色、深黃色、淺黃色、不著色分別記為3 分、2 分、1 分、0 分，陽性細(xì)胞占比＞80%、51%～80%、11%～50%、≤10%分別計(jì)為4分、3分、2 分、1 分，染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞占比評分的乘積≥2 分表示錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 為陽性表達(dá)，任意一項(xiàng)缺失均可判定為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。

1.3.2 Her-2 表達(dá)檢測 使用免疫組化法試劑盒測定Her-2 表達(dá)陽性率。判斷標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本顯色度為棕黑色、棕黃色、淡黃色、無色分別記為3 分、2 分、1 分、0 分，陽性細(xì)胞占比＞75%、51%～75%、11%～50%、≤10%分別記為4 分、3 分、2 分、1 分，標(biāo)本顯色度評分與陽性細(xì)胞占比評分之和為Her-2 表達(dá)評判標(biāo)準(zhǔn)，評分≥4 分、2～3 分、＜2 分可分別判定為強(qiáng)陽性、陽性、陰性。

1.3.2 患者分組 參考《腫瘤病理診斷規(guī)范（結(jié)直腸癌）》［7］以及結(jié)合病理形態(tài)學(xué)診斷結(jié)果，確定結(jié)直腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生情況，根據(jù)是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（59 例）和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（57 例）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Logistic 回歸分析檢驗(yàn)MSH2、MSH6、MLH1、PMS2、Her-2 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。繪制受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC 曲線），并計(jì)算ROC曲線下面積（area under ROC curve，AUC），檢驗(yàn)MSH2、MSH6、MLH1、PMS2、Her-2 表達(dá)對結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的評估價值，AUC＞0.90 表示評估性能較高，0.71≤AUC≤0.90 表示有一定評估性能，0.50≤AUC＜0.71 表示評估性能較低，＜0.50 表示無評估性能。

2 結(jié)果

2.2 Logistic 回歸分析錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 表達(dá)及Her-2 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 將結(jié)直腸癌患者淋巴轉(zhuǎn)移情況作為狀態(tài)變量（1＝有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，0＝無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移），將MSH2（1=缺失，0=陽性）、MSH6（1＝缺失，0＝陽性）、MLH1（1＝缺失，0＝陽性）、PMS2（1＝

2.1 是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 表達(dá)及Her-2 表達(dá)陽性比較 病理形態(tài)學(xué)診斷結(jié)果顯示，本研究116 例結(jié)直腸癌患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57 例。兩組MSH6 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的MSH2、MLH1、PMS2 缺失率及Her-2 陽性率均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。缺失，0＝陽性）、Her-2（1＝陽性，0＝陰性）表達(dá)作為自變量，經(jīng)Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，錯配修復(fù)蛋白MSH6 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P＞0.05），錯配修復(fù)蛋白MSH2、MLH1、PMS2 表達(dá)及Her-2 表達(dá)均與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（均P＜0.05）。見表2。

表1 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況結(jié)直腸癌患者錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 及Her-2 表達(dá)比較

表2 Logistic 回歸分析錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 表達(dá)及Her-2 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

2.3 錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 表達(dá)及Her-2 表達(dá)對結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的評估價值 將結(jié)直腸癌患者淋巴轉(zhuǎn)移情況作為狀態(tài)變量（1＝有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，0＝無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移），將MSH2（1＝缺失，0＝陽性）、MSH6（1＝缺失，0＝陽性）、MLH1（1＝缺失，0＝陽性）、PMS2（1＝缺失，0＝陽性）、Her-2（1＝陽性，0＝陰性）表達(dá)作為檢驗(yàn)變量，繪制ROC 曲線圖。結(jié)果顯示，錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 表達(dá)及Her-2 表達(dá)評估結(jié)直腸癌患者淋巴轉(zhuǎn)移的AUC 分別為0.567、0.516、0.567、0.567、0.614，均有一定評估價值，但評估性能不高。見圖1，表3。

圖1 錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 表達(dá)及Her-2 表達(dá)對結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評估價值的ROC 曲線

3 討論

結(jié)腸直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，全世界每年約有120 萬例新發(fā)病例和60 萬例死亡病例［8］。結(jié)直腸癌具有復(fù)雜的生物學(xué)行為，并且容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，結(jié)直腸癌療效差往往與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)［9］。因此，迫切需要了解如何預(yù)測和控制淋巴轉(zhuǎn)移，并在臨床上對腫瘤進(jìn)行早期綜合治療。

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是多種基因和因素共同作用的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜［10］。錯配修復(fù)系統(tǒng)可以及時修復(fù)受損的DNA，保證遺傳信息的穩(wěn)定性，錯配修復(fù)缺陷被定義為在腫瘤和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性中缺乏免疫組織化學(xué)可檢測的錯配修復(fù)蛋白表達(dá)，當(dāng)錯配修復(fù)系統(tǒng)存在缺陷時，由于校對和修復(fù)功能減弱或缺失，受損的DNA 不能被及時修復(fù)，導(dǎo)致DNA 錯配的積累，造成微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變［11-13］。Her-2 是Her 家族的成員，也是一種原癌基因，Her-2 基因擴(kuò)增和蛋白過表達(dá)參與了幾種人類癌癥的發(fā)病和進(jìn)展，包括肺癌、前列腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等，因此常被認(rèn)為是一種不良預(yù)后因素［14］。本研究結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者體內(nèi)MSH6 表達(dá)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的MSH2、MLH1、PMS2缺失率及Her-2 陽性表達(dá)率均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，錯配修復(fù)蛋白MSH6 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴轉(zhuǎn)移無相關(guān)性，錯配修復(fù)蛋白MSH2、MLH1、PMS2 表達(dá)及Her-2表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。分析原因?yàn)椋篗SH2 與大腸埃希菌MutS 基因同源，參與DNA錯配修復(fù)，可以處理DNA 損傷的修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［15］。MLH1 編碼的蛋白質(zhì)是DNA 損傷信號的一部分，MLH1 可參與DNA 錯配的修復(fù)系統(tǒng)，并參與減數(shù)分裂［16］。錯配修復(fù)蛋白在維持DNA 的結(jié)構(gòu)和功能中具有重要的作用，隨著這種修復(fù)機(jī)制的喪失，復(fù)制期間的錯誤率增加了100～1 000 倍，可能表現(xiàn)為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性引起的癌基因激活或抑癌基因失活，也可能表現(xiàn)為直接引起癌基因或抑癌基因突變，從而誘發(fā)癌變［17-18］。錯配修復(fù)蛋白缺失患者的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性顯著增加，從而導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率相應(yīng)增加。Her-2 是一種由細(xì)胞癌基因編碼的具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞基因組的正常組成部分，參與對細(xì)胞生長、分化和分裂的調(diào)節(jié)［19］。Her-2 激活引起異?；驍U(kuò)增、異常轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和mRNA 過度表達(dá)，其蛋白產(chǎn)物過度表達(dá)并產(chǎn)生腫瘤轉(zhuǎn)化活性，造成表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）蛋白激酶的持續(xù)激活，使細(xì)胞生長失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，加快腫瘤的生長，誘發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［20］。另外，本研究繪制ROC 曲線圖，結(jié)果顯示，錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 表達(dá)及Her-2 表達(dá)評估結(jié)直腸癌患者淋巴轉(zhuǎn)移的AUC 分別為0.567、0.516、0.567、0.567、0.614，均有一定評估價值，但評估性能不高。

綜上所述，錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1、PMS2 表達(dá)缺失及Her-2 陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

利益沖突作者聲明不存在利益沖突