張恒慧，張志軍，陳士國(guó)，葉興乾，張國(guó)華

（1 太原工業(yè)學(xué)院生物與食品教研室 太原030008 2 中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院 太原030051 3 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州310058 4 山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 太原 030006）

紫蘇（Perilla frutescens L.）別名荏子、赤蘇、紅蘇，為唇形科蘇屬一年生草本植物，是我國(guó)南北方普遍種植的傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)植物，也是衛(wèi)健委首批許可的60 種藥食同源植物之一[1]。紫蘇在我國(guó)有2 000 多年的栽培歷史，在日本、朝鮮、韓國(guó)、印度、緬甸及俄羅斯等其他國(guó)家也有廣泛分布[2]。紫蘇全身是“寶”，其葉（蘇葉）、梗（蘇梗）和果（蘇子）均可入藥，也可用于香料、油用及食用，已成為一種備受世界關(guān)注的多用途植物[3-7]。

由于紫蘇籽中富含不飽和脂肪酸的油脂含量較高，因此過去針對(duì)紫蘇籽的研究主要在于紫蘇籽油用作高端食用油的開發(fā)和利用[8]。然而，脫油后所剩的紫蘇粕不易被消化和直接利用，常被丟棄或者用作廉價(jià)飼料，難以高效利用且大量丟棄造成環(huán)境污染。研究表明，紫蘇籽粕中不僅蛋白質(zhì)含量高（最高約為65%），而且所含蛋白質(zhì)氨基酸組成豐富，包括8 種人體必需氨基酸，各必需氨基酸含量與雞蛋蛋白相當(dāng)[9]。紫蘇粕蛋白的低溶解性和大分子質(zhì)量限制了其應(yīng)用。通過酶解制備生物活性肽，是提升紫蘇粕蛋白價(jià)值的手段。

通過控制酶解技術(shù)對(duì)副產(chǎn)物蛋白進(jìn)行深度開發(fā)，制備具有抗氧化、抗菌、降血脂、醒酒等功能的生物活性肽的研究已取得一定進(jìn)展[10-11]。例如，趙謀明等[12]以副產(chǎn)物玉米黃粉為原料制備具有高效醒酒活性潛力的玉米肽，能夠高效激活乙醇脫氫酶。Chen等[13]通過酶解大米渣蛋白制備高抗氧化活性的大米肽，具有較強(qiáng)的自由基清除活性。還有許多學(xué)者通過水解如大豆粕、山核桃粕等植物蛋白[14-15]以及秋刀魚、金槍魚副產(chǎn)物等動(dòng)物蛋白[16-17]制備高抗氧化活性的肽段，并對(duì)抗氧化肽的富集和氨基酸序列鑒定等研究方法及思路的創(chuàng)新做出了貢獻(xiàn)。

氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)引起的一種負(fù)面作用，被認(rèn)為是衰老和疾病的重要原因。當(dāng)機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)清除自由基的速度趕不上自由基產(chǎn)生的速度，自由基大量累積，從而造成氧化損傷，使生物大分子出現(xiàn)交聯(lián)或者斷裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能被破壞。為了恢復(fù)抗氧化與氧化作用體系的平衡，機(jī)體根據(jù)需要及時(shí)補(bǔ)充抗氧化膳食添加劑。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，篩選堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶來水解紫蘇粕粉，制備高抗氧化活性的紫蘇肽，并對(duì)其抗氧化活性組分進(jìn)行分離、富集及氨基酸序列鑒定，為拓展紫蘇粕的附加值和研發(fā)抗氧化的功能紫蘇肽產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽采自中北大學(xué)試驗(yàn)田。堿性蛋白酶Alcalase（2.4AU/g），諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶（80 萬U/g）、中性蛋白酶（6 萬U/g）、風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme（1.5 萬U/g），北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Sephadex G-25 填料（P 17-0033-01），美國(guó)GE 公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司；Isolera One 快速制備液相系統(tǒng)，瑞典Biotage 公司；納升級(jí)UHPLC 液相系統(tǒng)，美國(guó)Thermo Fisher 公司；質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司；紫外-可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；TGL-12B 型低溫高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇活性肽的制備 參考Mudgil等[18]的方法并稍加調(diào)整。以紫蘇粕為原料，分別選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)制備紫蘇活性肽。將紫蘇籽榨油脫脂，粉碎過篩，得到脫脂紫蘇粕粉。將脫脂紫蘇粕粉以1∶22（g/mL）的料液比加入去離子水，以7%的加酶量加入所需蛋白酶，低速攪拌均勻后調(diào)節(jié)pH 值至蛋白酶最適pH 值，置水浴鍋中60 ℃恒溫加熱反應(yīng)。酶解4 h 后，將反應(yīng)溶液于沸水中加熱10 min，使蛋白酶鈍化失活，反應(yīng)終止。

1.3.2 樣品中蛋白質(zhì)總含量的測(cè)定 參照Olsen等[19]的方法，采用凱氏定氮法測(cè)定紫蘇粕粉中蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 水解度（DH）的測(cè)定 參照Rios-Herrera等[20]的方法，采用改進(jìn)的pH-stat 法測(cè)定酶解液的水解度（degree of hydrolysis，DH）。當(dāng)pH＞6 時(shí)，酶解液釋放H+的量大于結(jié)合H+的量，通過加堿保持pH 值與初始條件一致，堿液的消耗量水解的肽鍵數(shù)目成正比，即可計(jì)算水解度。向反應(yīng)后的紫蘇蛋白酶解液中加入40%甲醛溶液，固定游離氨基，精確、迅速滴加0.1 mol/L NaOH 使pH 值恢復(fù)初始值（±0.1 pH），記錄標(biāo)準(zhǔn)濃度NaOH 的用量，并將冷卻后的反應(yīng)液在3 000 r/min 離心15 min，收集上清液4 ℃保存或-20 ℃凍存待用，上清液即粗制的紫蘇活性肽。紫蘇蛋白水解度計(jì)算公式：

式中：h——單位質(zhì)量蛋白質(zhì)被水解肽鍵的量，標(biāo)準(zhǔn)單位mmol/g；htot——單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)，mmol/g，對(duì)于紫蘇蛋白htot為8.0 mmol/g；V——滴定消耗堿的體積（mL）；N——滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液的濃度（mol/L）；α——為α-氨基的解離度，取0.986；Mp——稱取樣品所含蛋白總量，g。

1.3.4 可溶性蛋白濃度的測(cè)定 參照Betti等[21]的方法，采用BCA 法測(cè)定粗制紫蘇活性肽上清液的可溶性蛋白質(zhì)（肽）含量。

1.3.5 抗氧化活性的測(cè)定 參照Abeynayake等[22]的方法測(cè)定DPPH·清除率。取100 μL 稀釋至已知濃度的紫蘇蛋白酶解上清液，加入900 μL 160 μmol/L DPPH 工作液，以去離子水代替樣品作對(duì)照組，以無水甲醇代替DPPH 溶液作空白組，室溫混勻避光放置30 min，以無水甲醇作參比，在518 nm 處測(cè)吸光值，重復(fù)3 次取平均值，計(jì)算DPPH清除率。

式中：AS——試驗(yàn)組樣品與DPPH 工作液反應(yīng)后的吸光值；Ar——空白組樣品加入無水甲醇后的吸光值；A0——對(duì)照組去離子水加入DPPH工作液后的吸光值。

1.3.6 膜超濾法分離紫蘇活性肽 采用截留分子質(zhì)量分別為10 ku 和3 ku 的超濾離心管對(duì)紫蘇蛋白酶解上清液進(jìn)行分級(jí)分離。酶解上清液首先通過截留分子質(zhì)量為10 ku 的超濾膜，其濾液再通過3 ku 的超濾膜，控制離心條件4 ℃、5 000 r/min離心處理10 min。經(jīng)超濾離心后得到組分F1（<3 ku）、F2（3～10 ku）、F3（>10 ku），測(cè)定各組分的蛋白質(zhì)濃度以及抗氧化活性等[23]。收集超濾分離后的各組分凍干，備用。

1.3.7 Sephadex G-25 凝膠過濾層析分離 將超濾離心分離所得抗氧化性最強(qiáng)的組分用凝膠層析柱純化。凝膠層析柱選用葡聚糖凝膠Sephadex G-25 為填料，柱2.6 cm×70 cm，將層析柱安裝在Biotage 快速制備液相系統(tǒng)Isolera One 上，用0.025 mol/L Tris-HCl 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）平衡層析柱，流速1.0 mL/min。上樣前對(duì)樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，檢出多肽組分的最大吸收波長(zhǎng)202 nm。結(jié)合文獻(xiàn)[24]方法采用202 nm/214 nm 進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)。上樣后用超純水洗脫，洗脫流速3 mL/min，在線檢測(cè)洗脫液在雙波長(zhǎng)下的吸光值。設(shè)定系統(tǒng)自動(dòng)收集的最低吸收值，系統(tǒng)自動(dòng)收集不同峰的分離組分，測(cè)定各組分抗氧化活性及蛋白質(zhì)濃度。

1.3.8 快速制備液相C-18 反相色譜分離 將凝膠過濾層析分離所得抗氧化性最強(qiáng)的組分用Biotage SNAP Ultra C-18（30 g）色譜柱進(jìn)行反相色譜分離。洗脫液A：0.065%TFA 超純水溶液；洗脫液B：乙腈；檢測(cè)：UV202nm/214nm。上樣前，柱子先分別用100%乙腈和超純水沖洗。進(jìn)樣后洗脫液B 的梯度洗脫步驟如下：0～10%（體積分?jǐn)?shù)），3 min；10%～100%（體積分?jǐn)?shù)），30 min；100%（體積分?jǐn)?shù)），6 min；流速15 mL/min。系統(tǒng)自動(dòng)收集各吸收峰的洗脫液，將同一分離組分收集的各管混合，測(cè)定各組分抗氧化活性及蛋白質(zhì)濃度[25]。

1.3.9 RP-HPLC 在線連接的 ESI-MS/MS 鑒定紫蘇肽的氨基酸序列組成

1）色譜條件 色譜柱：分析柱C18 column（C18 1.9 μm 0.15 mm×120 mm），Thermo Fisher；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；柱溫：30 ℃；流速：600 nL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸超純水溶液；流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫條件：0～8 min，0%～12% B（線性梯度）；8～48 min，12%～23% B（線性梯度）；48～68 min，23%～36% B（線性梯度）；68～69 min，36%～95% B（線性梯度）；69～78 min，95% B（等量洗脫）[13]。

2）質(zhì)譜條件 經(jīng)RP-HPLC 分析的樣品流以600 nL/min 的速度穿過電噴霧界面進(jìn)入質(zhì)譜儀。采用正離子掃描模式，霧化氣和干燥氣為高純氮?dú)?，掃描范圍為m/z 0～1 500。MS/MS 肽序列分析借 助 Sequest 和 Proteome Discoverer（Thermo Scientific）軟件搜庫鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對(duì)紫蘇蛋白水解度及酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

蛋白酶的選擇直接影響酶解反應(yīng)結(jié)果和產(chǎn)物特性，包括蛋白質(zhì)經(jīng)酶切后肽段分子質(zhì)量大小、蛋白質(zhì)水解程度以及產(chǎn)生肽段的生物活性等。4 種蛋白酶對(duì)紫蘇蛋白水解程度和酶解產(chǎn)物抗氧化活性結(jié)果見圖1 和圖2。由圖1 可知，相對(duì)于其它3種酶，堿性蛋白酶Alcalase 對(duì)紫蘇粕蛋白的水解程度最高，約25.94%。有研究表明蛋白質(zhì)水解度是酶解產(chǎn)物高活性的重要指標(biāo)，只有蛋白質(zhì)水解度高才可能釋放出更多具有活性的基團(tuán)[15]。García等[26]對(duì)比堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)乳清蛋白的水解效果，其中堿性蛋白酶水解效果要優(yōu)于風(fēng)味蛋白酶，水解度最高達(dá)24.5%。本研究結(jié)果同樣是堿性蛋白酶對(duì)紫蘇蛋白的作用效果明顯高于其它3 種酶。

圖1 4 種蛋白酶反應(yīng)后蛋白質(zhì)水解度的比較Fig.1 Comparison of degree of hydrolysis（DH）after reaction of 4 proteases

圖2 4 種蛋白酶水解產(chǎn)物DPPH 自由基清除能力的比較Fig.2 Comparison of DPPH scavenging capacity of four protease hydrolysates

由圖2 可知，堿性蛋白酶作用紫蘇蛋白后的酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率最高，且風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率明顯低于其它3 種酶，與堿性蛋白酶組存在顯著差異（P<0.01）。在García等[26]的研究中，堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶在不同水解條件下水解乳清蛋白獲得的499 種肽段具有潛在的抗氧化活性。綜合考慮水解度和抗氧化活性，決定選取堿性蛋白酶Alcalase 作為水解紫蘇蛋白制備抗氧化活性肽的主要用酶。

2.2 不同超濾離心分離組分的抗氧化活性

采用超濾膜過濾法來分離純化生物活性肽，如Roslan等[27]用多層超濾膜分離羅非魚副產(chǎn)物酶解液，制備小分子肽，通過超濾分離手段實(shí)現(xiàn)了小分子肽的分離和富集。本研究中紫蘇蛋白酶解上清液經(jīng)超濾離心獲得F1、F2、F33 個(gè)組分，稀釋至相同濃度后測(cè)得抗氧化活性見圖3。F1（MW<3 ku）清除DPPH·的能力高于其它組分，差異極顯著。質(zhì)量濃度50 μg/mL 的F1組分的DPPH·清除率為（50.50±0.16）%。收集組分F1，進(jìn)行后續(xù)分離純化。Sabeena等[23]通過酶解大西洋鱈魚蛋白，分離純化獲得抗氧化肽，對(duì)比超濾分離的3 個(gè)組分（>5 ku，3～5 ku 和<3 ku）的抗氧化性，<3 ku 的組分具有更高的抗氧化活性。本研究結(jié)果與其研究結(jié)果相似，蛋白酶解液經(jīng)截留分子質(zhì)量較小的濾膜分離得到的組分（一般MW<3 ku）抗氧化活性較高，這是因?yàn)榉肿淤|(zhì)量較小的肽鏈中具有抗氧化活性的氨基酸殘基能夠更多的暴露并且充分發(fā)揮抗氧化作用。

圖3 超濾離心分離后各組分的DPPH·清除率Fig.3 DPPH radical scavenging rate of fractions separated by ultrafiltration centrifugation

2.3 Sephadex G-25 凝膠過濾色譜分離各組分的抗氧化活性

如圖4 所示，在凝膠過濾色譜分離前先對(duì)F1組分的紫外-可見吸收光譜進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，獲得光吸收值最大的波峰為202 nm。Hsu[28]在利用凝膠過濾色譜法分離金槍魚副產(chǎn)物酶解液中抗氧化活性肽時(shí)，檢測(cè)器選擇的光吸收波長(zhǎng)為214 nm 左右。You等[29]用凝膠過濾色譜分離泥鰍蛋白抗氧化活性肽，也選擇214 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。后續(xù)在快速制備液相系統(tǒng)自動(dòng)收集分離組分的過程中選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè)，將檢測(cè)波長(zhǎng)分別設(shè)置為202 nm（紅色峰線）和214 nm（黑色峰線）（見圖5）。

圖4 F1 組分中多肽的紫外-可見全波長(zhǎng)吸收掃描Fig.4 UV-visible full wavelength scanning of peptides in fraction F1

圖5 凝膠過濾色譜法分離純化組分F1Fig.5 Separation of fraction F1 by gel filtration chromatography

由圖5 可知，根據(jù)色譜洗脫結(jié)果組分F1經(jīng)凝膠過濾色譜分離后收集到3 個(gè)峰，分別命名為組分P1、P2和P3。收集3 個(gè)組分并確定各自濃度后稀釋至相同質(zhì)量濃度（3 μg/mL），測(cè)定它們的清除DPPH·的能力。如圖6 所示，組分P3的DPPH·自由基清除率最高，為（54.09±1.18）%，抗氧化活性最強(qiáng)，被選作分離純化的目標(biāo)組分。經(jīng)蛋白酶水解的片段分子質(zhì)量大小各異，其抗氧化活性也與分子質(zhì)量大小密切相關(guān)，因此分子質(zhì)量大小分離酶解產(chǎn)物中不同活性組分的重要因素。凝膠過濾色譜可使小分子活性肽進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，最后被洗脫下來實(shí)現(xiàn)分離。用凝膠過濾色譜分離純化活性肽已有很多報(bào)道，如Chen等[24]用Sephadex G-150 凝膠過濾色譜分離純化南瓜籽蛋白抗氧化肽，能截留分子質(zhì)量小于3 ku 的酶解上清液，分離成6 個(gè)組分，分離效果良好。本試驗(yàn)分離篩選目標(biāo)肽的相對(duì)分子質(zhì)量在1 000～3 000。選用Sephadex G-25 葡聚糖凝膠分離純化經(jīng)超濾離心分離的抗氧化活性最高的F1組分。

圖6 凝膠過濾色譜法分離F1 后各組分的DPPH·清除率Fig.6 DPPH radical scavenging rate of fractions separated by gel filtration chromatography

2.4 制備液相C-18 反相色譜分離各組分的抗氧化活性

反相液相色譜法因色譜柱分離效率高、重現(xiàn)性好、生物活性分子相容性好以及靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，幾乎對(duì)各種類型的有機(jī)化合物都呈現(xiàn)良好的選擇性，被廣泛應(yīng)用于小分子肽類的分離。經(jīng)凝膠過濾色譜分離所得組分P3抗氧化性明顯高于其它組分，作為目標(biāo)組分進(jìn)一步通過反相制備液相系統(tǒng)分離，得到4 個(gè)組分，分別命名為P3-1、P3-2、P3-3和P3-4（見圖7）。收集各組分濃縮至3 μg/mL，測(cè)定其清除DPPH·的能力，結(jié)果如圖8 所示。組分P3-4的DPPH·自由基清除率最高，為（58.8±0.39）%，抗氧化活性明顯高于其它組分，分析高抗氧化活性的肽段存在其中。

圖7 反相液相色譜法分離純化組分P3Fig.7 Separation of fraction P3 by reversed-phase liquid chromatography

圖8 反相C18 液相色譜分離P3 后各組分的DPPH·清除率Fig.8 DPPH radical scavenging rate of fractions separated by reversed-phase C18 liquid chromatography

在洗脫過程中，流動(dòng)相極性減少、非極性增加時(shí)，不同水解片段分子與固定相之間的疏水作用下降，發(fā)生解締，溶質(zhì)分子被洗脫下來，因溶液中分子極性不同，洗脫時(shí)間也不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。反相色譜技術(shù)可以更好地將分子質(zhì)量相差不大的蛋白水解液小分子肽段細(xì)分，得益于具有抗氧化潛力的生物活性肽的高效富集，使得經(jīng)過反相色譜分離后的一些組分的抗氧化活性得到了提高。類似的現(xiàn)象在多種蛋白質(zhì)水解物中被觀察到，其中包括油菜籽蛋白和珍珠粟蛋白等水解物中的抗氧化肽[25，30]。

2.5 高抗氧化活性肽的氨基酸組成及序列分析鑒定

采用RP-HPLC 串聯(lián)ESI+源電噴霧質(zhì)譜儀對(duì)分離純化組分F1-P3-P3-4測(cè)序。圖9 為紫蘇蛋白酶解物分離純化組分F1-P3-P3-4的RP-HPLC 圖譜，可見有2 個(gè)主成分、4 個(gè)次成分及多個(gè)微量成分。經(jīng)HPLC 洗脫的組分會(huì)自動(dòng)進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜（MS）和二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）處理，采用分析軟件對(duì)洗脫的各組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。對(duì)主成分（峰74.63 min）進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜（MS）后，直接進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）分析，其MS/MS 分析結(jié)果如圖10 所示。經(jīng)測(cè)定，組分F1-P3-P3-4中豐度最高的活性肽段為十二肽，氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Leu-Lys-Asp-Ser-Phe-Glu-Arg-Gln-Gly-Met-Val，分子質(zhì)量為1 437.75u。經(jīng)肽譜庫和美國(guó)化學(xué)文摘檢索，該活性肽之前未有公開報(bào)道，是一種新發(fā)現(xiàn)的抗氧化性顯著的十二肽。

圖9 組分F1-P3-P3-4 的RP-HPLC 洗脫圖譜Fig.9 RP-HPLC elution spectra of fraction F1-P3-P3-4

圖10 74.63 min 出峰MS 質(zhì)譜圖Fig.10 Mass spectrogram of fraction 74.63 min

本研究分離肽段中含有疏水性氨基酸Leu、Gly、Met、Phe 及Val（約占總殘基量的1/2），且末端3 個(gè)疏水氨基酸殘基Gly-Met-Val 相連，對(duì)肽段抗氧化性有一定貢獻(xiàn)。Ren等[31]和Rajapakse等[32]指出肽段的抗氧化活性與其組成的疏水氨基酸關(guān)系密切，尤其是末端氨基酸為纈氨酸或亮氨酸等疏水氨基酸時(shí)，肽段抗氧化活性普遍較高。分析原因是這些氨基酸殘基中的非極性脂肪族基團(tuán)能夠很好地結(jié)合不飽和脂肪酸，增強(qiáng)捕獲自由基的能力。此外，Glu 能給自由基提供質(zhì)子，具有較高的自由基捕獲能力，這些肽段特征都與紫蘇活性肽的抗氧化活性相關(guān)。

3 結(jié)論

以紫蘇粕粉為原料，省略蛋白質(zhì)的提取分離過程，選用堿性蛋白酶為水解酶制備酶解產(chǎn)物。紫蘇蛋白酶解上清液依次通過超濾、凝膠過濾層析和反相色譜等一系列分離純化手段，分別利用分子質(zhì)量不同及親水、疏水等特性，將其中高抗氧化活性的肽組分進(jìn)行分離、純化和富集。以RPHPLC 在線連接的電噴霧離子質(zhì)譜（ESI-MS-MS）結(jié)合蛋白質(zhì)及多肽數(shù)據(jù)庫分析，對(duì)抗氧化活性最高組分的氨基酸序列進(jìn)行鑒定，得到序列為L(zhǎng)ys-Leu-Lys-Asp-Ser-Phe-Glu-Arg-Gln-Gly-Met-Val 的紫蘇抗氧化活性肽，分子質(zhì)量為1 437.8 u。而紫蘇肽在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平的抗氧化活性還需進(jìn)一步研究。