陸靜，申甜甜，焦艷娜，崔鳳云，朱紹華，成婧，易錫，付善良*

（1 長沙海關(guān)技術(shù)中心 食品安全科學(xué)技術(shù)湖南省重點實驗室 長沙410004 2 中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心 北京 100026）

二噁英類（Dioxins，DXNs）污染物是一類具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)及生物效應(yīng)的多氯代三環(huán)芳烴類化合物的統(tǒng)稱，在結(jié)構(gòu)上分別為多氯代二苯并對二噁英（PCDDs，75 種異構(gòu)體），氯代二苯并呋喃（PCDFs，135 種異構(gòu)體）和共平面多氯聯(lián)苯（Co-PCB）[1-2]。美國在越戰(zhàn)中使用2，4-滴和2，4，5-涕等落葉劑所造成的危害后果及日本米糠油事件引發(fā)的災(zāi)難之后，人們開始認(rèn)識到作為人類社會最為有毒、有害的一類化學(xué)物質(zhì)，DXNs 不僅具有難分解高生物蓄積性，還具有生殖毒性、神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌毒性和免疫毒性效應(yīng)等，被國際社會公認(rèn)為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[1，3-5]。其中，2，3，7，8-四氯代苯并二噁英（TCDD）是迄今為止發(fā)現(xiàn)毒性最強(qiáng)的化合物，比氰化鉀要毒100 倍以上，被世界衛(wèi)生組織判定為一級致癌物。二噁英類物質(zhì)毒性的另一個特點是，二噁英為脂溶性化合物，易積累在生物體的脂肪組織中，不易被降解和排出，可在人和動物體內(nèi)不斷蓄積達(dá)到較高濃度，在生物體表現(xiàn)出明顯的癥狀之前有一個漫長的潛伏過程[6-9]。目前，國內(nèi)還沒有二噁英類物質(zhì)的限量標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)（EC）No 1881-2006 歐盟食品污染物限量標(biāo)準(zhǔn)[10]，食品中二噁英總和的最高限量值為6 pg/g，多氯聯(lián)苯的最高限值為12 pg/g。

DXNs 分析屬于超痕量、多組分分析，其分析測定必須具備有效的采樣技術(shù)，定量提取和凈化技術(shù)，異構(gòu)體的高效分離，準(zhǔn)確的定性和定量，以及良好的質(zhì)量管理等技術(shù)條件[11-12]。且同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法是國際上通用的測定食品、飼料及環(huán)境樣品中二噁英質(zhì)量濃度的方法[13-15]。在食品安全受到廣泛關(guān)注下，我國修改并采用了美國EPA 1613和EPA 1668A，提出適合我國食品中二噁英以及類似物檢測的標(biāo)準(zhǔn)[16]。在該項標(biāo)準(zhǔn)中，應(yīng)用高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（HRGC-HRMS）技術(shù)，在質(zhì)譜分辨率大于10 000 的條件下，通過精確質(zhì)量測量、監(jiān)測目標(biāo)化合物的兩個離子，獲得目標(biāo)化合物的特異性響應(yīng)。HRGC-HRMS 分析靈敏度高、抗基質(zhì)干擾強(qiáng)，檢出限可達(dá)到fg 級別。然而其運行和維護(hù)成本較高，對人員的操作水平也有較高要求。自2014 年6 月起，GC-MS/MS 成為歐盟委員會（EU）規(guī)程2017/644 中的一項確證方法[17]。目前，GC-MS/MS 法已廣泛用于食品、飼料及環(huán)境樣品中二噁英及二噁英類多氯聯(lián)苯（PCDD/Fs 和DL-PCBs）的檢測[18-21]。不少學(xué)者和專家對比研究了該兩種儀器在檢測PCDD/Fs 的區(qū)別。Palmiotto等[22]采集環(huán)境土樣，研究了GC-MS/MS 和HRGCHRMS 測定同一份樣品的處理后溶液中PCDD/Fs濃度的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在22 個樣品中，PCDD/Fs的檢出濃度為0.33～14.11 pg WHO-TEQ/g，當(dāng)樣品的PCDD/Fs 的最低濃度為1 pg WHO-TEQ/g時，兩種儀器的測定偏差＜20%；當(dāng)樣品的PCDD/Fs 的最低濃度為3 pg WHO-TEQ/g 時，兩種儀器的測定偏差為＜4%。Sun[23]對魚、牛肉以及玉米飼料3 種基質(zhì)中的PCDD/Fs 濃度進(jìn)行GC-MS/MS 和HRGC-HRMS 儀器比對檢測，檢出濃度為0.9～9.0 pg/g，兩種儀器的測定偏差為0.7%～14%。

綜上所述，開發(fā)一種適合動物源性食品中PCDD/Fs 和DL-PCBs 的GC-MS/MS 方法是可行的[13，24]。目前發(fā)達(dá)國家均以此為技術(shù)堡壘，我國必須加快此類方法的標(biāo)準(zhǔn)化研究，建立國際認(rèn)可的二噁英超痕量分析實驗室，以應(yīng)對分析技術(shù)的挑戰(zhàn)[25-26]。該方法的建立和優(yōu)化能夠有力地保障關(guān)區(qū)動物源性食品的順利出口。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

二氯甲烷（農(nóng)殘級）、甲苯（農(nóng)殘級）、乙酸乙酯（農(nóng)殘級）、正己烷（農(nóng)殘級），iMagiLab 公司；硅膠（農(nóng)殘級），加拿大Silicycle 公司；濃硫酸（分析純）、無水硫酸鈉（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硅藻土，美國ThermoFisher 公司。多層硅膠柱、堿性氧化鋁柱、活性炭柱，F(xiàn)MS 美國FMS 公司。

分離度檢查標(biāo)準(zhǔn)溶液，同位素標(biāo)記定量內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液、回收率內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液；含有天然和同位素標(biāo)記的系列校正標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液均從Wellington Laboratories（加拿大）公司購買，濃度同國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定[16]，臨用時取20 μL 于進(jìn)樣小瓶中，備用。

硅膠使用前先用甲醇和二氯甲烷活化，晾干后在600 ℃下至少烘烤12 h，再以濃硫酸酸化（44%）。

魚肉樣品為從當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I的草魚，去除內(nèi)臟、魚骨，肉樣攪碎后以冷凍干燥機(jī)干燥，混勻備用。

氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Shimadzu GC-MSTQ8050 型），日本島津公司；快速溶劑萃取儀（E-916）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-300），瑞士步琦公司；全自動樣品凈化系統(tǒng)（JF-602），北京普立泰科公司；冷凍干燥機(jī)（Yamato DC801），日本雅馬拓公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理方法

1.2.1.1 提取 稱取5.0 g 冷凍干燥后的樣品于陶瓷研缽中，研磨后與適量硅藻土混合均勻，轉(zhuǎn)移至40 mL 的萃取池中，加入PCDD/Fs 和DL-PCBs回收率和精密度檢查標(biāo)準(zhǔn)溶液（B.4×10 和B.11×100）各50 μL，13C12-PCDD/Fs和13C12-DL-PCBs 標(biāo)記的定量內(nèi)標(biāo)溶液（B.2 和B.8×10）各20 μL，密閉后置于加速溶劑萃取儀上提取，提取條件如下：提取溶劑正己烷：二氯甲烷（1∶1，體積比）；壓力10.3 MPa；溫度150 ℃；第1 次、2 次、3 次循環(huán)靜態(tài)提取時間分別為10，5，2 min；共計循環(huán)3 次。

1.2.1.2 除脂 將提取液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，加入100 mL 正己烷，50 g 酸化硅膠，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70 ℃條件下旋轉(zhuǎn)加熱20 min。靜置8～10 min 后，將正己烷倒入圓底燒瓶中。殘渣再用50 mL 正己烷洗滌，重復(fù)3 次，合并正己烷溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至2～5 mL。

1.2.1.3 凈化 將多層硅膠柱、堿性氧化鋁柱和活性炭柱按順序接在全自動樣品凈化系統(tǒng)上，按程序配好各洗脫溶液并連接好管路，將上述試樣轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣管中。按照洗脫程序順序洗脫，對樣品進(jìn)行凈化、分離，分別收集含PCDD/Fs 和DLPCBs 組分的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至3～5 mL。

1.2.1.4 濃縮 將上述濃縮液轉(zhuǎn)移至KD 濃縮管中，氮吹濃縮到1～2 mL，氮氣流下轉(zhuǎn)移至微量進(jìn)樣小瓶中，用正己烷洗滌KD 管，一并轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶濃縮到約100 μL。加入PCDD/Fs 回收率內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（B.3）10 μL 和DL-PCBs 回收率內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（B.10×100，異辛烷）40 μL，繼續(xù)在微小氮氣流下濃縮至約20 μL，供GC-MS/MS 測定。如果樣品當(dāng)日不進(jìn)行儀器分析，則于-10 ℃下避光保存。

1.2.2 儀器分析條件 PCDD/Fs 測定條件：色譜柱：SHIMADZU SH-Rxi-5Sil MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm 膜厚）；柱升溫程序：初始溫度120 ℃，保持1.0 min，以43 ℃/min 升溫至220 ℃，保持15 min，再以2.3 ℃/min 升溫至250 ℃，以0.9 ℃/min升溫至260 ℃，以20 ℃/min 升溫至310 ℃，保持9 min；接口溫度290 ℃，載氣為氦氣（純度不小于99.999%），流量為1 mL/min，恒流模式；離子源：電子轟擊源（EI），溫度230 ℃，電離能量70 eV。進(jìn)樣量1 μL；燈絲電流0.5 kV；溶劑延遲時間4.5 min。

DL-PCBs 測定條件：色譜柱SHIMADZU SHRxi-5Sil MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm 膜厚）；柱升溫程序：初始溫度80 ℃，保持2.0 min，以15 ℃/min 升溫至150 ℃，以2.5 ℃/min 升溫至270 ℃，保持3 min，以15 ℃/min 升溫至310 ℃，保持3 min；接口溫度290 ℃，載氣為氦氣（純度不小于99.999%），流量為1.2 mL/min，恒流模式；離子源：電子轟擊源（EI），溫度230 ℃，電離能量70 eV。進(jìn)樣量1 μL；燈絲電流0.5 kV；溶劑延遲時間6.0 min。

采集方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM），母離子/子離子對及其碰撞能量見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱及儀器檢測條件的選擇

色譜分離時，固定液種類的不同極大地影響目標(biāo)化合物在色譜柱上的保留時間和分離。本試驗對2，3，7，8-TCDF 異構(gòu)體的分離進(jìn)行了探討，結(jié)果如下。選用了Agilent J&W HP88（100 m×0.25 mm，膜厚0.20 μm）、Agilent DB-5（50 m×0.32 mm，膜厚1.2 μm）、RTX-2330（60 m×0.25 mm，膜厚0.1 μm）3 種不同型號及規(guī)格的毛細(xì)管色譜柱，來考察TCDD/TCDFs 的分離度和時間窗口。當(dāng)選用HP-88、DB-5 色譜柱時，2，3，7，8-TCDF 的分離度達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)要求，目標(biāo)物的出峰不明顯，因此都無法確定目標(biāo)物的保留時間。當(dāng)選用RTX-2330色譜柱時，2，3，7，8-TCDF 分離效果較好，因此進(jìn)一步優(yōu)化氣相的方法，以達(dá)到最優(yōu)的分離度。接下來對進(jìn)樣口溫度（260，280 ℃），起始柱溫（80，90，100，110，120 ℃），進(jìn)樣量（1，2 μL）進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，進(jìn)樣口溫度和進(jìn)樣量對分離度的影響不大，而起始柱溫影響2，3，7，8-TCDF 的分離，在上述設(shè)定的5 種溫度下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)120 ℃下，2，3，7，8-TCDF 的峰形較好，能夠達(dá)到規(guī)定的分離度。

圖1、2 分別為PCDD/Fs 和DL-PCBs 校正標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 色譜圖（CS3）。

圖1 PCDD/Fs 校正標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 色譜圖（CS3）Fig.1 Chromatograms of PCDD/Fs solvents（CS3）

圖2 DL-PCBs 校正標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 色譜圖（CS3）Fig.2 Chromatograms of DL-PCBs solvents（CS3）

2.2 樣品前處理過程探討

因魚肉脂肪含量較低，且水產(chǎn)品為關(guān)區(qū)主要的檢測樣品類型，因此，首先選取魚肉為樣品基質(zhì)，采取快速溶劑萃取儀進(jìn)行提取，得到提取液，然后以全自動樣品凈化系統(tǒng)進(jìn)行凈化，在凈化過程中，發(fā)現(xiàn)提取、凈化步驟、洗脫液等主要影響因素[27-28]，分析如下：

當(dāng)提取循環(huán)1 次時，樣品提取不完全，因此，為了增加目標(biāo)物的回收率，增加了提取的循環(huán)次數(shù)和時間，這和文獻(xiàn)報道的結(jié)論一致[29-30]。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[16]，在同一批樣品分析之前，應(yīng)首先進(jìn)行分析過程的精密度和回收率試驗，樣品中同位素內(nèi)標(biāo)的回收率需達(dá)到25%～150%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，77L 和81L 的回收率分別為16.3%，13.5%。因此接下來對這兩個內(nèi)標(biāo)的損失來源進(jìn)行了探討。取B.8×10 溶液20 μL，加入正己烷100 mL 混勻，然后對此溶液分別只進(jìn)行酸化硅膠凈化、全自動凈化儀凈化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過酸化硅膠凈化后77L 和81L 的回收率分別為73.1%，73.8%，經(jīng)過全自動凈化儀凈化后77L 和81L 的回收率分別為38.4%，31.5%，由此可見，全自動凈化儀對目標(biāo)物的損失影響較大。接下來考察凈化儀的凈化步驟[30]。

凈化步驟如表2 所示，多層硅膠、堿性氧化鋁柱和活性炭柱經(jīng)過正己烷預(yù)潤洗，50%乙酸乙酯/50%甲苯、50%二氯甲烷/50%正己烷、正己烷等活化后，上樣，用正己烷淋洗多層硅膠柱和鋁柱后，以二氯甲烷/正己烷、乙酸乙酯/甲苯洗脫DLPCBs 后，最后活性炭柱經(jīng)反沖，用甲苯洗脫PCDD/Fs。在初始凈化步驟20～24 步中，系統(tǒng)流出溶液直接排至廢液，對DL-PCBs 的回收率造成較大損失，可能跟DL-PCBs 在管路中的殘留以及在乙酸乙酯/甲苯溶液中有較大溶解性有關(guān)。因此，調(diào)整洗脫步驟，20～24 步全部收集到DL-PCBs 的接收液中。同時對上樣后每步的淋洗和洗脫液分別進(jìn)行收集，研究77L 和81L 的損失情況，具體收集情況如下：進(jìn)樣前空運行一次收集液（S0）、進(jìn)樣后收集正己烷洗脫液（S1）、收集2%二氯甲烷/98%正己烷洗脫液（S2）、收集50%二氯甲烷/50%正己烷洗脫液（S3）、收集50%乙酸乙酯/50%甲苯洗脫液（S4）、收集正己烷洗脫液（S5）、收集甲苯洗脫液（S6）、收集再運行一次甲苯洗脫液（S7）。如圖3 所示，77L 和81L 主要收集在S4 步驟中，回收率＞60%。而在S5 步驟中也有少量洗脫，約為20%。在S0 和S7 步驟中只有微量的目標(biāo)物出現(xiàn)，可忽略不計。為了進(jìn)一步增加77L 和81L 的回收率，增加了50%乙酸乙酯/50%甲苯洗脫液的體積，當(dāng)增加其洗脫體積由16 mL 至30 mL 時，目標(biāo)物的回收率增加至80%，同時在S5 環(huán)節(jié)的殘留只有1%，基本可以忽略。然而，新的問題又出現(xiàn)了，因為PCDD/Fs 主要集中在S6 步驟的洗脫液中，當(dāng)增加S4 的洗脫體積后，最后在以甲苯洗脫PCDD/Fs時，13C12-1，2，3，4，6，7，8-HpCDF、13C12-1，2，3，4，6，7，8-HpCDD、13C12-1，2，3，4，7，8，9-HpCDF、13C12-OCDD 的回收率均小于55%，如圖4 所示。前述幾種目標(biāo)物有部分損失，可能是在用50%乙酸乙酯/50%甲苯洗脫DL-PCBs 時，PCDD/Fs 同時也被沖到炭柱前端，從而影響PCDD/Fs 的甲苯反沖洗脫，因此，最后還是選擇4 mL 的體積，而增加1次甲苯洗脫，對PCDD/Fs 的回收率影響不大，最終舍去該步驟。

圖3 DL-PCBs 在凈化步驟中的洗脫情況Fig.3 Elution of DL-PCBs in purification step

圖4 PCDD/Fs 在S6 和S7 步驟中的洗脫情況Fig.4 Elution of PCDD/Fs in purification step of S6 and S7

在初始的凈化步驟中，20～24 步溶液沒有收集，PCDD/Fs 的測定峰形較好，當(dāng)收集此部分溶液后，發(fā)現(xiàn)PCDD/Fs 的測定峰形變差，容易受DLPCBs 干擾。因此，在后續(xù)試驗中，分開收集DLPCBs 和PCDD/Fs，分開測定。當(dāng)測定完成PCDD/Fs 后，將其和DL-PCBs 的溶液合并，氮吹至約20 μL，達(dá)到完整收集和測定DL-PCBs 的目的，可以提高DL-PCBs 的回收率。77L 和81L 的回收率分別為93.0%，97.6%，滿足方法要求。

在上述方法考察中發(fā)現(xiàn)，S0 步驟中目標(biāo)物的含量可以忽略不計，這也從側(cè)面印證了儀器基本不存在殘留和交叉污染問題。但是試驗發(fā)現(xiàn)，全自動凈化儀在程序運行期間如有停電、故障等原因造成的停機(jī)、死機(jī)時，則容易導(dǎo)致目標(biāo)物的殘留，出現(xiàn)交叉污染情況，則需要用空白溶劑反復(fù)循環(huán)多次才能消除系統(tǒng)污染。因此，在儀器運行期間，需要保證儀器的正常運行。

2.3 方法的線性、檢出限和回收率

將PCDD/Fs 校正標(biāo)準(zhǔn)溶液和DL-PCBs 校正標(biāo)準(zhǔn)溶液分別按濃度由低到高的順序注入GCMS/MS 中，得到峰面積。以目標(biāo)物的含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性相關(guān)方程，各物質(zhì)的線性方程見表3，線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，表明該方法在較寬的濃度范圍內(nèi)色譜峰面積與含量呈較好的線性關(guān)系。從表3 可知，儀器測定時，各化合物的相對保留時間為1.000～1.001，符合國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。同時，表3 還列出了CS1 測定時的S/N 值，可見S/N值＞3，符合檢出限的計算法則，因此本方法能夠達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)中的限量要求[16]。

表3 PCDD/Fs 和DL-PCBs 的線性方程Table 3 The line equation of PCDD/Fs and DL-PCBs

以魚肉為例，進(jìn)行分析過程的精密度和回收率（OPR）試驗，加入PCDD/Fs 和DL-PCBs 回收率和精密度標(biāo)液（B.4×10 和B.11×100）各50 μL，按上述方法進(jìn)行樣品前處理并分析測定，采用內(nèi)標(biāo)法定量，設(shè)3 組平行試驗，得到的內(nèi)標(biāo)回收率結(jié)果見表4，目標(biāo)物的回收率結(jié)果見表5。內(nèi)標(biāo)的回收率為63.3%～106.8%，RSD 為0.4%～9.6%；目標(biāo)物的回收率為93.6%～114.5%，RSD 為0.9%～9.2%。因此，該方法準(zhǔn)確可靠，符合標(biāo)準(zhǔn)的要求，可以滿足實際魚肉樣品中PCDD/Fs 和DL-PCBs 的測定要求[16]。

表4 魚肉樣品中PCDD/Fs 和DL-PCBs 的內(nèi)標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table 4 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of PCDD/Fs 和DL-PCBs in fish（n=3）

表5 魚肉樣品中PCDD/Fs 和DL-PCBs 的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table 5 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of PCDD/Fs and DL-PCBs in fish（n=3）

3 結(jié)論

本文對采用GC-MS/MS 法測定魚肉樣品中PCDD/Fs 和DL-PCBs 的測定步驟進(jìn)行了方法優(yōu)化和探討，給前處理及儀器方法提供了更為詳細(xì)的解說。試驗結(jié)果表明，方法回收率和精密度、各化合物的方法檢出限等都符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求，方法具有普適性，為保障食品安全提供了很好的技術(shù)支持。