吳長煒, 劉佳宇, 邱 曉, 呂文文, 井銳涵, 張大偉

(東北林業(yè)大學 材料科學與工程學院,黑龍江 哈爾濱 150040)

殼聚糖(CS)是一種帶有氨基的親水性高分子有機物,通常由甲殼素經(jīng)堿水解或酶解脫乙酰基制得,因其具有優(yōu)異生物降解性、生物相容性、生物黏附性和抗菌活性等特點而被用于各種活性化合物(如藥物、蛋白質、維生素和基因)的受控遞送[1]。由于殼聚糖主鏈上氨基的強烈氫鍵作用,需要用酸性溶液將氨基轉變成銨離子,才能提高其水溶性與抑菌性,但作為傷口敷料、組織工程支架材料時的使用環(huán)境為中性環(huán)境,以及溶解在酸性溶液中CS的β-1,4-糖苷鍵容易發(fā)生降解,使其對金黃色葡萄球菌、尖孢鐮刀菌、大腸桿菌等的抑菌性能降低,限制其在生物醫(yī)學、農業(yè)等領域的應用[2-3]。雖然可通過CS改性來增強其在中性水中的溶解性和抗菌性能,但反應條件溫和、耗時短、性能優(yōu)、可大規(guī)模生產(chǎn)的CS改性技術鮮有報道,如鄭宏飛等[4]將殼聚糖溶解在離子溶液中,但是其處理條件較為嚴苛,不利于大規(guī)模生產(chǎn)使用;符思達等[5]使用賴氨酸改性的殼聚糖,雖然可以在水中幾乎完全溶解,但所耗的時間相對較長,使其難以得到廣泛應用。香豆素是鄰羥基桂皮酸內脂類化合物的統(tǒng)稱,具有抗氧化、抗突變、抗炎等生物活性,已作為許多藥物的重要組分部分[6]。本研究采用酯化改性的方法,先將7-羥基香豆素進行酯化改性得到7-甲酯酰氯香豆素,再利用其對CS進行酰胺化改性,制得香豆素酰化殼聚糖(CS-C),并考察了產(chǎn)物的化學結構、熱穩(wěn)定性、結晶性、溶解性和抑菌性能等,以期獲得具有良好抗菌性能和在中性水中能良好溶解的香豆素?；瘹ぞ厶?。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

7-羥基香豆素,純度98%,阿拉丁生化科技有限公司;殼聚糖,粒徑30 μm,脫乙酰度91%,黏均相對分子質量2.2×105,浙江金殼藥業(yè)有限公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),廣東省微生物菌種保存中心;營養(yǎng)瓊脂,北京奧博星生物技術有限責任公司;胰蛋白胨,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;酵母提取物,西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;草酰氯、丙酮、三乙胺、二甲基亞砜、氯化鈉、氫氧化鈉,均為市售分析純。

Tensor II傅里葉紅外光譜儀,德國布魯克公司;209 F3熱重分析儀,德國耐馳儀器制造有限公司;D/max-2200VPC X射線衍射儀,日本理學公司;IKA?RV10旋轉蒸發(fā)儀,廣州儀科實驗室技術有限公司。

1.2 7-甲酯酰氯香豆素酰化改性殼聚糖的制備

1.2.17-甲酯酰氯香豆素的制備 室溫條件下,將5 g 7-羥基香豆素加入到95 g丙酮中,充分攪拌使其完全溶解。在0 ℃冰水浴、氮氣保護的條件下加入草酰氯(草酰氯與香豆素的質量比為1∶1)進行均相反應,反應3 h后將產(chǎn)物分3次加入6 g干燥的三乙胺中,攪拌5 h,去除過量的草酰氯及產(chǎn)生的氯化氫,過濾去除三乙胺與草酰氯反應產(chǎn)生的副產(chǎn)物,然后減壓蒸餾除溶劑,向其中加入1% NaOH溶液過濾,用蒸餾水及少量乙醇洗滌濾餅至pH值為7.4后用丙酮重結晶制得7-甲酯酰氯香豆素,反應式如下:

1.2.2?；男詺ぞ厶堑闹苽?取1 g制備得到的7-甲酯酰氯香豆素溶于丙酮中配制質量分數(shù)5%丙酮溶液,加入一定量的CS粉末,進行非均相的接枝反應,反應在氮氣保護及0 ℃冰水浴的條件下進行。攪拌反應12 h后,50 ℃ 旋轉蒸發(fā)丙酮溶劑,獲得7-羥基香豆素酰化改性殼聚糖(CS-C),反應式如下:

CS與7-甲酯酰氯香豆素的質量比為1∶1、 1∶2、 1∶3、 1∶4和1∶5時,制備的7-羥基香豆素酰化改性殼聚糖分別標記為CS-C-1、CS-C-2、CS-C-3、CS-C-4和CS-C-5。

1.3 結構表征與性能測試

1.3.1FT-IR分析 使用紅外光譜(FT-IR)儀對7-羥基香豆素、 7-甲酯酰氯香豆素、CS以及不同比例的CS-C化合物進行分析,掃描范圍4 000～500 cm-1,分辨率4 cm-1。

1.3.2—NH2取代度的測定 稱取0.2 g干燥樣品于錐形瓶中,加入25 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液,搖勻后靜置2 h。用標記酚酞的HCl標準液(含有1～2滴酚酞)滴定上述溶液,當紅色消失且30 s內不重現(xiàn),結束滴定?！狽H2取代度(Ds)的計算,按式(1)進行。

(1)

式中:Ds——NH2取代度,%;C1—標準氫氧化鈉溶液的濃度,mol/L;V1—標準氫氧化鈉溶液的體積,L;C2—標準鹽酸溶液的濃度,mol/L;V3—CS-C消耗標準鹽酸的體積,L;V2—CS消耗標準鹽酸的體積,L;m0—CS的質量,g;m1—CS-C的質量,g。

1.3.3熱重分析 使用熱重分析儀測定了CS以及CS-C化合物的熱穩(wěn)定性,測試溫度范圍為25～600 ℃,升溫速率為10 ℃/min。

1.3.4溶解性能的測定 稱取0.1 g凍干樣品于燒杯中,加入20 mL二甲基亞砜,在30 ℃下一邊攪拌一邊緩慢加入20 mL蒸餾水,隨后高速攪拌20 min,置于離心管中,5 000 r/min下離心15 min;離心后所得固體顆粒經(jīng)120 ℃ 干燥至質量恒定,記錄殘余質量。CS-C溶解度由式(2)計算。

S=(m2-m3)/m2×100%

(2)

式中:S—溶解度,%;m2—樣品初始質量,g;m3—樣品殘余質量,%。

1.3.5抑菌性能測試 采用最小抑菌濃度法[7]對CS及CS-C-3的抑菌性能進行測試。分別稱取5 g CS與CS-C-3于去離子水中配置5種不同濃度的懸浮液備用。按照如下比例制備液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉10 g/L,用0.1 mol/L NaOH溶液調節(jié)培養(yǎng)基pH值7.4,然后將懸浮液與液態(tài)培養(yǎng)基按體積比1∶1混勻?；旌吓囵B(yǎng)基中分別植入大腸桿菌與金黃色葡萄球菌。測試液質量濃度分別為0.25、 0.5、 1、 2和4 g/L,混合培養(yǎng)基中注入0.1 mL細菌(濃度約為10-5cfu/mL)。所有的培養(yǎng)基混勻后均放在37 ℃ 恒溫振蕩培育箱中,1 000 r/min振蕩培育24 h,用渾度儀檢測試管中細胞生長狀態(tài),即液態(tài)培養(yǎng)基有無渾濁,液態(tài)渾濁程度越大說明抑菌性越差,未渾濁的最低濃度為最小抑菌濃度(MIC)。

另外,采用最小殺菌濃度法[8]對CS及CS-C-3的滅菌性也進行了測試,測試的細菌同樣為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。具體做法如下:將6.6 g營養(yǎng)瓊脂溶解于200 mL蒸餾水中制備營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在121 ℃ 高壓滅菌40 min,之后置于培養(yǎng)皿內,在超凈工作臺上用微量加樣器在培養(yǎng)基中分別植入0.1 mL濃度約為10-5cfu/mL的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌,均勻涂布后取100 μL上述抑菌測試實驗中配置的不同濃度的CS與CS-C-3的懸浮液轉移到培養(yǎng)基中,然后在37 ℃培養(yǎng)24 h,通過透明度測定儀觀察培養(yǎng)基的透明性從而來判斷菌群的生長情況,培養(yǎng)基透明性越好,表明菌群被殺滅的程度越高,培養(yǎng)基透明性最好的懸浮液濃度是材料的最小殺菌濃度(MBC)。

2 結果與討論

2.1 7-甲酯酰氯香豆素的FT-IR分析

7-羥基香豆素以及7-甲酯酰氯香豆素的FT-IR光譜如圖1所示。由圖可知,在7-甲酯酰氯香豆素的光譜中,在3 170 cm-1處的7-羥基香豆素的—OH基團的特征吸收峰[9]消失,在1 710 cm-1處出現(xiàn)羰基的特征吸收峰,在1 790 cm-1處出現(xiàn)酰氯基團的特征峰,1 220和1 120 cm-1處的譜帶是由C—O—C基團振動產(chǎn)生的,證明7-羥基香豆素與草酰氯發(fā)生?；磻玫?-甲酯酰氯香豆素。

2.2 7-羥基香豆素酰化改性殼聚糖(CS-C)的結構表征

2.2.2XRD分析 用X射線衍射法研究了CS以及CS-C的晶體結構,結果如圖2(b)所示。由圖可知,CS的X射線衍射圖在2θ=11.26°和20.05°處的兩個特征峰,分別是由CS結構中分子內與分子間氫鍵作用以及高脫乙酰度CS鏈中的結晶引起的。CS經(jīng)過酰化改性后的CS-C,在X射線衍射圖2θ=11.26°處的衍射峰消失,并且2θ=20.05°處衍射峰強度降低,證明CS-C結構中的晶區(qū)減少,這是因為改性后其晶體結構被破壞,同時分子內與分子間氫鍵作用被削弱,降低了CS分子的結晶程度。

2.2.3Ds分析 不同CS與7-甲酯酰氯香豆素質量比制備的CS-C的—NH2取代度如圖2(c)所示,根據(jù)實驗結果可以發(fā)現(xiàn),CS-C的—NH2取代度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,其峰值出現(xiàn)在CS與7-甲酯酰氯香豆素質量比在1∶3處。這可能是因為CS與7-甲酯酰氯香豆素的反應是一個可逆反應,當CS的用量一定時,7-甲酯酰氯香豆素的含量達到一定值繼續(xù)增加時,不僅反應不向正方向進行,提高CS的—NH2取代度,而且使已經(jīng)接枝的產(chǎn)物發(fā)生水解,使—NH2取代度下降。此外,由圖亦可得出CS被成功修飾[10],且在殼聚糖與7-甲酯酰氯香豆素質量比為1∶3時的改性效果最好;與Panda等[11]得到的改性產(chǎn)物的氨基取代度隨著天然殼聚糖分子質量的增加而降低,水溶性也隨著天然殼聚糖分子質量的增加而降低的結果一致。

2.3 CS-C的性能分析

2.3.1熱穩(wěn)定性能 CS及CS-C在N2氣氛中的質量損失如圖3(a)所示。從圖3(a) 可以看到,CS及CS-C的熱解過程可分成2個階段,分別對應50～100和250～350 ℃ 這兩個溫度區(qū)間,第一個熱解階段主要是殼聚糖分子中的結合水蒸發(fā),第二個熱解階段主要是CS骨架的分解[12]。從第二個熱解階段可以發(fā)現(xiàn),純殼聚糖的分解溫度最高,結合之前的XRD圖譜,分析發(fā)現(xiàn)這是因為CS具有較高的結晶度,隨著CS質量占比的減少,CS-C結晶度呈現(xiàn)先下降而后增加的趨勢,因而CS-C熱分解溫度也呈現(xiàn)先下降而后增加的趨勢。其中CS-C-3的結晶度最低,因而其熱穩(wěn)定性也最低。CS-C的DTG曲線及熱重數(shù)據(jù)分別見圖3(b)和表1。從DTG曲線可以發(fā)現(xiàn),第二階段質量損失明顯增加,觀察到不同比例的改性產(chǎn)物與CS具有類似的曲線變化趨勢。但是所有的改性產(chǎn)物都具有比CS較低的分解溫度(最大失重速率對應的溫度),這可能是由于用7-甲酯酰氯香豆素修飾后結晶度降低所致。同時,隨著7-甲酯酰氯香豆素質量占比的增加,CS-C從開始降解的溫度到最高降解速率對應的溫度期間所耗費的時間減小,表明由于7-甲酯酰氯香豆素的引入,降低了CS分子內強的氫鍵作用力,導致其熱穩(wěn)定性減弱。

表1 CS以及CS-C的熱失重數(shù)據(jù)1)Table 1 Thermal weight loss data for CS and CS-C

a.TG;b.DTG圖3 樣品的TG和DTG曲線Fig.3 TG and DTG curves of the samples

2.3.2溶解性能 CS大分子內存在較強的氫鍵作用力,使得其分子不溶于中性水及有機溶劑;與 7-甲酯酰氯香豆素進行酰胺化反應后,CS分子C2位—NH2逐漸被香豆素分子替代,分子間與分子內的氫鍵作用逐漸減弱,使得改性殼聚糖分子在水中的溶解度增加。在室溫下測試了CS和CS-C在常用有機溶劑中的溶解性,發(fā)現(xiàn)CS和CS-C不能溶于甲苯、氯仿、乙醇、二甲基甲酰胺,也不能溶于質量分數(shù)1%NaOH溶液。但其在體積分數(shù)1%乙酸溶液中表現(xiàn)出良好的溶解性,這可能與其分子鏈上—NH2質子化形成—NH3+的離子間互斥有關。CS與CS-C在等比例水與二甲基亞砜(DMSO)混合溶液中的溶解情況見圖4,對比圖中的a和d可以發(fā)現(xiàn):a瓶容器底部可看到明顯的沉淀,說明CS在水與DMSO混合溶液中溶解程度較低,而d瓶中溶液較為澄清且容器底部沒有沉淀,說明CS-C-3在水與DMSO混合溶液中很好的溶解,這可能是由于CS結晶度降低以及CS的—NH2取代度增大所致。

a.CS;b.CS-C-1;c.CS-C-2;d.CS-C-3;e.CS-C-4;f.CS-C-5圖4 樣品的溶解性能Fig.4 Dissolution properties of samples

CS與7-甲酯酰氯香豆素質量比為1∶1、 1∶2、 1∶3、 1∶4和1∶5制備的CS-C的溶解度分別為10.4%、 35.1%、 79.7%、 31.8%和9.5%。結合圖4,由樣品溶解度的數(shù)據(jù)可知,CS不溶于混合溶液,但其衍生物CS-C是部分溶解于H2O與DMSO混合溶劑的,其溶解能力與—NH2取代程度直接相關,隨著DS的增加,CS-C的溶解度從10.4%增加到79.7%,再下降到9.5%,證明了有機溶劑能夠溶解CS-C且質量比為1∶3時溶解性能最好。

2.3.3抑菌性能 CS和CS-C-3對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力見圖5。由圖可知,CS-C-3的試管中的懸浮液均呈現(xiàn)較為澄清的狀態(tài),而同濃度的CS試管中的懸浮液卻比較渾濁,表明CS-C-3的抗菌活性優(yōu)于CS,且CS-C-3對于大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為0.5和1 g/L。這是因為水溶性殼聚糖的分子具有質子化銨,與細胞膜作用可以吸附和聚沉細胞,同時可以穿過破損的細胞壁進入細胞內部擾亂細胞的正常代謝從而使抑菌效果增強[13]。殼聚糖的氨基與細菌膜表面的脂蛋白結合,導致膜蛋白變性失活,進一步影響了膜對營養(yǎng)物質的運輸,細菌膜表面含有豐富的磷壁酸,當殼聚糖與細菌膜結合后,可能會導致細菌膜結構松散,甚至破裂,以此達到抑菌的目的。CS-C-3具有良好的水溶性,能使其分子上的氨基在中性水中更好地電離,進而與細菌細胞膜上更多的負電荷相互作用[14],加快細胞內蛋白酶及其他成分泄露,從而表現(xiàn)出更強的抑菌性。

a.CS,E.coli; b.CS-C-3,E.coli; c.CS,S.aureus; d.CS-C-3,S.aureus1.0.25 g/L; 2.0.5 g/L; 3.1 g/L; 4.2 g/L; 5.4 g/L圖5 樣品的抑菌效果 圖6 樣品的殺菌效果Fig.5 Bacteriostatic effect of the samples Fig.6 Sterilization effect of samples

CS和CS-C-3對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌能力見圖6。

由圖6(a)和(b)可知,含有質量濃度4 g/L CS-C的培養(yǎng)基表面透明,其培養(yǎng)基中幾乎沒有細菌生長,而同質量濃度的CS培養(yǎng)基表面不清晰,其培養(yǎng)基中有明顯的菌落生長現(xiàn)象,表明了CS-C對大腸桿菌的殺菌活性優(yōu)于CS;同樣,在圖6(c)和(d)中可以發(fā)現(xiàn),隨著CS以及CS-C的濃度提高,培養(yǎng)基表面的透明性逐漸提升,只有含有質量濃度2和4 g/L的CS-C的培養(yǎng)基表面透明,表明此質量濃度對金黃葡萄球菌具有較強的抑菌性。以上研究表明,CS-C-3對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)分別為4和2 g/L。這是因為CS-C-3結構中的分子間和分子內的氫鍵被破壞,降低了其結晶度,提高了CS-C的溶解性,進而增強其抗菌性,同時也說明了在CS中引入?；梢愿纳破淇咕阅堋?/p>

3 結 論

3.1以殼聚糖(CS)、 7-羥基香豆素為主要原料,以草酰氯為橋梁,通過?；男院头蔷圊０坊磻苽涑鲈谥行詶l件下具有良好溶解性能7-羥基香豆素酰化改性殼聚糖(CS-C)。FT-IR表征表明7-羥基香豆素成功接枝到殼聚糖分子上。

3.2CS-C的XRD、Ds、熱穩(wěn)定性能和溶解性能分析表明:CS中引入7-甲酯酰氯香豆素后其結晶結構被破壞,熱穩(wěn)定性能下降,溶解性能增強,且當CS與7-甲酯酰氯香豆素的質量比為1∶3時CS-C-3的Ds達到峰值,此時CS-C的溶解性能也最好,溶解度可達79.7%;最小抑菌實驗結果表明:CS-C的抑菌性比CS強,其中CS-C-3對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為0.5和1 g/L;殺菌實驗結果表明:CS-C培養(yǎng)基中菌落存活數(shù)量明顯低于CS培養(yǎng)基中菌落存活數(shù)量,CS-C的殺菌性顯著大于CS,其中CS-C-3對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)分別為4和2 g/L。