鮑綠地,徐秋月,段勇(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,昆明 650032;2.紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗教研室,云南紅河 661100;3.云南省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室,昆明 650032;4.云南省醫(yī)學(xué)檢驗臨床研究中心,昆明 650032)

隨著生物信息學(xué)和高通量測序技術(shù)迅速發(fā)展,不斷有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA(circRNAs)在人類疾病相關(guān)組織和細(xì)胞以及正常組織中廣泛表達(dá)[1],在人體的多種復(fù)雜功能和機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。circRNAs參與了各種惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲,在外泌體和體液中含量豐富,可通過細(xì)胞間通訊對腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生影響[2-3]。根據(jù)我國國家癌癥中心2022年公布的最新統(tǒng)計,肺癌仍然是癌癥死亡的第一大原因[4]。由于目前用于早期篩查肺癌的方法敏感性和特異性都不理想,易誤診和漏診,多數(shù)肺癌患者初次就診時已經(jīng)處于中晚期,錯過了最佳根治性手術(shù)治療時機(jī)[5-6]。因此,迫切需要探索早期具有高敏感性和特異性的非侵入性肺癌診斷方法應(yīng)用于臨床。研究顯示,肺癌患者外周血中多種循環(huán)circRNAs存在明顯差異表達(dá),有潛力作為診斷肺癌的生物學(xué)標(biāo)志物[7]。本研究旨在通過薈萃(Meta)分析評估外周血循環(huán)circRNAs對肺癌患者的診斷價值,以期為肺癌患者尋找理想的診斷標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1文獻(xiàn)檢索策略 系統(tǒng)檢索Ovid(https://ovidsp.ovid.com/)、Scopus(http://www.scopus.com/)、PubMed、Web of Science、Embase(https://www.embase.com/)、CBM(http://www.sinomed.ac.cn/)、Cochrane圖書館、知網(wǎng)、萬方和維普十個數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的關(guān)于circRNAs診斷肺癌的臨床研究文獻(xiàn),檢索時限為建庫至2023年1月。以主題詞結(jié)合自由詞的方式檢索,檢索主題詞包括:“RNA, Circular”、“環(huán)狀RNA”、“l(fā)ung neoplasms”、“肺癌”、“sensitiv*”、“predictive”、“診斷”,自由詞包括:“circRNAs”、“closed circular RNA”、“circular RNA”、“circRNA”、“sensitivity and specificity”、“predictive value of tests”、“pulmonary neoplasms”、“肺腫瘤”、“pulmonary cancer”等。由兩名研究者根據(jù)文獻(xiàn)檢索流程檢索文獻(xiàn),篩選出文獻(xiàn)提取特征數(shù)據(jù)并錄入表格中,篩選及特征數(shù)據(jù)提取過程中遇到任何分歧時邀請第三名研究者討論。

1.2文獻(xiàn)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn) (1)僅限于評估外周血循環(huán)circRNAs對肺癌患者診斷價值的臨床性研究;(2)肺癌患者有明確的病理組織診斷;(3)研究對象為肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌)組和健康人對照組;(4)研究中能直接獲得外周血循環(huán)circRNAs診斷肺癌的敏感性(sensitivity, Sen)、特異性(specificity,Spe)、樣本量等信息;(5)文獻(xiàn)語言為英文或中文。

1.2.2文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn) (1)重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)或不同文獻(xiàn)來源于同一組數(shù)據(jù);(2)綜述、系統(tǒng)評價、Meta分析文獻(xiàn)等;(3)以肺癌病理組織為標(biāo)本的臨床性研究;(4)無法直接獲取相關(guān)數(shù)據(jù)的研究,包括病例組及對照組數(shù)量、敏感性、特異性等;(5)非人體的臨床研究。

1.3文獻(xiàn)篩選和資料提取 將檢索到的文獻(xiàn)全部導(dǎo)入EndNote X 9 文獻(xiàn)管理軟件進(jìn)行文獻(xiàn)管理,根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)篩選出研究文獻(xiàn)。從研究文獻(xiàn)中提取特征數(shù)據(jù),包括第一作者、發(fā)表年份、肺癌類型、病例組及對照組數(shù)量、標(biāo)本來源、circRNAs及其表達(dá)水平、檢測方法、敏感性、特異性、ROC曲線下面積(AUCROC)、患者臨床病理參數(shù)、circRNAs檢測方法與試劑等。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 利用RevMan 5.3軟件根據(jù)診斷試驗質(zhì)量評價表(quality assessment of diagnostic accuracy studies)中的QUADAS-2工具表對納入研究的文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評價,包括風(fēng)險偏倚和臨床適用性評價[8]。使用Meta DiSc 1.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和查找異質(zhì)性來源,在異質(zhì)性分析中,如果I2≤50%或P≥0.10時采用固定效應(yīng)模型合并效應(yīng)量,如果I2>50%或P<0.10,使用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量,通過原始的TP、FP、FN、TN值繪制綜合ROC曲線(SROC)并計算AUCROC用以評價診斷價值,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用StataMP 14.0軟件繪制Galbraith圖與Deeks漏斗圖,對納入研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行敏感性分析和Deeks偏倚檢驗。

2 結(jié)果

2.1檢索結(jié)果 文獻(xiàn)檢索流程見圖1,初步檢索共獲得600篇相關(guān)文獻(xiàn),刪除重復(fù)文獻(xiàn)、綜述、系統(tǒng)評價、Meta分析文獻(xiàn)等后剩余264篇,進(jìn)一步通過閱讀文獻(xiàn)標(biāo)題、摘要及閱覽全文篩選,最終納入15篇符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)[9-23]。

2.2文獻(xiàn)基本特征 本次研究共納入15篇文獻(xiàn),包含17種circRNAs。所有肺癌病例均經(jīng)過病理組織學(xué)檢查確診,對照組為同期體檢健康者。各研究的circRNAs均來自于外周血液標(biāo)本。納入研究的文獻(xiàn)基本特征見表1。

2.3納入研究的文獻(xiàn)質(zhì)量評價 對納入研究的文獻(xiàn)質(zhì)量和偏倚風(fēng)險使用RevMan 5.3軟件根據(jù)診斷試驗QUADAS-2質(zhì)量評價工具表進(jìn)行評價,結(jié)果見圖2。所有納入研究的文獻(xiàn)得分均為4～6分,為低度偏倚風(fēng)險,表明納入研究的文獻(xiàn)質(zhì)量較高。

圖2 根據(jù) QUADAS-2 質(zhì)量評價工具表進(jìn)行質(zhì)量和偏倚風(fēng)險評價結(jié)果

2.4診斷價值分析

2.4.1閾值效應(yīng) 將納入研究的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Meta DiSc 1.4軟件進(jìn)行分析,得出敏感性對數(shù)與(1-特異性)對數(shù)之間的Spearman相關(guān)系數(shù)(r)為0.326(P=0.217),結(jié)果不顯著,表明本次研究不存在閾值效應(yīng)。繪制對稱SROC曲線沒有出現(xiàn)“肩臂狀”,本次研究無閾值效應(yīng)。見圖3。

圖3 SROC曲線

2.4.2診斷性試驗的評價指標(biāo) 經(jīng)診斷比值比(DOR)的Cochran-Q檢驗得出Cochran-Q=53.17,P<0.001,表明本研究存在非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性,并且本次研究的敏感性、特異性、陽性似然比、陰性似然比、DOR的I2均大于50%,故而采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行以上5個效應(yīng)量的合并。結(jié)果顯示,應(yīng)用外周血循環(huán)circRNAs診斷肺癌的合并敏感性為0.707(95%CI:0.682～0.731),合并特異性為0.792(95%CI:0.766～0.817),合并陽性似然比3.294(95%CI:2.599～4.175),合并陰性似然比0.359(95%CI:0.295～0.436),合并SROC AUCROC=0.839 7,Q指數(shù)=0.771 5;合并DOR為11.520(95%CI:7.433～17.853)。見圖4。

圖4 外周血circRNAs診斷性試驗的評價指標(biāo)

2.4.3異質(zhì)性來源分析 根據(jù)納入研究的文獻(xiàn)中能獲取的資料[發(fā)表時間、樣本類型、樣本數(shù)量、病理類型、circRNAs表達(dá)、內(nèi)參基因、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑公司]進(jìn)行Meta回歸,結(jié)果顯示,檢測時選擇的內(nèi)參基因會對本次研究結(jié)果的異質(zhì)性呈顯著影響(P<0.05),而發(fā)表時間、樣本類型、樣本數(shù)量、病理類型、circRNAs表達(dá)、qRT-PCR試劑公司的影響不顯著(P>0.05)。依據(jù)檢測時選擇的內(nèi)參基因?qū)⒓{入的研究分組,分為以GAPDH為內(nèi)參基因組和以其他基因為內(nèi)參基因組,經(jīng)DOR的Cochran-Q檢驗得到以GAPDH為內(nèi)參基因組的Cochran-Q=14.13,P=0.226,DOR的I2=22.1%,以其他基因為內(nèi)參基因組的Cochran-Q=1.40,P=0.705 7,DOR的I2=0.0%。

此外,根據(jù)內(nèi)參基因和circRNAs表達(dá)水平不同分組進(jìn)行亞組分析,結(jié)果顯示,以GAPDH為內(nèi)參基因組的合并SROC的AUCROC=0.868 2,Q指數(shù)=0.798 7,以其他基因為內(nèi)參基因組的合并SROC的AUCROC=0.736 2,Q指數(shù)=0.682 1;而circRNAs表達(dá)上調(diào)組的合并SROC的AUCROC=0.824 4,Q指數(shù)=0.757 5,circRNAs表達(dá)下調(diào)組的合并SROC的AUCROC=0.869 8,Q指數(shù)=0.800 2。

2.5敏感性及發(fā)表偏倚檢驗

2.5.1敏感性分析 為檢驗本次研究結(jié)果的穩(wěn)定性與可靠度,選擇StataMP 14.0對納入研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行敏感性分析,結(jié)果顯示只有2篇原始研究存在較強(qiáng)敏感性,而其他原始研究不會造成運(yùn)算結(jié)果的敏感。剔除敏感性較強(qiáng)的原始研究再進(jìn)行分析,合并敏感性、合并特異性、合并SROC曲線下面積變化不大,本次研究結(jié)果比較穩(wěn)定。

2.5.2發(fā)表偏倚檢驗 通過應(yīng)用StataMP 14.0軟件繪制Deeks漏斗圖與Galbraith圖檢驗發(fā)表偏倚,結(jié)果顯示,Deeks漏斗圖斜率系數(shù)P=0.79,提示納入研究不存在發(fā)表偏倚;Galbraith圖顯示存在非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性,但大部分原始研究均落到可信區(qū)間回歸直線的內(nèi)部,異質(zhì)性小,表明納入研究的結(jié)果有可靠度。見圖5。

注:A,Deeks 漏斗圖;B,Galbraith 圖。圖5 異質(zhì)性及發(fā)表偏倚檢驗結(jié)果

3 討論

相比傳統(tǒng)的組織活檢,液體活檢操作簡單、創(chuàng)傷小、成本低,其中血液是更具優(yōu)勢的液體活檢標(biāo)本[24]。而circRNA能穩(wěn)定存在于外周血循環(huán)、腦脊液、尿液等體液中,在不同的生理和病理狀況下均可檢測到特定circRNAs的差異表達(dá)[3]。應(yīng)用外周血循環(huán)circRNAs作為新型液體活檢標(biāo)志物的研究前景更廣闊。越來越多研究表明外周血循環(huán)circRNAs具有良好的診斷肺癌效能。如Luo等[25]提出,circFOXP1在NSCLC患者的血清中呈顯著過表達(dá),并且穩(wěn)定性試驗的Ct值在極端條件下保持穩(wěn)定,血清circFOXP1作為NSCLC新的臨床標(biāo)志物具有巨大的潛力?？梢?外周血循環(huán)circRNAs關(guān)于肺癌的診斷價值研究將成為肺癌診斷研究的最理想的新方向。

本次研究通過Meta分析顯示,外周血循環(huán)circRNAs診斷肺癌的合并敏感性、合并特異性、合并SROC曲線下面積均較高,提示外周血循環(huán)circRNAs對肺癌有較高的診斷價值,并且表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)的外周血循環(huán)circRNAs診斷肺癌的SROC曲線下面積相差不大,說明表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)的外周血循環(huán)circRNAs對肺癌的診斷價值相當(dāng)。Meta回歸與亞組分析提示,內(nèi)參基因的選擇是引起非閾值效應(yīng)異質(zhì)性的顯著影響因素,而發(fā)表時間、樣本類型、樣本數(shù)量、病理類型、circRNAs表達(dá)、qRT-PCR試劑公司對本研究結(jié)果異質(zhì)性的影響不顯著;以GAPDH為內(nèi)參基因組研究的外周血循環(huán)circRNAs對肺癌的診斷價值大于以其他基因為內(nèi)參基因組。在臨床檢驗工作中,目前circRNAs的相對表達(dá)量主要通過2-ΔΔCt法進(jìn)行計算,內(nèi)參基因的穩(wěn)定性及其與靶基因擴(kuò)增效率的一致性直接影響了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展與普及,采用絕對定量方法檢測circRNAs在外周血中的表達(dá)情況可能成為液體活檢的發(fā)展趨勢。此外,納入研究的文獻(xiàn)中肺癌患者臨床病理參數(shù)分析結(jié)果顯示,不同的外周血循環(huán)circRNAs差異表達(dá)與肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及預(yù)后等臨床病理參數(shù)相關(guān)。

綜上所述,外周血循環(huán)circRNAs具有較大潛力作為診斷肺癌的候選生物學(xué)標(biāo)志物。但此次研究存在以下局限性:(1)納入研究的文獻(xiàn)數(shù)量較少,而且多數(shù)為小樣本的病例研究,會影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性;(2)納入研究的病例資料不全,沒有根據(jù)患者年齡、性別、肺癌分期等因素進(jìn)行全面的Meta回歸和亞組分析,不能更準(zhǔn)確地探討異質(zhì)性來源和減少異質(zhì)性。今后還需繼續(xù)進(jìn)行大規(guī)模、多中心、前瞻性的高質(zhì)量循證臨床研究進(jìn)一步驗證上述結(jié)果的真實性和可靠性,明確外周血循環(huán)circRNAs作為肺癌診斷標(biāo)志物的臨床價值,以期找到診斷肺癌的最佳外周血循環(huán)circRNAs標(biāo)志物。