劉丹陽, 周 昊, 顏洋洋, 楊瀟然, 商士斌, 王成章

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;林木生物質(zhì)低碳高效利用國家工程研究中心;江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京 210042)

馬藍(lán)(Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.)為爵床科多年生草本植物[1-4],馬藍(lán)葉的主要藥效成分為靛玉紅、靛藍(lán)、吲哚苷等吲哚類生物堿[5-7]。其中吲哚苷(3-羥基吲哚-β-葡糖苷)又叫靛苷[8-9],是靛藍(lán)和靛玉紅的前體物質(zhì)[10],具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎等生物活性;靛玉紅具有抗癌活性,能夠治療慢性粒細(xì)胞性白血病等惡性腫瘤[11];靛藍(lán)既可用于食品、醫(yī)藥和日用化妝品著色又具有抗氧化、抗菌消炎等作用[12]。β-葡萄糖苷酶是催化糖苷鍵水解的酶,參與生物體內(nèi)糖代謝,對維持生物體正常生理功能起著重要作用,也在植物趨毒、防御害蟲以及次級(jí)代謝等方面具有重要的生物學(xué)功能[13-14]。干燥是中藥材生產(chǎn)過程中最普遍且關(guān)鍵的加工環(huán)節(jié),具有殺菌抑菌、改善外觀品質(zhì)、延長儲(chǔ)存期、減少運(yùn)輸質(zhì)量及便于后續(xù)加工等作用[15-16]。目前馬藍(lán)產(chǎn)區(qū)通常采用自然陰干和曬干等傳統(tǒng)方式對馬藍(lán)進(jìn)行干燥處理,但存在規(guī)模小、技術(shù)落后、過程難控、費(fèi)時(shí)耗力等問題。因此,本研究對比陰干、曬干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷凍干燥、熱風(fēng)槍吹干、微波干燥和微波烘干9種干燥方式對馬藍(lán)葉外觀和內(nèi)在品質(zhì)的綜合影響,探究干燥過程中的內(nèi)部生物堿轉(zhuǎn)化機(jī)制,以期為馬藍(lán)葉干燥加工新技術(shù)的引進(jìn)與推廣提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

新鮮馬藍(lán)(Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.)葉,由貴州小生源有限公司提供,含水量75.80%;靛藍(lán)、靛玉紅、吲哚苷、甲醇,均為市售色譜純;對硝基苯酚、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸,均為市售分析純。

CBM-10A VP Plus型高效液相色譜儀,日本島津公司;UV-1800型紫外可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)有限公司;FD-1C-50+真空凍干機(jī),北京博辰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;STXH2000雙檔溫?zé)犸L(fēng)槍,蘇州百得精密制造有限公司。

1.2 新鮮馬藍(lán)葉的干燥處理

稱取100 g新鮮馬藍(lán)葉,采用陰干、曬干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷凍干燥、熱風(fēng)槍吹干、微波干燥和微波烘干等干燥方式進(jìn)行處理,當(dāng)馬藍(lán)葉含水量小于10%時(shí)停止干燥處理,記錄干燥時(shí)間。

陰干:將新鮮馬藍(lán)葉置于陰涼通風(fēng)避光處,厚 1 cm(單層),定期翻動(dòng)至全干,干燥總時(shí)間240 h,葉片含水9.86%。曬干:將新鮮馬藍(lán)葉置于陽光下,厚1 cm擺一層,晚上用自封袋收回密封,防止返潮,定期翻動(dòng)至葉片全干,干燥總時(shí)間70 h,葉片含水9.24%。真空干燥:將新鮮馬藍(lán)葉平攤一層于托盤中,置于50 ℃真空烘箱中烘干,干燥總時(shí)間8 h,葉片含水7.21%。50 ℃烘干:將新鮮馬藍(lán)葉平攤一層于托盤中,置于普通鼓風(fēng)烘箱50 ℃烘干,定期翻面至葉片全干,干燥總時(shí)間5 h,葉片含水6.49%。100 ℃烘干:將新鮮馬藍(lán)葉平攤一層于托盤中,置于普通鼓風(fēng)烘箱50 ℃烘干,定期翻面至葉片全干,干燥總時(shí)間40 min,葉片含水5.62%。冷凍干燥:將新鮮馬藍(lán)葉平攤一層于托盤中,置于真空凍干機(jī)中除水干燥,干燥總時(shí)間30 h,葉片含水9.69%。熱風(fēng)槍吹干:將新鮮馬藍(lán)葉攤開在桌面,用2 000 W熱風(fēng)槍在適當(dāng)距離吹并翻動(dòng)至干燥,干燥總時(shí)間10 min,葉片含水6.87%。微波干燥:將新鮮馬藍(lán)葉平攤一層于托盤中用微波爐短暫加熱后攤涼并反復(fù)至完全干燥,干燥總時(shí)間3 min,葉片含水6.56%。微波烘干:將新鮮馬藍(lán)葉平攤一層于托盤中用微波爐加熱1 min后鼓風(fēng)烘箱50 ℃烘至全干,干燥總時(shí)間4 h,葉片含水6.79%。

1.3 馬藍(lán)葉干燥物的成分測定

1.3.1吲哚苷成分分析

1.3.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取5 mg吲哚苷標(biāo)準(zhǔn)品,加入超純水定容至10 mL,超聲波振蕩溶解30 min,用0.45 μm微孔濾膜過濾后得到濾液,各取4、 8、 12、 16、 20和24 μL注入液相色譜儀中,重復(fù)進(jìn)樣2次,取平均值,并以峰面積(y)和對應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=6×107x+286 635(R2=0.999 6),x在40～240 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.1.2含量測定 采用高效液相色譜儀對干燥后的馬藍(lán)葉中含吲哚苷量進(jìn)行測定。色譜條件:C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm×5 μm),流動(dòng)相為甲醇和水(體積比20∶80),流速 1.0 mL/min,檢測波長230 nm,柱溫20 ℃,進(jìn)樣量 20 μL,測試液質(zhì)量濃度0.5 g/L(溶于超純水)。

1.3.2靛藍(lán)、靛玉紅成分分析

1.3.2.2含量的測定 采用高效液相色譜儀對干燥后的馬藍(lán)葉中靛藍(lán)、靛玉紅含量進(jìn)行測定。色譜條件:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);流動(dòng)相為甲醇和水(體積比30∶70),流速1.0 mL/min,檢測波長289 nm,柱溫20 ℃,進(jìn)樣量20 μL,測試液質(zhì)量濃度0.5 g/L(溶于N,N-二甲基甲酰胺)。

1.4 β-葡萄糖苷酶酶活的測定

1.4.1對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以1 mol/L碳酸鈉溶液作為溶劑,配成質(zhì)量濃度分別為1.73、 3.46、 4.33、 5.12、 6.93、 10.39 mg/L的對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。以1 mol/L碳酸鈉溶液為空白,以對硝基苯酚質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),最大吸收峰402 nm處的吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:A=0.018 7X+0.005 8(R2=0.999 9)。

1.4.2β-葡萄糖苷酶酶活的測定 稱取2.5 g剪碎的經(jīng)干燥處理后的馬藍(lán)葉,加入適量預(yù)冷的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(由0.2 mol/L磷酸氫二鈉和0.1 mol/L檸檬酸復(fù)配而成,pH值6.0),冰浴上充分研磨成勻漿。將勻漿移入離心管中,4 ℃、 15 000 r/min離心10 min。將上清液移入容量瓶中,用緩沖液(pH值為6.0)定容至25 mL,得粗酶提取液,4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

在試管中加入0.6 mL pH值為6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,0.2 mL對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG,25 mmol/L)和0.2 mL粗酶提取液,將試管置于55 ℃恒溫水浴中45 min,反應(yīng)結(jié)束后,向反應(yīng)體系中加入2.5 mL 1 mol/L碳酸鈉溶液終止反應(yīng),稀釋數(shù)倍后用紫外可見分光光度計(jì)在波長402 nm處測定酶液的吸光度值。β-葡萄糖苷酶活力國際單位定義:pNPG為底物,在一定的分析條件下,每分鐘釋放出1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量定義為 1 個(gè)國際單位 U。樣品中的酶活(E,U/g)根據(jù)下式計(jì)算[14]。

E=(Y×V2×V×N)/(K×V1×m×t)

式中:Y—酶促反應(yīng)的吸光度;V—酶液的提取體積, mL;V1—反應(yīng)體系中酶液體積, mL;V2—總反應(yīng)液體積,mL;K—對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;m—試樣質(zhì)量,g;t—反應(yīng)時(shí)間,min;N—稀釋倍數(shù),倍。

2 結(jié)果與討論

2.1 干燥方式對馬藍(lán)葉性狀的影響

新鮮馬藍(lán)葉是綠色,但當(dāng)葉片破損后會(huì)變成藍(lán)色。這是因?yàn)轳R藍(lán)葉中不存在靛藍(lán)[15],但存在由靛藍(lán)的前體吲哚酚和葡萄糖結(jié)合而成的吲哚苷,當(dāng)葉片破損,吲哚苷會(huì)被葉綠體中β-葡萄糖苷酶水解生成3-羥基吲哚,而3-羥基吲哚化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定,遇氧迅速反應(yīng),除自發(fā)氧化生成吲哚醌或靛紅外,還會(huì)進(jìn)一步氧化雙聚生成靛藍(lán)、靛玉紅等物質(zhì)(圖1)。

圖1 馬藍(lán)葉中生物堿轉(zhuǎn)化過程[17]Fig.1 Alkaloid transformation process in B. cusia[17]

9種干燥方式處理后的馬藍(lán)葉見圖2。由圖可見,馬藍(lán)葉性狀存在明顯差異,相同點(diǎn)在于葉片萎縮、質(zhì)地干脆,不同點(diǎn)在于真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷凍干燥4種處理方法得到的干葉明顯變黑、嚴(yán)重卷曲,而熱風(fēng)槍吹干、微波干燥和微波烘干3種方式處理的干葉仍保留綠色舒展?fàn)顟B(tài),但熱風(fēng)槍干燥過程可能由于過熱使葉片局部變黑,陰干葉和曬干葉為黃綠色輕微卷曲狀態(tài)。

2.2 干燥方式對馬藍(lán)葉藥效成分的影響

不同干燥方式對馬藍(lán)葉中主要藥效成分吲哚苷、靛藍(lán)和靛玉紅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響見表1。由表可知,微波干燥和熱風(fēng)槍吹干所得干葉的吲哚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(均大于8%),這是因?yàn)槲⒉ê蜔犸L(fēng)槍處理時(shí)瞬間溫度可達(dá)100 ℃以上,甚至200 ℃,高溫處理使β-葡萄糖苷酶幾乎完全失活,故葉子中吲哚苷得到保存。先微波加熱1 min再50 ℃烘干的馬藍(lán)葉中含吲哚苷量為微波干燥葉中的50%左右,說明經(jīng)過微波處理1 min后葉子中部分吲哚酶活性保存,使葉子中吲哚苷在50 ℃烘干4 h過程中繼續(xù)酶解;其他干燥方式的吲哚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不大于0.3%。因此,對比未處理、陰干、曬干、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、真空干燥、冷凍干燥等方式,微波處理可以短時(shí)高效地制得富含吲哚苷的干燥馬藍(lán)葉,使葉中吲哚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至少25倍以上。

表1 干燥方式對馬藍(lán)葉中藥用成分及酶活的影響Table 1 The effect of drying methods on the medicinal components and enzyme activities of B.cusia leaves

50 ℃烘干、 100 ℃烘干處理的葉子中靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,在0.68%～0.81%之間,葉片顏色最黑(圖2);陰干、真空干燥和冷凍干燥3種處理的葉子中靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近,在0.28%～0.34%之間;熱風(fēng)槍和微波處理的葉子中的β-葡萄糖苷酶失活,吲哚苷沒有轉(zhuǎn)化為靛藍(lán)或靛玉紅,故靛藍(lán)、靛玉紅含量最低,可以忽略不計(jì);冷凍干燥、 50 ℃烘干和陰干3種處理的葉子中靛玉紅質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,在0.047%～0.075%之間。因此,50 ℃烘干是制備較高靛藍(lán)和靛玉紅含量的干燥方式。

2.3 干燥方式對馬藍(lán)葉中β-葡萄糖苷酶活性的影響

不同干燥方式對馬藍(lán)葉中β-葡萄糖苷酶活性的影響亦見表1。由表可知,冷凍干燥后的馬藍(lán)葉酶活性最高,其次是曬干葉和真空干燥葉,說明低溫干燥法對酶活影響最小;熱風(fēng)槍吹干、微波干燥、微波烘干3種方法處理后的馬藍(lán)葉中酶活性最低,且酶活小于100 ℃烘干處理的馬藍(lán)干葉,這是因?yàn)樯鲜?種干燥方法瞬間溫度可大于100 ℃。以上結(jié)果表明不同干燥處理方式影響馬藍(lán)葉中β-葡萄糖苷酶活性。陰干、曬干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷凍干燥過程中均發(fā)生了由β-葡萄糖苷酶催化的降解反應(yīng),干燥過程中葉子逐漸失水變形,導(dǎo)致細(xì)胞破碎,吲哚苷和酶接觸發(fā)生酶促降解反應(yīng),吲哚苷含量降低,生成靛藍(lán)或靛玉紅。且由于β-葡萄糖苷酶最適溫度在40～50 ℃[14],因此,50 ℃烘干制備馬藍(lán)干葉可得到高含量的靛藍(lán)和靛玉紅。

3 結(jié) 論

以馬藍(lán)干葉性狀、藥效成分(吲哚苷、靛藍(lán)和靛玉紅)和β-葡萄糖苷酶活性為指標(biāo),考察陰干、曬干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷凍干燥、熱風(fēng)槍吹干、微波干燥和微波烘干9種干燥方式對馬藍(lán)葉的外觀和內(nèi)在品質(zhì)的影響。研究結(jié)果表明:在50 ℃烘干過程,馬藍(lán)葉片過度卷曲且變黑,葉中β-葡萄糖苷酶可以保持較高活性,吲哚苷降解生成較高含量的靛藍(lán)和靛玉紅;微波干燥可對葉片進(jìn)行均勻地傳遞熱量,確保馬藍(lán)葉快速升溫、均勻失水干燥,有效避免局部溫度過高的現(xiàn)象,使β-葡萄糖苷酶高溫失活,阻止了干燥過程中酶促反應(yīng)的發(fā)生,減少中間產(chǎn)物生成,可以快速制備得到富含吲哚苷(8.84%)的綠色馬藍(lán)葉片。