邱青璐,王 鑠,王亞男,張召興,,崔海明,張艷英

(1. 河北旅游職業(yè)學(xué)院,河北 承德 067000;2. 承德市農(nóng)林科學(xué)院,河北 承德 067000;3. 河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室,河北 秦皇島 066604)

沙門氏菌是一種危害人類健康的食源性致病菌,該菌通過污染肉、蛋、奶等食物和水源等途徑感染[1]。沙門氏菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜,目前具有2500多個血清型,在不同的宿主、地區(qū)及養(yǎng)殖場中流行不同的血清型,且不同血清型之間的菌株無交叉保護性[2]。伴隨著臨床中抗生素的不合理的使用,沙門氏菌耐藥性問題已經(jīng)很普遍,耐藥菌株廣泛存在給該病治療與防控帶來一定困難,同時沙門氏菌的耐藥性可通過食物(肉、蛋、奶、蔬菜等)傳播給人,潛在威脅著人類健康[3]。近幾年,關(guān)于豬肉、雞肉在屠宰加工及銷售環(huán)節(jié)中沙門氏菌污染報道的越來越多。因此,對豬屠宰加工環(huán)節(jié)及銷售環(huán)節(jié)中的沙門菌檢測具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2021-2022年采集河北承德地區(qū)豬屠宰場加工廠及零售樣品374份,其中生豬屠宰加工廠(刀具、容器、胴體、沖洗水等)159份,零售店鋪及超市(案板、刀具、冰箱容器等)215份。

1.2 主要試劑

蛋白胨水、SS培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色鑒定培養(yǎng)基、沙門氏菌增菌液(TTB),均購自北京劍橋生物科技有限公司;臨床中常用的抗生素的藥敏紙片、API20E試劑盒,購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司;細(xì)菌基因組DNA試劑盒、2×Taq Master Mix、 DL 2000 Maker,均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;沙門氏菌屬血清鑒定試劑盒,購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.3 試驗動物

昆明系雄性小鼠960只(體重22～25 g),購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院實訓(xùn)牧場。

1.4 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

對采集豬屠宰場加工廠及零售樣品經(jīng)蛋白胨水處理后,接種于TTB中37 ℃震蕩培養(yǎng)12～18 h,取培養(yǎng)物無菌接種于SS培養(yǎng)基進行鑒別培養(yǎng),37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后,挑取單個菌落接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12～18 h,再挑取單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯純化培養(yǎng),經(jīng)鏡檢和形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 細(xì)菌生化鑒定

參照API20E試劑盒說明書,將分離菌株在無菌的條件接種于API20E試劑中,無菌條件下37 ℃培養(yǎng)12～18 h進行生化鑒定,并根據(jù)細(xì)菌編碼表進行生化試驗結(jié)果判讀。

1.6 細(xì)菌PCR鑒定

參考文獻[4]的方法,合成沙門氏菌保守區(qū)鑒定引物序列,引物invA為F1:5'-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3',F2:5'-AGACGACTGGTACTGATCGATAAT-3'。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,目的基因片段大小為241 bp,以提取分離菌株的基因組DNA為模板進行PCR鑒定,回收陽性的菌株的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株進行同源性比對。

1.7 致病性試驗

參考文獻[5]的方法,將分離菌株接種于營養(yǎng)肉湯中對數(shù)期并進行計數(shù),調(diào)整菌液濃度為108CFU/mL,每株分離菌株腹腔注射5只昆明系小鼠,劑量為0.20 mL,對照組給予等量的無菌生理鹽水。試驗期為6 d,并觀察小鼠發(fā)病情況。

1.8 血清型鑒定

按沙門氏菌屬血清鑒定試劑盒說明書,用Kauffmann-White法對分離的沙門氏菌進行血清型鑒定。

1.9 藥敏試驗

試驗結(jié)果判斷參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2013年推薦的藥敏試驗法標(biāo)準(zhǔn)。取分離菌菌液(108CFU/mL)100 μL菌液在無菌的條件下均勻涂布在90 mm普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基并貼上藥敏紙片, 37 ℃培養(yǎng)12～18 h后測定抑菌圈直徑,取平均值。

1.10 耐藥基因的檢測

參考文獻[6-7]的方法,合成沙門氏菌的耐藥基因,主要包括β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(tem、cmy、shv) 3種,磺胺類耐藥基因(Sul1、Sul2、Sul3)3種,氨基糖苷類耐藥基因(aac(3)-Ⅰv、aac(6')-Ⅰb)2種,喹諾酮類耐藥基因(gyrA、gyrB、qurS)3種,四環(huán)素類(TetA、TetM、TetR)3種,酰胺醇類耐藥基因 (floR)1種,多肽類(mcr-1)1種等7類抗生素16種耐藥基因。以1.5提取的基因組DNA為模板用PCR方法進行耐藥基因檢測。并分析耐藥性與耐藥基因之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定

疑似沙門氏菌的菌株在SS培養(yǎng)基種長出邊緣整齊、透明無色且中間帶黑心的單個菌落;在沙門菌顯色培養(yǎng)基上大小一致的藍紫色菌落,染色鏡檢可見無莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌。其培養(yǎng)特性與形態(tài)學(xué)與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》報道的沙門氏菌培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)及基本一致。參照API20E試劑盒說明書,對分離的疑似沙門菌菌株進行生化試驗,191株分離菌株初步鑒定為沙門氏菌。

2.2 細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果

用沙門氏菌鑒定引物invA對通過對初步鑒定的191株沙門菌,用PCR方法進一步鑒定,結(jié)果顯示,191株沙門菌均擴增出大約為241 bp目的條帶(見圖1),經(jīng)過測序分離的191株沙門菌測序結(jié)果與GenBank中登錄的沙門氏菌參考株同源性在97.0%及其以上。根據(jù)判定結(jié)果分離菌株鑒定為沙門氏菌,分離率為51.1%(191/374)。

2.3 致病性試驗

攻毒組小鼠在攻毒后2～3 d出現(xiàn)了精神沉郁、采食量減少等不同的發(fā)病情況,攻毒組的個別小鼠不表現(xiàn)任何癥狀出現(xiàn)急性死亡。剖檢可見死亡的小鼠的腸道水腫、出血實質(zhì)性器官出現(xiàn)不同程度出血。從死亡的小鼠體內(nèi)分離得到沙門氏菌,對照組小鼠健康存活。本試驗中,引起小鼠發(fā)病死亡的菌株有127株沙門菌,攻毒組小鼠的死亡率在40%～100%,表明引起小鼠發(fā)病死亡的127株沙門氏菌為致病性沙門氏菌。

2.4 細(xì)菌血清型鑒定

由表1可知,127株沙門氏菌中有13種血清型,其中以豬霍亂沙門氏菌(26.0%)、鼠傷寒沙門氏菌(20.5%)、倫敦沙門氏菌(17.3%)為該地區(qū)豬肉加工及零售環(huán)節(jié)中沙門氏菌流行優(yōu)勢血清型。

表1 127株沙門氏菌分離菌株的血清型檢測結(jié)果Table 1 Serotype identification results of 127 Salmonella isolates

2.5 耐藥性檢測結(jié)果

由表2可見,分離的127株株致病性沙門氏菌對臨床中常用的藥物產(chǎn)生不同的耐藥性,其中對氨芐西林、阿莫西林、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺噁唑啉、磺胺間甲氧嘧啶、慶大霉素、土霉素、新霉素8種藥物耐藥率在56.7%～95.3%之間,對頭孢噻呋、大觀霉素、強力霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、多粘菌素、氟苯尼考8種藥物耐藥率在5.5%～35.5%之間。由表3可知,分離的127株致病性沙門呈現(xiàn)多重耐藥性,分離的菌株至少耐6種藥物,以耐10(13.4%)、9(19.9%)、8(14.2%)種藥物的分離菌株最多。

表2 耐藥性檢測結(jié)果(n=127)Table 2 Drug resistance test results(n=127)

表3 多重耐藥性分析結(jié)果Table 3 Analysis results of multidrug resistance

2.6 耐藥基因檢測結(jié)果

由表4可知,127株致病性沙門氏菌攜帶不同的耐藥基因,其中耐藥基因Sul1、Sul2、Sul3、TetA、TetM、TetR、aac(3)-Ⅰv、aac(6')-Ⅰb檢出率在32.3%～89.8%之間;耐藥基因tem、cmy、shv、gyrA、gyrB、qurS、floR、mcr-1、檢出率4.7%～17.3%。由表5可知,β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類4類藥物的耐藥表型與耐藥基因型的符合率為100%,其他類藥物的耐藥表型與耐藥基因型符合率在84.6%～94.4%。

表4 耐藥基因檢測結(jié)果Table 4 Results of drug resistance gene detection

表5 分離菌耐藥表型與耐藥基因相關(guān)性的分析結(jié)果Table 5 Correlation analysis between drug resistance phenotype and drug resistance gene of isolates

3 討 論

沙門氏菌是臨床中重要的食源性致病菌之一,該菌廣泛存在環(huán)境中,通過環(huán)境(屠宰、加工廠、零售等)在肉品生產(chǎn)鏈中進行相互傳播,造成豬肉及其制品的污染[8]。豬肉是我國人們?nèi)忸愂称返闹匾獊碓粗?生豬的屠宰是生豬養(yǎng)殖和豬肉品加工過程中必不可少主要的中間環(huán)節(jié),對生豬屠宰加工及零售環(huán)節(jié)中病原微生物的安全監(jiān)管是保證豬肉及制品品質(zhì)量安全重要防線,對保障豬肉及制品具有重要的意義[9]。相關(guān)研究表明,國內(nèi)外關(guān)于食品沙門氏菌污染的食物引起人們食物中毒事件越來越多,食物中毒以使用受污染的肉類(豬肉和雞肉)和蛋制品為常見[10]。因此,對生豬屠宰加工及零售環(huán)節(jié)中進行沙門氏菌污染監(jiān)測具有重要的意義。本研究從采集的357份病料樣品中分離到191株沙門氏菌,分離率為51.1%,其中127株為能引起小鼠死亡為致病性沙門菌,說明該地區(qū)豬屠宰加工及零售環(huán)節(jié)中沙門氏菌污染嚴(yán)重,應(yīng)該引起重視,加強屠宰加工及零售環(huán)節(jié)中安全監(jiān)管,減少沙門氏菌對豬肉的污染。

沙門氏菌是具有多種致病性的血清型,且具有地區(qū)差異性,不同地區(qū)的沙門氏菌血清型流行不同,許多血清型可以感染人,其中鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌是感染人沙門氏菌主要的血清類型[11]。本研究表明,127株沙門菌中有13種血清型,其中以豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、倫敦沙門氏菌為流行優(yōu)勢血清型。說明該地區(qū)豬肉食品加工、銷售環(huán)節(jié)中沙門氏菌血清型呈現(xiàn)多樣化流行。本次檢測的鼠傷寒沙門氏菌占的比例較大,可能對人們存在潛在的威脅,引起注意。與賀恒旭等[9]、黃邵軍等[8]報道豬肉屠宰加工及零售環(huán)節(jié)中存在有差異性,可能與地區(qū)與豬肉屠宰加工生產(chǎn)中管理有關(guān)。

隨著臨床中不同種類的抗生素在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中的廣泛應(yīng)用,導(dǎo)致出現(xiàn)較強的耐藥性,其耐藥性越來越嚴(yán)重,從而導(dǎo)致豬肉及制品中藥物殘留問題和細(xì)菌耐藥問題愈發(fā)嚴(yán)重,沙門氏菌的耐藥性問題已經(jīng)很普遍[12]。國內(nèi)許多相關(guān)研究表明,豬、雞肉及制品屠宰加工及零售環(huán)節(jié)中分離的沙門氏菌產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性[13]。本研究中,127株沙門氏菌對阿莫西林、氨芐西林、磺胺二甲氧嘧啶等8種藥物耐藥率在56.7%以上,分離的菌株至少耐6種藥物,呈現(xiàn)多重耐藥性,說明該地區(qū)豬肉食品屠宰加工及銷售環(huán)節(jié)中沙門氏菌耐藥性嚴(yán)重。與靳浩展[14]、賀恒旭等[9]、黃邵軍等[8]報道一致。耐藥基因是一種對抗生素有抵抗作用的蛋白質(zhì)物質(zhì),細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生與攜帶的耐藥基因具有相關(guān)性,耐藥基因可通過多種途徑(質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子)菌株、環(huán)境、食物、動物及人之間傳播,不僅導(dǎo)致其耐藥性產(chǎn)生還威脅人們健康[3-4]。本試驗研究表明,127株沙門氏菌攜帶多種耐藥基因,經(jīng)分析127株沙門氏菌的耐藥表型與耐藥基因之間基本呈正相關(guān),其符合率在84.6%～100%之間?？赡芊蛛x菌株所產(chǎn)生的的耐藥性攜帶耐藥基因相關(guān),其作用機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究表明,2021-2022年承德地區(qū)豬屠宰場加工廠及零售374份樣品中致病性沙門氏菌株127株,能引起小鼠死亡;致病性沙門氏菌具有多種血清型,呈現(xiàn)多重耐藥,攜帶多種耐藥基因。