宗帥州，辛麗娜，白佳琪，韓劍眾，曲道峰

（浙江工商大學(xué) 杭州 310018）

中國(guó)是禽肉消費(fèi)大國(guó)，自2017 年以來，中國(guó)的肉雞出欄量已超過每年100 億只雞[1]。在雞養(yǎng)殖過程中，大腸桿菌被認(rèn)為是主要病原體[2]。致病性大腸桿菌往往會(huì)引起重大傳染病，其癥狀多為呼吸道感染、卵黃囊感染、腸炎、敗血癥、漿膜炎和輸卵管炎等[3]。此外，大腸桿菌還能與其它病原體共同作用于宿主，造成混合感染，其高發(fā)病率與高死亡率，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。目前來看，抗生素仍是治療大腸桿菌感染的主要手段，然而，在雞養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中大量使用治療性抗生素與抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑已經(jīng)引發(fā)嚴(yán)重的動(dòng)物源和食源性細(xì)菌耐藥性問題[5]。據(jù)高玉斌等[6]的報(bào)告，2017年于國(guó)內(nèi)7 個(gè)代表性地區(qū)（山西、山東、西藏、云南、新疆、江蘇、吉林）養(yǎng)殖場(chǎng)中分離到130 株雞源大腸桿菌，對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、氟苯尼考的耐藥率分別為91.54%，90.77%，78.13%，79.83%，81.25%。據(jù)唐標(biāo)等[7]的報(bào)道，2019 年于湖南省部分雞養(yǎng)殖場(chǎng)中分離到的146 株大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、氟苯尼考的耐藥率分別為87.7%，85.0%，78.1%，75.3%，67.1%。從以上數(shù)據(jù)來看，國(guó)內(nèi)雞源大腸桿菌耐藥率處于較高的水平，耐藥情況非常嚴(yán)重，而養(yǎng)殖環(huán)境中的耐藥菌不僅提高畜禽細(xì)菌病治療難度，也可以通過污染水源、土壤傳播給人，還可以通過禽類產(chǎn)品加工鏈進(jìn)行更廣泛的傳播[8]。我國(guó)雖然已經(jīng)開展動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性檢測(cè)，但是僅在省級(jí)層面對(duì)個(gè)別養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行樣品采集，對(duì)于市級(jí)層面的耐藥菌研究仍存在很大空缺[9]。

本研究對(duì)浙江省湖州、嘉興、紹興市共12 家肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行糞便與環(huán)境樣品的采集，通過16S rRNA 測(cè)序進(jìn)行菌株鑒定，對(duì)分離得到的大腸桿菌進(jìn)行耐藥表型與基因型檢測(cè)，共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析整合子與耐藥基因的相關(guān)性，揭示耐藥基因的傳播特點(diǎn)，為雞源耐藥菌的監(jiān)測(cè)提供依據(jù)，為當(dāng)?shù)乇ＷC食品安全提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021 年5 月分別從浙江省3 市共12 家養(yǎng)殖場(chǎng)（每市各4 家養(yǎng)殖場(chǎng)）中，各采集糞便樣品20份、土壤樣品20 份，污水樣品20 份，共720 份樣品置于無菌樣品袋與采樣管中。樣品采集后均立刻置于低溫（2～8 ℃）樣品箱中，待采樣結(jié)束后運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大腸桿菌分離。

1.2 主要試劑

Mueller-Hinton肉湯、腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水（BPW）、細(xì)菌瓊脂粉，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)BD 公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、16S rRNA 通用引物與50X TAE 緩沖液，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；2X Taq PCR Master Mix、10 mg/mL 溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、DL2000 DNA Marker，購(gòu)自BBI 生命科學(xué)有限公司。

1.3 菌株初篩與鑒定

將采集到的樣品接種至BPW 中，37 ℃條件下增菌12 h 后，使用接種環(huán)取菌液在麥康凱瓊脂培養(yǎng)上進(jìn)行劃線分離，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h，挑取可疑菌落（鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色），在BHI 瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化，再次于37 ℃培養(yǎng)18～24 h 后進(jìn)行PCR 鑒定。

本研究采用16S rRNA 測(cè)序技術(shù)對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行鑒定。按細(xì)菌基因組DNA 快速抽屜試劑盒的要求提取經(jīng)分離純化后的大腸桿菌疑似菌株。上下游引物采用16S 通用引物27F（YMAGAGTTTGATYMTGGCTCAG）和 1492R（TACCTTGTTACGACTT），將配置好的PCR 體系（2X Taq PCR Master Mix 25 μL、ddH2O 19 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、模板DNA 5 μL）使用渦旋振蕩儀上振蕩混勻后低速離心。PCR 擴(kuò)增條件為96 ℃預(yù)變5 min，以95 ℃變性30 s、50 ℃退火90 s、72 ℃延伸60 s 進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)后，最后72 ℃再延伸5 min，PCR 程序結(jié)束后于4 ℃保存。取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電壓為120 V，電泳時(shí)長(zhǎng)30 min。經(jīng)蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)下觀察瓊脂糖凝膠是否在1 500 bp 處有對(duì)應(yīng)條帶，將擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物送至上海生工股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)blast 比對(duì)鑒定菌株。

1.4 藥敏試驗(yàn)

本次試驗(yàn)分離得到的大腸桿菌耐藥譜根據(jù)紙片擴(kuò)散法（Kindy-Bauer）進(jìn)行測(cè)定，選擇8 大類20種抗生素，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定和質(zhì)量控制。

1.5 耐藥基因及整合子的PCR 鑒定

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道過的引物序列，對(duì)常見的9 大類抗生素耐藥基因進(jìn)行PCR 鑒定，配置耐藥基因擴(kuò)增體系，擴(kuò)增條件為：95 ℃下預(yù)變性5 min，95 ℃下變性30 s，對(duì)應(yīng)引物的退火溫度40 s，72 ℃延伸40 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸5 min。

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道過的整合酶基因引物，對(duì)已被報(bào)道過的3 類整合子進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)整合酶陽性菌株進(jìn)行整合子內(nèi)部基因盒擴(kuò)增與分析。按各自PCR 擴(kuò)增條件擴(kuò)增后，對(duì)成功擴(kuò)增出條帶的整合子基因盒擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工股份有限公司進(jìn)行一代測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)blast[10]比對(duì)后進(jìn)行下一步分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 16.0[11]對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過Origin 8.0 可視化。耐藥基因與可移動(dòng)元件的相關(guān)性通過R 軟件包“vegan”與“psych”進(jìn)行計(jì)算，并適應(yīng)Gephi[12]實(shí)現(xiàn)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖的可視化。

2 研究結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

3 市采集的720 份樣品經(jīng)涂板培養(yǎng)與16S rRNA 鑒定后，共分離得到234 株大腸桿菌，分離率為32.5%。按地區(qū)來看，3 市大腸桿菌分離率均在30%以上，分離率從高到低依次為嘉興（34.6%，72/240）、紹 興（32.1%，83/240）、湖 州（30.8%，77/240）。按樣本類型來看，3 市養(yǎng)殖場(chǎng)分離出的大腸桿菌主要來源于糞便，分離率均高于其它樣本類型，而3 市糞便樣本中分離率最高來自嘉興，高達(dá)58.8%。其次，3 地土壤樣本的分離率均高于污水，土壤分離率最高的樣本來自紹興，為28，8%。對(duì)污水樣本而言，分離率最高的為嘉興21.3%。

2.2 分離株大腸桿菌的耐藥表型

根據(jù)CLSI-2020[13]和EUCAST-2020[5]制定的關(guān)于紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)的R/I/S 判定折點(diǎn)，對(duì)分離株大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。由圖1可知，3 市分離的大腸桿菌對(duì)8 大類，20 種抗生素呈現(xiàn)出不同的耐藥表型。其中耐藥率最高的為四環(huán)素，均在90%以上，嘉興市分離株耐藥率最高，高達(dá)95.31%，其次分別為紹興市分離株的94.28%、湖州市分離株的91.26%。其次，3 市的分離株也對(duì)甲氧芐氨嘧啶、磺胺異噁唑呈現(xiàn)出高度耐藥，耐藥率均在80%以上。嘉興市分離株對(duì)這兩種抗生素耐藥程度比其他兩市更嚴(yán)重，對(duì)甲氧芐氨嘧啶的耐藥率為92.1%，高于湖州的87%和紹興的84.44%，對(duì)磺胺異噁唑的的耐藥率為95.43%，高于紹興的92.34%和湖州的89%。除了上述的3 種抗生素外，頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢西丁、亞安培南、美羅培南、氨曲南、阿米卡星、鏈霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、磷霉素、阿奇霉素、米諾環(huán)素這14 種抗生素的耐藥率均為嘉興市分離株高于其他兩市分離株，嘉興市肉雞源大腸桿菌耐藥程度更高。碳青霉烯類抗生素作為肉雞養(yǎng)殖中禁用的抗生素，3 市分離株對(duì)亞胺培南的耐藥率均高于10%，需要引起重視，而美羅培南的耐藥程度較輕，湖州市分離株耐藥率為4.76%，紹興市分離株耐藥率為8.61%，但嘉興市分離株耐藥率高達(dá)17.63%。

圖1 三市大腸桿菌分離株對(duì)20 種抗生素的耐藥率Fig.1 Antibiotic resistance rate of Escherichia coli to 20 antibiotics in 3 cities

表1 大腸桿菌的分離率Table 1 Isolation rate of Escherichia coli

2.3 大腸桿菌的耐藥基因型鑒定

本研究分離得到的234 株大腸桿菌中耐藥基因的檢出率概況如表2 所示。β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM有著非常高的檢出率，達(dá)到76.9%，其次分別為blaCTX-M與blaSHV，檢出率為26.06%與23.93%，而這3 種耐藥基因均可編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）。介導(dǎo)碳青霉烯類耐藥的blaNDM的檢出率較低，僅為0.85%，其編碼B 類碳青霉烯酶。而編碼A 類與D 類碳青霉烯酶的基因blaKPC與blaOXA均為檢出。氨基糖苷類耐藥基因中，aadA1 的檢出率最高，為88.89%，其次為aphA6、aacC、aac（6'）-Ib-cr，耐藥率分別為21.79%，19.23%和11.53%。喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrD、qnrS 的檢出率為34.19%，21.36%，16.67%以及36.75%?；前奉惸退幓驒z出率較高的為sul1與sul2，分別為81.20%與23.08%，其余4 類均在10%以下，未檢出sul3。酰胺醇類耐藥基因floR、cmlA 的檢出率為49.15%與18.38%，未檢出cfr。而磷霉素耐藥基因檢出率整體較低，fosA 與fosB的耐藥率分別為20.51%與11.97%。大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因中檢出率最高的為mph（A）70.99%，其次為mph（E）的37.18%，ermA 最低，為8.12%。四環(huán)素類耐藥基因中，檢出率最高為tet（A），高達(dá)84.1%。tet（B）與tet（C）的檢出率相對(duì)較低，為29.49%與16.67%。

2.4 大腸桿菌分離株耐藥基因檢出率地域性差異

進(jìn)一步分析8 大類抗生素耐藥基因檢出率的地域性差異，由圖2 可知，四環(huán)素耐藥基因tet（A）、氨基糖苷類耐藥基因aadA1、磺胺類耐藥基因sul1 在3 市均有較高的檢出率，且3 市之間檢出率相差不大，而ermA 在3 市分離株中檢出率均低于20%，blaNDM、folp3 的檢出率低于10%，處于較低的水平。在檢出的29 種耐藥基因中，嘉興市分離的大腸桿菌有18 種耐藥基因的檢出率高于其他兩市，分別為tet（B）、mph（E）、mph（A）、qnrA、qnrD、qnrS、ac（6'）-Ib-cr、aacC、aadA1、blaCTX-M、blaSHV、blaNDM、folp1、folp3、dfrA27、floR、cmlA、catA1、fosA、fosB，其中blaNDM僅在嘉興市分離株中被檢出。而四環(huán)素耐藥基因tet（A）、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermA、喹諾酮類耐藥基因qnrB、氨基糖苷類耐藥基因aphA6、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、磺胺類耐藥基因sul1、folp2 的檢出率均為湖州市最高。紹興市分離株的tet（C）、sul2 檢出率高于其他兩市。根據(jù)耐藥基因的檢出率分布來看，耐藥基因在嘉興市流行率更高，嘉興市的耐藥情況相比于其他兩市更嚴(yán)重。

圖2 3 市大腸桿菌分離株耐藥基因檢出率Fig.2 Detection rate of antibiotic resistance genes of Escherichia coli in 3 cities

2.5 3 市整合子地域性分布差異

對(duì)3 市分離到的大腸桿菌進(jìn)行整合酶基因PCR 鑒定，Ⅰ型整合酶基因intI1 陽性大腸桿菌共80 株，Ⅱ型整合酶基因intI2 共15 株，未檢出intI3，且未在同一株菌中同時(shí)檢出intI1 與intI2。如圖3 所示，intI1 在湖州、嘉興、紹興市的檢出率分別 為28.38%（n=21）、40.96%（n=34）、32.47%（n=25），而intI2 的檢出率較低，在湖州、嘉興、紹興的檢出率為6.76%（n=5）、3.61%（n=3）、9.09%（n=7）。對(duì)檢出整合酶的大腸桿菌進(jìn)行進(jìn)一步分析，對(duì)整合子內(nèi)部可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。通過測(cè)序鑒定，在29 株intI1 陽性大腸桿菌中共檢出3 種不同類型的基因盒序列（dfrA17 -aadA5 -sul1 -tetR、aadA1 -aadA22 -aadA23、aadB-aadA1-cmlA6），在4 株intI2 陽性大腸桿菌中檢出1 種基因盒序列（dfrA1-sat2-aadA1）。其中的Ⅰ型整合子包含兩種甲氧芐啶耐藥基因dfrA17、dfrA1，一種卡那霉素耐藥基因aadB，4 種鏈霉素耐藥基因aadA1、aadA22、aadA23、aadA5，以及一種氯霉素耐藥基因cmlA6。而Ⅱ型整合子基因盒序列為一個(gè)甲氧芐啶耐藥基因dfrA1，一個(gè)鏈絲霉素耐藥基因sat2 和一個(gè)鏈霉素耐藥基因aadA1。

圖3 3 市大腸桿菌分離株整合酶基因檢出率Fig.3 Detection rate of integrase genes of Escherichia coli in 3 cities

2.6 嘉興市耐藥基因與可移動(dòng)元件的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

經(jīng)耐藥表型的鑒定分析，對(duì)所檢測(cè)的20 種抗生素中，嘉興市大腸桿菌分離株對(duì)其中17 種的耐藥率高于其他兩市。而耐藥基因型的鑒定分析表明，在所檢測(cè)的29 種耐藥基因中，嘉興市大腸桿菌分離株共有18 種耐藥基因的檢出率高于其他兩市，且嘉興市分離株中Ⅰ型整合酶的檢出率也高于其他兩市。說明在嘉興市中耐藥基因分布廣泛，且隨移動(dòng)元件進(jìn)一步傳播的風(fēng)險(xiǎn)更大，為此，我們對(duì)嘉興市分離株中整合酶、耐藥基因、整合子中插入序列進(jìn)行共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)可移動(dòng)元件或耐藥基因，兩點(diǎn)之間的連接線代表其在同一株菌中共現(xiàn)，連接線越粗表明共現(xiàn)的頻率越高。結(jié)果如圖4，其中8 個(gè)耐藥基因tet（A）、sul1、sul2、floR、aadA1、tet（B）、tet（C）以及blaTEM處于共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的中心，這些耐藥基因與其余耐藥基因或可移動(dòng)元件的相關(guān)性更強(qiáng)，是耐藥性傳播過程中其主要作用的幾種耐藥基因，需要進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。qnrA-mph（A）、fosA-sul1、fosA-blaTEM，sul2-aadA1，這4 組耐藥基因之間共現(xiàn)頻率較高，它們分別介導(dǎo)喹諾酮與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，磷霉素與磺胺類、磷霉素與β-內(nèi)酰胺類、磺胺類與氨基糖苷類耐藥，表明在嘉興市分離株中這幾種耐藥表型很可能同時(shí)出現(xiàn)。而Ⅰ型整合酶與sul1、blaTEM、tet（C）、sul2、tet（B）、floR 存在共現(xiàn)關(guān)系，說明這幾類耐藥基因隨Ⅰ型整合子傳播的風(fēng)險(xiǎn)較大。

3 討論

多年來，抗生素作為促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病的藥物被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[14]，然而，抗生素的不合理使用對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌造成了長(zhǎng)期的選擇性壓力[15]，導(dǎo)致了動(dòng)物源性耐藥菌大量出現(xiàn)，并可借助質(zhì)粒、整合子等可移動(dòng)元件跨種屬傳播耐藥基因[16]，而耐藥菌又可通過動(dòng)物性食品生產(chǎn)鏈傳播給相關(guān)工作人員或通過食品商品傳播給消費(fèi)者，嚴(yán)重影響食品衛(wèi)生與安全[17]。大腸桿菌是廣泛存在于人體腸道與畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中的一種條件致病菌，同時(shí)也是極為重要的耐藥基因“儲(chǔ)存庫(kù)”[18]。本研究在浙江省湖州、嘉興、紹興三市共分離得到234 株大腸桿菌對(duì)磺胺類、四環(huán)素有較高的耐藥率，其他研究中江蘇省雞源大腸桿菌對(duì)復(fù)方新諾明與四環(huán)素的耐藥率為75%與85%，山東省雞源大腸桿菌對(duì)這兩類抗生素的耐藥率為93.33%與100%，說明復(fù)方新諾明與四環(huán)素的耐藥率在多個(gè)地區(qū)均處于較高水平，這可能與這兩種藥物在養(yǎng)殖過程中大量使用有關(guān)。在3市中，嘉興市分離株對(duì)美羅培南的耐藥率最高，為17.63%，而其他研究中湖南省養(yǎng)殖場(chǎng)分離的大腸桿菌對(duì)美羅培南的耐藥率為0%[19]，在新疆分離的雞源大腸桿菌對(duì)美羅培楠的耐藥率為85.71%[20]，這表明美羅培南的耐藥率在各地差異較大，這可能與養(yǎng)殖過程中的用藥量差異有關(guān)。本研究中3市大腸桿菌分離株對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率均在20%以上，且嘉興市最高，超過了40%，而其他研究中從某養(yǎng)殖場(chǎng)分離的大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類抗生素的耐藥率均在40%以上[21]，從江蘇泰州地區(qū)分離的大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為51.9%[22]，從腹瀉豬源分離的大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類抗生素的耐藥率達(dá)到了60%[23]，表明全國(guó)范圍內(nèi)不同地區(qū)間大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類抗生素存在不同程度的耐藥性，而我國(guó)于2016 年禁用了4 種喹諾酮類藥物在養(yǎng)殖業(yè)中使用，說明氟喹諾酮類抗生素耐藥基因已廣泛傳播。

本研究中四環(huán)素類耐藥基因tet（A）與磺胺類耐藥基因sul1 的總體檢出率較高，tet（B）在嘉興市檢出率較高，而sul2 在紹興市檢出率較高，與表型結(jié)果相一致，嘉興市大腸桿菌分離株中的耐藥基因與可移動(dòng)元件的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析表明，四環(huán)素耐藥基因與磺胺類耐藥基因是嘉興市肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)中非常重要的耐藥基因，處于共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的中心，能與其它多種耐藥基因發(fā)生共傳遞。其它研究中，在貴州地區(qū)分離的豬源大腸桿菌中tet（A）的檢出率為92.6%，tet（B）為41.5%[24]；在河南地區(qū)分離的豬源大腸桿菌tet（A）的檢出率為87.1%，tet（B）為0%[25]；而在唐山及秦皇島地區(qū)分離的雞源大腸桿菌tet（A）的檢出率為86.4%，tet（B）為81.8%[26]。tet（A）在全國(guó)畜禽源大腸桿菌的檢出率均處于較高的水平，tet（B）的檢出率則有著明顯的地域性差異，隨著耐藥基因的不斷傳播，tet（B）在各地的檢出率仍有提高的風(fēng)險(xiǎn)。除此之外，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM在湖州市大腸桿菌分離株中的檢出率達(dá)到了91%，嘉興與紹興分離株的耐藥率分別為78%，62%。對(duì)比其它研究中，昆明某養(yǎng)殖場(chǎng)分離的雞源大腸桿菌blaTEM為77%[27]；采集于河南某養(yǎng)殖場(chǎng)中的豬源大腸桿菌blaTEM檢出率為77%[28]；分離自上海地區(qū)的豬源大腸桿菌blaTEM的檢出率為88.5%[29]；分離自山東萊西的雞源大腸桿菌blaTEM的檢出率為72%[30]。blaTEM可介導(dǎo)ESBLs 的產(chǎn)生，且TEM 型酶有115 種，是目前數(shù)量最多的ESBLs[31]，由此對(duì)青霉素類、頭孢菌素及單環(huán)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性[32]，給臨床治療帶來了巨大威脅。而共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析表明，blaTEM與磷霉素耐藥基因fosA有較高的共轉(zhuǎn)移頻率，有研究報(bào)道fosA3 常通過質(zhì)粒與ESBLs 基因共轉(zhuǎn)移，且與IS26 相關(guān)，這與本研究結(jié)果相一致。而磷霉素可用于對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的治療[33]，但隨著這兩種基因的共轉(zhuǎn)移，產(chǎn)ESBLs 大腸桿菌對(duì)磷霉素耐藥率不斷提高，大大削弱了磷霉素對(duì)其的治療效果。

4 結(jié)論

本研究從720 份肉雞源樣品中分離鑒定出234 株大腸桿菌，通過對(duì)表型與基因型的鑒定，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對(duì)養(yǎng)殖過程中常用的四環(huán)素、磺胺類、頭孢類抗生素具有較高的耐藥率，tet（A）、sul1、blaTEM、mph（A）、aadA1 在3 市中均有較高的檢出率。對(duì)整體耐藥情況比較嚴(yán)重的嘉興市分離株大腸桿菌的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析表明，qnrA-mph（A）、fos-A-sul1、fosA-blaTEM，sul2-aadA1 這4 組耐藥基因存在較高的耐藥頻率，需要對(duì)這7 種耐藥基因進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。本研究對(duì)保障動(dòng)物性食品安全，控制耐藥性傳播提供了理論依據(jù)。