何 蕾,段延民,張 寧,齊雯露,賀明星,曹金黨,韓進(jìn)誠(chéng)*

(1. 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453000;2. 商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院,河南 商丘 476000;3. 河南省綠色功能飼料添加劑開發(fā)與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心,河南 商丘 476000;4. 陜西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,陜西 西安 710018;5. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,河南 鄭州450046;6. 河南正本清源科技發(fā)展股份有限公司,河南 商丘 476000;7.山東海能生物工程有限公司,山東 日照 276800)

維生素D作為一種脂溶性維生素,能夠在動(dòng)物體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為高活性的1, 25-二羥維生素D3(25-OH-D3)從而調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)鈣磷代謝。25-OH-D3作為一種新型的維生素D產(chǎn)品,與VD3相比較,具有更高的生物學(xué)活性[1]。瞿紅俠等[2]研究表明以生長(zhǎng)性能和骨骼礦化指標(biāo)評(píng)價(jià),在1～42日齡肉雞日糧中,25-OH-D3生物學(xué)效價(jià)約為維生素D3的1.81倍。與VD3一樣,25-OH-D3也可以提高家禽磷的利用率,降低磷排泄對(duì)環(huán)境的污染[3]。Han等[4]研究表明25-OH-D3在促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)性能和骨骼礦化方面的活性約為維生素D3的2.03倍。

研究發(fā)現(xiàn),25-OH-D3可改善肉雞生長(zhǎng)性能和骨骼發(fā)育,提升健康狀況。梁彥明等[5-6]在飲水中添加25-OH-D3發(fā)現(xiàn)可增加肉雞體增重及采食量,顯著降低料重比。張金龍等[7]發(fā)現(xiàn)飼糧中添加500 IU/kg 25-OH-D3可有效改善肉雞生長(zhǎng)性能及骨骼質(zhì)量。Parkinson和Cransberg[8]研究顯示,25-OH-D3能降低佝僂病的發(fā)病率,改善肉雞軟骨病,增強(qiáng)骨骼硬度。Vazquez等[9]研究表明,飼喂適量添加25-OH-D3的飼糧對(duì)肉雞免疫力有積極的影響,提升了肉雞的抗病能力。

由以上研究可知,25-OH-D3可有效提高家禽的生長(zhǎng)性能、骨骼質(zhì)量及機(jī)體磷含量,但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于25-OH-D3調(diào)控肉雞十二指腸磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究較少。本文旨在探究飼糧中添加一定量25-OH-D3對(duì)十二指腸相關(guān)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.25%的25-OH-D3預(yù)混劑購(gòu)自山東海能生物工程有限公司,25-OH-D3活性為5.0×105IU/g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用140只1日齡體重均勻且正常的羅斯308肉雞,隨機(jī)分為2個(gè)處理組,每處理組5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)14只。共設(shè)計(jì)2種飼糧,分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0、2000 IU/kg 2種水平的25-OH-D3,飼喂粉狀飼料,自由采食,飲水充足,試驗(yàn)期14 d。

1.3 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)根據(jù)NRC(1994)配制玉米-豆粕型飼糧。基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)飼糧在基礎(chǔ)飼糧(鈣1.00%、非植酸磷 0.45%、無額外添加維生素D)中分別添加0、2000 IU/kg的25-OH-D3。

表1 基礎(chǔ)飼糧的組成和營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet (air dry basis)

1.4 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

飼喂試驗(yàn)期間每天記錄肉雞采食量、死亡雞只重量,扣除死亡雞只的采食量,并在第14日齡對(duì)已空腹12 h的肉雞稱重。統(tǒng)計(jì)肉雞采食量和平均日增重,計(jì)算飼料轉(zhuǎn)換率。

1.5 屠宰試驗(yàn)及樣品收集

飼喂試驗(yàn)結(jié)束后,14日齡時(shí),每重復(fù)選擇2只體重相近且已空腹12 h的肉雞稱重后屠宰并取樣。取樣之前,先將手術(shù)剪刀、鑷子等解剖器械清洗干凈,用高壓滅菌鍋滅菌后烘干待用。每只肉雞剪取十二指腸(中間1/2處),用滅菌后的載玻片刮取十二指腸黏膜3份,置于去除RNase的1.5 mL離心管中,標(biāo)記編號(hào),液氮預(yù)冷,放入-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。同時(shí)剝離肉雞脛骨,去除大部分肌肉,放入自封袋中,-20 ℃冷凍保存。

1.6 骨骼指標(biāo)的測(cè)定

將左側(cè)的脛骨放入沸水中煮3～5 min,剝?nèi)ザ嘤嗉∪廛浌?放入105 ℃烘箱中烘30 h。脛骨烘干后測(cè)量相關(guān)指標(biāo)。脛骨重量用分析天平稱量,脛骨長(zhǎng)度和脛骨直徑由游標(biāo)卡尺測(cè)量。測(cè)量后將脛骨壓碎,放入坩堝,放入600 ℃的馬弗爐中灰化36 h,灰化后分別用EDTA滴定法和鉬黃比色法測(cè)定脛骨鈣、磷含量。

1.7 腸道總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增

1.7.1 引物設(shè)計(jì) 選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因,用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列見表2。

表2 PCR引物序列及參數(shù)Table 2 PCR Primer sequences and parameters

1.7.2 RNA提取和cDNA檢測(cè) 將保存于-80 ℃冰箱的樣品取出,通過Trizol法提取樣品總RNA。使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量,質(zhì)量較好的RNA的OD值(OD260/OD280)介于1.8～2.0之間。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)以提取的RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)cDNA濃度,再將cDNA配置為所需濃度并按所需量分裝,置于-80 ℃冰箱保存。

1.7.3 熒光定量PCR 將保存于-80 ℃冰箱的cDNA取出置4 ℃冰箱中融化,用SYBR Green I熒光法以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參基因,用相對(duì)定量2-ΔΔCt法計(jì)算十二指腸磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(mVDR、nVDR和NaPi-IIb)基因表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010整理,再用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件以每重復(fù)為單位,對(duì)得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Tukey法進(jìn)行多重比較分析,P<0.05作為判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。得到的數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 25-OH-D3對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知,飼糧中添加2 000 IU/kg 25-OH-D3顯著增加了1～14日齡羅斯308肉雞體增重,與基礎(chǔ)飼糧組相比提高53%(P<0.05);飼糧中添加2 000 IU/kg 25-OH-D3顯著增加了1～14日齡羅斯308肉雞采食量,與基礎(chǔ)飼糧組相比提高26%(P<0.05);飼糧中添加2 000 IU/kg 25-OH-D3顯著降低了1～14日齡羅斯308肉雞料重比,與基礎(chǔ)飼糧組相比降低了18%(P<0.05)。

表3 25-OH-D3對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響Table 3 Effect of 25-OH-D3 on growth performance of broilers

2.2 25-OH-D3對(duì)肉雞骨骼發(fā)育的影響

由表4可知,飼糧中添加25-OH-D3顯著提高1～14日齡肉雞脛骨重量、長(zhǎng)度、灰分重量、灰分含量、鈣含量和磷含量。與基礎(chǔ)飼糧組相比,添加2 000 IU/kg 25-OH-D3后,脛骨重量提高56%,長(zhǎng)度提高14%,灰分重量提高102%,灰分含量提高33%,鈣含量提高28%,磷含量提高24%(P<0.05),但對(duì)肉雞脛骨直徑無明顯影響(P>0.05)。由此可知,飼糧添加2 000 IU/kg 25-OH-D3可顯著改善1～14日齡羅斯308肉雞脛骨質(zhì)量(P<0.05)。

表4 25-OH-D3對(duì)肉雞脛骨發(fā)育的影響Table 4 Effect of 25-OH-D3 on tibia development of broilers from 1 to 14 days of age

2.3 25-OH-D3對(duì)肉雞十二指腸磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的影響

由圖1～3可知,與基礎(chǔ)飼糧組相比,添加2 000 IU/kg 25-OH-D3后,nVDR mRNA表達(dá)量提高111%,mVDR mRNA表達(dá)量提高109%,NaPi-IIbmRNA表達(dá)量提高146%。由此可知,添加2000 IU/kg 25-OH-D3顯著增加1～14日齡肉雞十二指腸磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白nVDR、mVDR和NaPi-IIb mRNA表達(dá)量(P<0.05)。

圖1 25-OH-D3對(duì)nVDR mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effects of 25-OH-D3 on nVDR mRNA expression

圖2 25-OH-D3對(duì)mVDR mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effects of 25-OH-D3 on mVDR mRNA expression

圖3 25-OH-D3對(duì)NaPi-IIb mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of 25-OH-D3 on NaPi-IIb mRNA expression

3 討 論

3.1 25-OH-D3對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)中,飼糧中添加2000 IU/kg 25-OH-D3顯著增加了1～14日齡肉雞體增重、采食量,降低了料重比。葉慧等[10]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加25-OH-D3能夠有效代替維生素D3,25-OH-D3對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能有一定的改善趨勢(shì)。張金龍[7]、陳冠華等[11]研究發(fā)現(xiàn)飼糧添加25-OH-D3可提高肉雞體增重、采食量,降低料重比,改善肉雞生長(zhǎng)性能。

3.2 25-OH-D3對(duì)肉雞脛骨發(fā)育的影響

本試驗(yàn)中,飼糧中添加2000 IU/kg 25-OH-D3顯著增加1～14日齡肉雞脛骨的重量、長(zhǎng)度、灰分重量、灰分含量、鈣含量和磷含量。張霞等[12]研究發(fā)現(xiàn),3 200 IU/kg的25-OH-D3提高了42日齡蛋雛雞脛骨磷含量。邱凌云[13]研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加25-OH-D3能夠增加骨骼形態(tài)、骨骼強(qiáng)度,增強(qiáng)骨吸收作用。楊德智等[14]研究發(fā)現(xiàn),添加2 760 IU/kg 25-OH-D3可提高脛骨灰分含量,改善骨骼質(zhì)量。葉慧[10]、陳冠華[11]也得出了相似的研究結(jié)果。

3.3 25-OH-D3對(duì)肉雞十二指腸磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼糧中添加2000 IU/kg 25-OH-D3可顯著提高1～14日齡肉雞十二指腸nVDR、mVDR和NaPi-IIb mRNA表達(dá)量。劉亞楠等[15]研究表明,維生素D3與鴨油甘油二酯協(xié)同作用可顯著上調(diào)肥胖大鼠的肝臟nVDR基因表達(dá)量。汪智云[16]研究發(fā)現(xiàn),添加800 IU/kg 25-OH-D3顯著提高蛋雞十二指腸CaBP-D28k、nVDR表達(dá)量。

4 結(jié) 論

飼糧中添加2000 IU/kg 25-OH-D3顯著改善1～14日齡羅斯308肉雞的生長(zhǎng)性能,改善骨骼質(zhì)量,促進(jìn)骨骼發(fā)育,且能夠上調(diào)1～14日齡肉雞十二指腸磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白nVDR、mVDR和NaPi-IIb 的mRNA的表達(dá)水平。