劉英玉,鄭曉琴,李瑞鵬,朱明月,胥 蘭,邵 偉,鄭曉風(fēng),蘇戰(zhàn)強(qiáng)*,姚 剛

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

犢牛腹瀉可造成大批的犢牛死亡,給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)估計(jì),在犢牛的早期死亡病因中,斷奶前犢牛急性腹瀉占75%左右,成為奶牛高死亡率和發(fā)病率的原因之一[1-2],有報(bào)道由沙門(mén)氏菌引起的犢牛腹瀉約占犢牛腹瀉病的10%～12%[3]。沙門(mén)氏菌感染可能發(fā)生在牛的任何年齡段,但在2周齡到3個(gè)月齡犢牛引起嚴(yán)重的臨床癥狀[4-5]。引起犢牛腹瀉的原因較復(fù)雜且病原眾多,有細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等,且不同類(lèi)型的病原之間又存在不同程度的混合感染,從而導(dǎo)致對(duì)該病的防控難度增加。近年來(lái),犢牛腹瀉的發(fā)病率和病原菌的耐藥程度也逐年上升[6],明確引起犢牛腹瀉的病因及病原的耐藥情況對(duì)犢牛腹瀉的治療及防控具有一定的指導(dǎo)意義。冬季犢牛腹瀉的發(fā)生多是條件性致病菌引起,因此對(duì)新疆某規(guī)模化奶牛場(chǎng)腹瀉犢牛糞便進(jìn)行病原菌的分離鑒定和藥敏性的檢測(cè),為探究犢牛腹瀉病原菌的流行狀況和篩選出有效防治該場(chǎng)犢牛腹瀉病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

用滅菌棉棒采集新疆某奶牛場(chǎng)腹瀉犢牛的糞樣,共采集腹瀉樣本49份,裝于滅菌的離心管中,低溫帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑與儀器

緩沖蛋白胨水(buffered peptone water, BPW),木糖賴(lài)氨酸脫氧膽鹽瓊脂(xylose lysine desoxycholate, XLD)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(tatrathionate broth, TTB)均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;革蘭氏陰性藥敏試紙購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;生化鑒定試劑盒購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。TAE購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛有限公司;Taq MasterMix、DNA Marker、T載體、DH5α購(gòu)自Takara生物公司。

1.3 菌株

大腸桿菌質(zhì)控菌ATCC25922購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.4 病原菌的分離鑒定

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)(GB 4789.4-2016),分別取腹瀉樣本1 mL加入到9 mL的BPW中,置于37 ℃恒溫?fù)u床中以180～200 rpm增菌18～24 h。取BPW中的菌液1 mL至TTB增菌液中,置于37 ℃恒溫?fù)u床中以180～200 rpm再增菌18～24 h。后將增菌液分別劃線接種至XLD瓊脂上,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取XLD上帶黑心的菌落穿刺至三糖鐵瓊脂中,再接種至賴(lài)氨酸脫羧酶肉湯、氰化鉀、尿素酶、蛋白胨水中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h,必要時(shí)延長(zhǎng)至48 h。結(jié)果按照生化試劑盒中的顏色進(jìn)行判斷。

1.5 DNA模板制備

根據(jù)生化鑒定的結(jié)果挑取單菌落于1 000 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯中,放入37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)18～24 h。使用煮沸法提取DNA模板[7],取700 μL的菌液加入1.5 mL EP管中,12 000 rpm離心10 min,棄上清,再加入50 μL滅菌ddH2O吹吸混勻,100 ℃水浴10 min后,置于冰上10 min,12 000 rpm離心5 min,取上清保存于-20 ℃冰箱備用。

1.6 病原菌16S rRNA的擴(kuò)增

16S rRNA引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列是16S-F AGAGTTTGATCCTGG CTCAG和16S-R GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR反應(yīng)體系(25 μL):2 Taq Master Mix 10 μL;上下游引物各0.5 μL,模板1 μL,dd H2O 13 μL。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 5 min;變性溫度94 ℃ 30 s,退火溫度54 ℃ 45 s,延伸溫度72 ℃ 5 min,循環(huán)數(shù)為35。4 ℃保存產(chǎn)物。

1.7 PCR產(chǎn)物的鑒定和測(cè)序

將PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用1%瓊脂糖進(jìn)行電泳,用凝膠成像系統(tǒng)判定PCR產(chǎn)物檢測(cè)的結(jié)果。將PCR的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后連接到PMD18-T載體上,轉(zhuǎn)入DH5α,操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。經(jīng)PCR鑒定正確后提取重組質(zhì)粒DNA模板20 L送至上海生工測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)和Lasergene軟件的MegAlign制作進(jìn)化樹(shù)。

1.8 藥物敏感性試驗(yàn)

按照美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的手冊(cè)[8]的Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法對(duì)分離的菌株進(jìn)行6大類(lèi)17種藥物耐藥性檢測(cè)。青霉素類(lèi)(氨芐西林,哌拉西林);頭孢菌素類(lèi)(頭孢呋辛、頭孢西叮、頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟);β-內(nèi)酰胺類(lèi)(氨曲南);氨基糖苷類(lèi)(鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素);喹諾酮類(lèi)(氧氟沙星);大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(麥迪霉素)。用大腸桿菌ATCC 25922作質(zhì)控菌株,判定標(biāo)準(zhǔn)按美國(guó)NCCLS操作標(biāo)準(zhǔn)。藥敏結(jié)果用Excel 2013軟件進(jìn)行分析。

1.9 動(dòng)物試驗(yàn)

購(gòu)買(mǎi)新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心昆明小白鼠(25±3)g,準(zhǔn)備過(guò)夜培養(yǎng)的菌液(108CFU/mL)進(jìn)行灌胃,通過(guò)動(dòng)物存活情況觀察菌株對(duì)小白鼠的致病性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離鑒定結(jié)果

通過(guò)增菌后在選擇性培養(yǎng)基XLD表面有8株帶黑心的典型菌落,檢出率為16.32%。8株病原菌生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。三糖鐵斜面穿刺后有8株菌株均能產(chǎn)H2S氣體,6株菌株靛基質(zhì)陰性,2株靛基質(zhì)陽(yáng)性;8株菌株賴(lài)氨酸脫羧酶均呈陽(yáng)性,8株菌株在氰化鉀中均不生長(zhǎng);8株菌株中有1株不分解尿素,其余均能分解尿素。按照食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)(GB 4789.4-2016)判定7株為個(gè)別變體,1株為沙門(mén)菌屬。

表1 病原菌生化鑒定結(jié)果Table 1 Results of biochemical identification of some pathogenic bacteria

2.2 病原菌16S rRNA的測(cè)序結(jié)果

將8株病原菌的16S rRNA的測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì),生化鑒定為沙門(mén)菌屬的H186菌株與都柏林沙門(mén)菌(Salmonella enterica Dublin)的同源性最高達(dá)到100%,與副傷寒沙門(mén)菌(Salmonella enterica Typhimurium)和印第安納沙門(mén)菌(Salmonella enterica Indiana)的親緣關(guān)系接近,為99.9%,結(jié)果如圖1所示。生化鑒定為個(gè)別變體的7株病原菌,其中一株菌H170與陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)的同源性達(dá)到99.9%,與霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)的同源性達(dá)到99.7%,其余六株菌H176、H157、H179、H150、H145、H147與奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)的同源性達(dá)到100%。8株菌株的進(jìn)化關(guān)系如圖1所示。

圖1 8株菌株16S rRNA的進(jìn)化分析Fig.1 16S rRNA evolution analysis of 8 strains

2.3 病原菌的耐藥性結(jié)果

對(duì)分離鑒定的8株病原菌進(jìn)行5大類(lèi)17種抗生素檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示都柏林沙門(mén)菌H186只對(duì)麥迪霉素耐藥,僅對(duì)鏈霉素和頭孢噻肟中介,對(duì)其他藥物均敏感(見(jiàn)表2)。陰溝腸桿菌H170耐藥數(shù)量達(dá)到了8種,分別是氨芐西林、哌拉西林、頭孢呋辛、頭孢哌酮、鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素、麥迪霉素;對(duì)頭孢噻吩、頭孢曲松、頭孢噻肟等抗生素是中介;其余六株奇異變形桿菌(H176、H157、H179、H150、H145、H147)對(duì)麥迪霉素和頭孢呋辛的耐藥率為100%、對(duì)氨芐西林和頭孢哌酮的耐藥率為66.67%)、對(duì)哌拉西林的耐藥率為50%、對(duì)頭孢唑林、頭孢噻肟、鏈霉素、妥布霉素的耐藥率為33.33%、對(duì)頭孢噻吩、頭孢曲松、卡那霉素的耐藥率為16.67%;對(duì)頭孢他啶、頭孢西叮、氧氟沙星是不耐藥的。耐藥數(shù)量結(jié)果顯示,除了都柏林沙門(mén)菌H186是耐一種抗菌藥外,陰溝腸桿菌H170和奇異變形桿菌(H176、H157、H179、H150、H145、H147)的耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,最多可耐12種抗菌藥,最少的也是耐3種抗菌藥物。

表2 菌株的耐藥情況Table 2 Drug resistance of strains

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

選取陰溝腸桿菌H170和奇異變形桿菌H150、都柏林沙門(mén)菌H186進(jìn)行小白鼠致病性試驗(yàn),灌胃前12 h禁食禁水,分別給昆明小白鼠灌胃1.5 mL 108CFU/mL的菌液,灌胃后4 h給予鼠糧和飲水,都柏林沙門(mén)菌H186在1 d后出現(xiàn)死亡,奇異變形桿菌H150在2～3 d出現(xiàn)死亡,陰溝腸桿菌H170觀察7 d沒(méi)有出現(xiàn)死亡。

3 討 論

犢牛腹瀉病為制約犢牛生長(zhǎng)繁殖的重要疾病之一。王勝義[9]報(bào)道西北地區(qū)犢牛腹瀉病的病原主要是細(xì)菌,該奶牛場(chǎng)犢牛發(fā)生腹瀉后按照細(xì)菌的分離鑒定,最后通過(guò)16S rRNAc測(cè)序確定該場(chǎng)犢牛腹瀉樣品中存在都柏林沙門(mén)菌和奇異變形桿菌。李海梅等[10]報(bào)道,青海西寧某牛場(chǎng)中由沙門(mén)菌引起的腹瀉犢牛22%。王繼軍等[11]報(bào)道,新疆庫(kù)爾勒地區(qū)某牛場(chǎng)爆發(fā)犢牛腹瀉經(jīng)診斷為沙門(mén)菌感染。沙門(mén)氏菌是引起犢牛腹瀉的一種重要的病原菌之一,在本試驗(yàn)中分離出1株都柏林沙門(mén)氏菌,都柏林沙門(mén)氏菌是一種適應(yīng)宿主的血清變種,通常感染牛。因此根據(jù)分離結(jié)果在治療過(guò)程中不能忽視。本次檢測(cè)結(jié)果病原菌存在較多的奇異變形桿菌,目前奇異變形桿菌的流行趨勢(shì)不斷擴(kuò)大,奶牛、豬、雞、孔雀、貂、狐貍等家畜和特種動(dòng)物感染奇異變形桿菌的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮,已成為導(dǎo)致人和動(dòng)物感染的重要條件致病菌,該病的發(fā)病趨勢(shì)應(yīng)引起獸醫(yī)界重視[6]。奇異變形桿菌屬于腸桿菌科變形桿菌屬,為無(wú)莢膜、無(wú)芽孢的革蘭氏陰性桿菌,該細(xì)菌在自然界分布較廣,可存在于糞便、污水、土壤當(dāng)中[12]。本試驗(yàn)從其母源糞便中沒(méi)有檢測(cè)出病原菌,所以推斷不是垂直傳播感染,提示該場(chǎng)中引發(fā)的犢牛腹瀉可能由外界環(huán)境中帶來(lái)。

沙門(mén)氏菌感染表現(xiàn)出臨床癥狀的牛更易產(chǎn)生多重耐藥的菌株[13],McEvoy等[14]分離的沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林、氯霉素、鏈霉素有耐藥性,其中都柏林沙門(mén)菌對(duì)所有抗生素敏感。本次檢測(cè)結(jié)果顯示,都柏林沙門(mén)氏菌只對(duì)麥迪霉素耐藥,對(duì)鏈霉素以及頭孢噻肟中度敏感,對(duì)其余的抗生素呈現(xiàn)高度敏感。本次檢測(cè)結(jié)果與相關(guān)報(bào)道相似,造成差異的原因可能與不同血清型的沙門(mén)氏菌對(duì)這些抗生素的敏感程度不同。而分離鑒定的奇異變形桿菌和糞腸球菌幾乎都對(duì)氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢哌酮、鏈霉素、妥布霉素、麥迪霉素、哌拉西林顯示出耐藥性且呈現(xiàn)嚴(yán)重的多重耐藥的情況。因此,考慮到抗生素是防治人和動(dòng)物細(xì)菌性疾病最重要的治療工具,在避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性以確保治療效果的前提下應(yīng)謹(jǐn)慎使用抗菌藥物是非常必要的。

4 結(jié) 論

從49份犢牛腹瀉樣本檢測(cè)出8株病原菌,檢出率為16.32%。經(jīng)16S rRNA測(cè)序比對(duì)有1株都柏林沙門(mén)菌、1株陰溝腸桿菌、6株為奇異變形桿菌。病原菌具有不同程度的耐藥?；旌细腥臼且馉倥８篂a的病因。