黎謝飛，時淄航，曹瑩，吳振，蔡振東，曾小群，涂茂林，潘道東*

（1 寧波大學農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室 浙江寧波315211 2 寧波大學食品與藥學學院 浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室 浙江寧波 315211）

乳酸菌是一類常見的益生菌，也是腸道微生物的重要組成之一[1]，對于維持腸道微生物平衡具有不可或缺的作用。益生菌只有在被消費者攝入并成功在腸道內(nèi)存活和定植后才能發(fā)揮益生作用，而研究發(fā)現(xiàn)，益生菌的活性在食用時至少應達到107CFU/g[2]。益生菌食品從生產(chǎn)到被消費者攝入，所承載的益生菌一直暴露在各種環(huán)境條件下，這些對益生菌的存活和保存來說都是挑戰(zhàn)[3-4]。

在工業(yè)加工和儲存過程中，益生菌對溫度變化的敏感性很容易影響最佳劑量的益生菌的制備，益生菌對高溫的敏感性限制其作為營養(yǎng)品的應用[5]。培養(yǎng)溫度對產(chǎn)品發(fā)酵時代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生也有很大的影響，比如在30 ℃或37 ℃發(fā)酵產(chǎn)物中，乳酸和乙酸的比值為3∶2，而在42 ℃或45 ℃孵育時，乳酸和乙酸的比值低于理論值[6]。因此生產(chǎn)發(fā)酵溫度的選擇和發(fā)酵過程中的溫度控制非常重要。較高的發(fā)酵溫度對發(fā)酵行業(yè)有吸引力，因為這不僅可以提高產(chǎn)品的發(fā)酵速率，還將大大降低高溫消毒后設備的冷卻時間和成本[7]。酸乳工業(yè)生產(chǎn)中，發(fā)酵溫度一般控制在42～45 ℃，這在保證發(fā)酵效果的基礎上大大節(jié)約了生產(chǎn)時間[8]。選擇耐高溫的生產(chǎn)菌株非常重要。江南大學Ge等[7]篩選出一株耐高溫突變株干酪乳桿菌G-03（Lactobacillus casei G-03），其在41 ℃發(fā)酵條件下乳酸濃度和乳酸產(chǎn)量分別比對照組菌株高115.2%和97.8%。

高鹽、高滲透壓環(huán)境是益生菌需要挑戰(zhàn)的環(huán)境，高鹽環(huán)境下生長的益生菌的存活率及細胞結(jié)構(gòu)、性質(zhì)都會受到影響[9]。Piuri等[10]發(fā)現(xiàn)高鹽環(huán)境（1 mol/L NaCl）下干酪乳桿菌ATCC 393（Lactobacillus casei ATCC 393）細胞壁的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)發(fā)生變化，細胞顯著大于對照組，其對誘變劑和細胞壁靶向抗生素的敏感性增加。沒有暴露在滲透壓下進行噴霧干燥的植物乳桿菌LPS 47（Lactobacillus plantarum LPS 47），在存活率、濕度和儲存期間的穩(wěn)定性方面較對照組（0.25～0.75 mol/L NaCl）有明顯的改善[11]。據(jù)報道，高鹽飲食會引起乳酸桿菌減少，從而改變腸道免疫穩(wěn)態(tài)，導致對炎癥侵襲的脆弱性增加[12-13]，山東大學齊魯醫(yī)院Dong等[14]也發(fā)現(xiàn)高鹽飲食組Wistar 大鼠腸道內(nèi)容物中乳酸桿菌的數(shù)量顯著降低，這表明高鹽攝入量與腸道菌群組成的變化有關。德國柏林Max-Delbrück 分子醫(yī)學中心一項發(fā)表在《Nature》上的研究顯示，高鹽攝入會影響小鼠的腸道微生物群，特別是降低鼠乳桿菌的種群數(shù)量；與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，在人類的一項試驗研究中，適度的高鹽挑戰(zhàn)降低了乳酸菌的腸道存活率[15]。

嗜酸乳桿菌是目前我國衛(wèi)健委批準的可用于保健食品的益生菌菌種之一，被廣泛添加到各種益生菌食品中充當益生菌補充劑。研究提高乳酸菌細胞對生產(chǎn)、儲存或消化過程中發(fā)生的環(huán)境脅迫的抵抗力得到研究者的廣泛關注[16]。研究乳酸菌在各種應激條件（高溫、高濃度鹽、膽鹽、過氧化氫或低pH 值）下的生理狀態(tài)和應激反應很有必要。本文采用轉(zhuǎn)錄組學分析方法研究嗜酸乳桿菌CICC 6074（Lactobacillus acidophilus CICC 6074）在高溫和高鹽環(huán)境脅迫過程中乳酸菌對環(huán)境的應激反應，探究耐受過程中微生物細胞內(nèi)可能發(fā)生的生理生化反應，為后續(xù)提升嗜酸乳桿菌的抗鹽、抗高溫性質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與主要試劑

嗜酸乳桿菌CICC 6074 購買自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。乳酸菌培養(yǎng)基MRS肉湯和MRS 瓊脂，中國海博生物技術有限公司?；蚪MDNA 提取試劑盒QIAGEN Genomic-tips，德國Qiagen 公司；1D 文庫構(gòu)建連接試劑盒SQKLSK109，英國Oxford Nanopore Technologie 公司；總RNA 提取使用TRIzol 試劑，美國賽默飛Invitrogen 公司；雙鏈cDNA 合成試劑盒SuperScript double-stranded cDNA synthesis kit，美國賽默飛Invitrogen公司；cDNA 擴增試 劑Phusion DNA polymerase，美國NEB 公司；構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建試劑盒TruSeqTM RNA sample preparation Kit，美國Illumina 公司。

1.2 主要設備與儀器

Centrifuge5804R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；核酸電泳儀PowerPac HC，美國Bio-Rad 公司；恒溫恒濕箱HWS-250B，中國泰斯特公司；Nanodrop ND-2000，美國賽默飛公司；PromethION 測序儀，英國Oxford Nanopore Technology 公司；Illumina HiSeq X Ten 測序儀，美國Illumina 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的培養(yǎng)與菌體的獲取 經(jīng)過兩代活化的嗜酸乳桿菌按體積分數(shù)2%接入新鮮的MRS液體培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)16 h 后4 ℃條件下8 000×g離心5 min 去上清收取菌體，液氮速凍后置于-80℃暫存以備后續(xù)基因組DNA 提取試驗。細菌的高溫和高鹽脅迫方法參照Kilstrup等[17]的方法并略作修改，經(jīng)過兩代活化的嗜酸乳桿菌按體積分數(shù)2%接入新鮮的MRS 液體培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)16 h后分別在43 ℃和0.45 mol/L NaCl 條件下耐受3 h，4 ℃條件下8 000×g 離心5 min 去上清收取菌體，液氮速凍后置于-80 ℃暫存以備后續(xù)總RNA提取試驗。

1.3.2 基因組DNA 與總RNA 的提取 采用QIAGEN Genomic-tips 試劑盒提取菌體基因組DNA，0.75%瓊脂糖電泳檢測樣品是否有降解以及DNA 片段大小，Nanodrop 對DNA 進行定量，高質(zhì)量的DNA 樣品用于后續(xù)的建庫測序；采用TRIzol法提取未脅迫對照組、高溫脅迫組和高鹽脅迫組的菌體總RNA，去除基因組DNA 后，用1%瓊脂糖電泳和Agilent2100 生物分析儀檢測總RNA 的質(zhì)量，使用Nanodrop 進行RNA 定量，高質(zhì)量的RNA 樣品用于后續(xù)的建庫。

1.3.3 建庫、測序和質(zhì)控 全基因組測序使用SQK-LSK109 連接試劑盒構(gòu)建1D 文庫，在PromethION 測序儀上進行測序。RNA 測序使用TruSeqTM RNA sample preparation Kit）進 行RNA 文庫構(gòu)建，在Illumina HiSeq×TenPE150 測序平臺上進行雙端測序。下機后的原始數(shù)據(jù)首先去除接頭序列和5' 端非A、T、G、C 的堿基，然后去掉測序質(zhì)量值小于Q20 的序列，再去除含N 的比例達到10%的序列，最后舍棄去掉接頭序列及質(zhì)量修剪后長度太小的小片段；經(jīng)過質(zhì)控后得到可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量序列。

1.3.4 基因組與轉(zhuǎn)錄組注釋 基因組測序的高質(zhì)量序列經(jīng)Unicycler（linux-64 v0.4.8）軟件組裝拼接后[18]，首先采用BLASTN 進行質(zhì)粒分析，然后分別 用 prodigal（v2.6.3）、tRNAscan -SE -2.0和RNAmmer（v1.2）進行編碼基因、tRNA 基因預測和rRNA 基因預測。采用Interproscan（v5.25-64.0）將預測得到的編碼蛋白分別與COG、KEGG、GO、Refseq、Pfam 和TIGRFAMs 等6 個數(shù)據(jù)庫比對進行功能注釋[19]。Bowtie2（v2.3.5）軟件被用來對RNA測序后得到的高質(zhì)量序列進行注釋[20]，參考基因組序列為完成的嗜酸乳桿菌CICC 6074 基因組序列。

1.3.5 全基因組比對與轉(zhuǎn)錄組基因表達分析采用Geneious Prime 對嗜酸乳桿菌基因組進行基因組分析，Mauve Alignment 程序進行全基因組比對。使用RSEM（v1.3.1）進行轉(zhuǎn)錄本定量，F(xiàn)PKM 和TPM 方法衡量表達水平。轉(zhuǎn)錄本定量后，使用DESeq2（v1.24.0）軟件進行基因表達差異分析[21]。

1.3.6 功能富集分析 使用軟件Goatools（v1.1.6）進行GO 富集分析[22]，KOBAS（v2.0）進 行KEGG Pathway 富集分析[23]，使用Fisher 精確檢驗進行計算。使 用4 種多重檢驗方 法（Bonferroni，Holm，Sidak 和false discovery rate），對P 值進行了校正，以控制計算的假陽性率。通常情況下，當經(jīng)過校正的P≤0.05 時，認為此GO 功能存在顯著富集情況或者此KEGG 通路為在差異表達基因中顯著富集的KEGG 通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組拼接與注釋結(jié)果

隨機取100 000 條質(zhì)控后的序列，利用BLASTN 將其與nt 數(shù)據(jù)進行比對，統(tǒng)計序列在nt庫中的分布情況及比對上的物種分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，99.58%的序列被分配到了嗜酸乳桿菌這個種的分類下面，分配到其它菌種的和分類不清晰的序列數(shù)占0.42%，說明測序結(jié)果無數(shù)據(jù)污染情況。下機原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控和拼接步驟后，得到1 個大小為1 992 024 nt 的重疊群，測序深度為456.16，未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒序列。分析后可知，得到的基因組長1 992 024 bp，是一條雙鏈環(huán)狀DNA 分子，GC 含量為34.71%，結(jié)果與NCBI 上已經(jīng)完成拼接的嗜酸乳桿菌種各株的基因組信息符合。這也說明了此次的測序結(jié)果準確可靠，可用于后續(xù)的分析。根據(jù)核酸序列特征，對基因組上的基因組結(jié)構(gòu)進行預測，總共得到1 864 個完整的CDS，其它基因組結(jié)構(gòu)預測結(jié)果見表1。

表1 嗜酸乳桿菌CICC 6074 基因組結(jié)構(gòu)預測結(jié)果Table 1 Results of genome structure prediction of L.acidophilus CICC 6074

2.2 嗜酸乳桿菌CICC 6074 基因組注釋結(jié)果

將基因組上預測出來的編碼序列與COG、KEGG、GO、Refseq、Pfam 和TIGRFAMs 等數(shù)據(jù) 庫進行比對，詳細結(jié)果見表2。可以看出，單獨注釋到Refseq 數(shù)據(jù)庫的CDS 最多為1 855 條，占總CDS 數(shù)的99.52%，注釋到TIGRFAMs 數(shù)據(jù)庫的CDS 最少為617 條，占總CDS 數(shù)的33.1%，能夠注釋到所有數(shù)據(jù)的CDS 為492 條，經(jīng)過6 個數(shù)據(jù)的注釋，所有的1 864 個CDS 得到了充分注釋。圖1展示了嗜酸乳桿菌CICC 6074 基因組中注釋到COG 數(shù)據(jù)庫的CDS 功能分類統(tǒng)計，可以看出，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)、化合物在生物體內(nèi)的生物合成相關的基因數(shù)量最多為184 條，碳水化合物的轉(zhuǎn)運和代謝相關的基因次之為171 條，而RNA 加工、修飾，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學，細胞核結(jié)構(gòu)相關的基因數(shù)最少為0，功能未知的基因也有67 條。這說明此基因組中蛋白質(zhì)甚至是酶類的翻譯、合成處于一個最重要的地位，能量代謝以及其它如氨基酸、核苷酸、脂類的代謝也相對重要。

圖1 基因組編碼蛋白COG 功能分類統(tǒng)計Fig.1 Functional classification statistics of CDS in COG database

圖2 嗜酸乳桿菌CICC 6074 基因組圈圖Fig.2 Genome circle map of L.acidophilus CICC 6074

表2 基因組編碼蛋白功能注釋統(tǒng)計表Table 2 Statistical table of functional annotation of CDS

2.3 全基因組草圖繪制與比對

將基因組測序深度、GC 分布、GC-skew 以及基因組結(jié)構(gòu)注釋進行整合，使用Circos（v0.69）繪制全基因組圈圖。如圖3 所示，由外到內(nèi)依次為正義鏈編碼基因、負義鏈編碼基因、tRNA 基因（橙色）和rRNA 基因（紫色）、CRISPR 序列（藍色）和基因島序列（綠色）、GC 比、GC-skew 與測序深度。

圖3 嗜酸乳桿菌CICC 6074 與其它株嗜酸乳桿菌全基因比對Fig.3 Whole genome alignment of L.acidophilus CICC 6074 with other strains of L.acidophilus

以“Lactobacillus acidophilus” 為關鍵詞在NCBI 上的Genome 數(shù)據(jù)庫里搜索，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌的基因組信息有61 條，有9 條完成了拼接，其余的為重疊群或者基因組骨架。完成拼接的9 條完整基因組中，長度分布范圍為1.99 Mb 到2.09 Mb，包含的CDS 數(shù)為1 756 個到1 867 個不等（數(shù)據(jù)截至2021 年12 月，NCBI 上Genome 數(shù)據(jù)庫信息，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/prokaryotes/1099/）。可知，嗜酸乳桿菌不同株的基因組間存在一定的差異性。采用Mauve Alignment程序進行全基因組序列比對，結(jié)果如圖3 所示，圖3a、3b、3c 分別為嗜酸乳桿菌CICC 6074 的基因組與嗜酸乳桿菌NCFM（NC_006814）、嗜酸乳桿菌La-14（NC_021181）和嗜酸 乳桿菌 YT1（NZ_CP025200）基因組 比對的 結(jié)果?？?知，NC_006814、NC_021181 與嗜酸 乳桿菌 CICC 6074 基因組的相似度比NZ_CP025200 與嗜酸乳桿菌CICC 6074 基因組的相似度高。經(jīng)分析，刪掉NC_006814 中16SrRNA 基因（163 426～1 632 698）和23S rRNA 基因（1 630 941～1 628 035）的間隔區(qū)比嗜酸乳桿菌CICC 6074 基因組中16SrRNA基因（637135～635577）和23S rRNA 基因（635372～632 467）的間隔區(qū)多出的1 536 對堿基后，兩個基因組的相似度最高（圖3d）。除了主要來自于兩對23SrRNA 基因（相似性分別為99.3%和96.1%）、一對transposase 基因（相似性為97.5%）、一對16SrRNA 基因（相似性為99.2%）的序列差異，其它CDS 的分布位置與序列基本一致。

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果注釋與表達量分析

將經(jīng)過質(zhì)控和拼接后的RNA 序列與對照基因組的序列進行比對注釋，并對注釋情況進行統(tǒng)計。基于表達矩陣，進行樣本間Venn，PCA 分析，獲取組間的共表達和特表達基因。圖4a 可以看出，對照組檢測出了1 704 個表達基因，熱脅迫組和鹽脅迫組分別檢測出了1 805 和1 713 個表達基因，其中3 組共表達的基因有1 677 個，熱脅迫組特異表達的基因有74 個，鹽脅迫組有1 個。PCA 分析發(fā)現(xiàn)，圖4b 中PC1 的貢獻度為69.16%，PC2 的貢獻度為17.48%，3 組樣品能夠較好的分別聚集到一起，組間差異明顯。結(jié)果表明，在不同脅迫環(huán)境中，嗜酸乳桿菌CICC 6074 的基因表達譜會發(fā)生不同程度的變化，在高溫脅迫時乳酸菌細胞內(nèi)表達的基因數(shù)量明顯上升，而在高鹽脅迫的環(huán)境中則上升的不多。說明在面對高溫脅迫時，嗜酸乳桿菌的細胞可能會做出更多的應激反應。

圖4 轉(zhuǎn)錄組基因表達量分析Fig.4 Gene expression analysis of transcriptome

2.5 轉(zhuǎn)錄組基因差異表達分析

圖5 表達量差異火山圖顯示了不同組間轉(zhuǎn)錄組基因的差異表達情況，橫坐標為不同基因在兩組樣本間表達差異的倍數(shù)變化值，縱坐標為基因表達量變化差異的統(tǒng)計學檢驗值，圖中紅色圓點、綠色圓點和灰色圓點分別表示顯著上調(diào)、顯著下調(diào)和非顯著差異的基因?？芍跓崦{迫組，總共檢測到1 790 個差異表達基因，其中1 277 個有差異但不顯著，513 個有顯著性差異；顯著上調(diào)305個，顯著下調(diào)208 個。在鹽脅迫組中總共檢測到1 654 個差異表達基因，相較對照組來說，其中1 494 個有差異但不顯著，161 個有顯著性差異；顯著上調(diào)81 個，顯著下調(diào)80 個。在Zhang等[24]的研究中，高溫脅迫下的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的轉(zhuǎn)錄組中有242 個基因表達上調(diào)，320 個基因表達下調(diào)，Zhao等[25]的文章中鹽脅迫下植物乳桿菌KLDS1.0391 的轉(zhuǎn)錄組中有260 個基因表達差異顯著，其中159 個基因表達顯著上調(diào)，101 個基因表達顯著下調(diào)。這些結(jié)果與本研究相似，也說明了在面對高溫脅迫時嗜酸乳桿菌的細胞可能會做出更多的應激反應。一個有意思的現(xiàn)象是，在熱應激時，嗜酸乳桿菌的α-半乳糖苷酶較對照組有83.32 倍的上調(diào)，這或許對嗜酸乳桿菌在食品生產(chǎn)或者飼料生產(chǎn)上有著巨大的應用價值[26-27]。

圖5 表達量差異火山圖Fig.5 Differential expression volcano map

2.6 功能富集分析

對差異表達基因集中的基因進行GO 富集和KEGG 富集分析，結(jié)果如圖6 所示。圖6a 和圖6b展示了熱脅迫組、鹽脅迫組分別與對照組的差異表達基因GO 功能富集分析結(jié)果，可以看出，熱脅迫組與對照組的差異表達基因主要富集于氨基酸、硫胺素、有機酸及tRNA 相關的生物學過程，而鹽脅迫組與對照組的差異表達基因主要富集于脫氧核糖核苷酸、嘧啶脫氧核糖核苷酸合成與代謝，肽跨膜轉(zhuǎn)運酶活性，肽轉(zhuǎn)運酶活性，酰胺跨膜轉(zhuǎn)運酶活性等生物過程。圖6c 和圖6d 展示了熱脅迫組、鹽脅迫組分別與對照組的差異表達基因KEGG 功能富集分析結(jié)果，在熱脅迫組中碳水化合物代謝、翻譯、膜運輸、氨基酸代謝、核苷酸的代謝等代謝通路富集的基因相對較多，而在鹽脅迫組中核苷酸代謝、膜運輸、碳水化合物代謝、氨基酸代謝和細胞群體感應或者生物膜形成等代謝通路富集的基因相對較多。這同樣證明了上文的陳述，兩組脅迫條件下細胞的應激反應是不同的。

圖6 轉(zhuǎn)錄組功能富集分析Fig.6 Functional enrichment analysis of transcriptome

Chen等[6]和Ge等[7]的研究說明了高溫處理會影響乳酸菌的有機酸代謝，這與我們的結(jié)果有一定的一致性，而López-Bucio等[28]也說明了有機酸代謝在細胞水平上對多種生物化學途徑（包括能量生產(chǎn)、氨基酸生物合成前體的形成）以及對環(huán)境的適應具有重要意義。在高溫下培養(yǎng)細胞會抑制蛋白質(zhì)的合成，而持續(xù)熱脅迫也會導致細胞對于環(huán)境的適應，也就是蛋白質(zhì)合成的逐漸恢復[29]，這說明為了幫助細胞適應熱脅迫，會有大量的翻譯調(diào)控過程參與進來。細胞對鹽脅迫的反應是通過滲透液的合成、K+的吸收和Na+在質(zhì)膜上的外排[30]，說明了膜運輸對細胞適應鹽脅迫環(huán)境的重要性，我們的結(jié)果中高鹽脅迫下嗜酸乳桿菌的轉(zhuǎn)錄組中膜運輸?shù)纳镞^程明顯增多。在Fu等[31]的研究中，氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、膜轉(zhuǎn)運、調(diào)控功能和細胞信號轉(zhuǎn)導等變化對海藻希瓦氏菌的高鹽響應具有重要意義，而Conde等[32]也描述了糖醇代謝可能在高鹽脅迫下受到調(diào)節(jié)，功能富集分析發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫時乳酸菌的糖醇代謝增強。

3 結(jié)論

嗜酸乳桿菌CICC 6074 的基因組長1 992 024 bp，是一條雙鏈環(huán)狀DNA分子，GC 含量為34.71%，總共預測出來1 864 個基因，與已經(jīng)發(fā)表的嗜酸乳桿菌的基因組相似度極高，遺傳信息基本一致。高溫和高鹽兩種脅迫條件下嗜酸乳桿菌的轉(zhuǎn)錄組與對照組產(chǎn)生了一定的差異性，分析發(fā)現(xiàn)，在面對高溫脅迫時，嗜酸乳桿菌的細胞可能會做出更多的應激反應。功能富集分析的結(jié)果表明，在高溫脅迫時，嗜酸乳桿菌可能主要通過增強有機酸的代謝和翻譯調(diào)控過程來提升細胞對環(huán)境的適應性；而在高鹽脅迫時，則主要通過增強糖醇類代謝和增強膜運輸來提升生存能力。