華 瑋, 熊麗娜 , 張永鑫, 孫 鵬, 岳 龍*, 付鴻博*

(1.紅河學(xué)院·生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院·云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 蒙自 661199;2.白城市林業(yè)科學(xué)研究院,吉林 白城 137000;3.汕頭市林業(yè)科學(xué)研究所,廣東 汕頭 515000)

近年來,隨著人們生活質(zhì)量的提高,人們的消費(fèi)觀念逐漸開始向追求更高的生活質(zhì)量轉(zhuǎn)變,水果在人們的眼里有著越來越重要的價(jià)值,果樹的生產(chǎn)也慢慢由追求產(chǎn)量轉(zhuǎn)向了追求質(zhì)量,果實(shí)品質(zhì)在逐漸受到人們重視的同時(shí)[1],其富含的對人體有益的功能性物質(zhì)也逐漸受關(guān)注,因此食用水果也在從口腹之欲逐步擴(kuò)展到向吃的更健康轉(zhuǎn)變,果實(shí)具有的營養(yǎng)價(jià)值、抗氧化能力等都開始走進(jìn)了人們的視野[2]。多酚類化合物是廣泛存在于植物體內(nèi)的重要的次生代謝產(chǎn)物[3]。目前自然界已知曉的酚類化合物超過8 000種[4]。多酚在降低血糖、血脂、保護(hù)腸道、抑制細(xì)菌有著其獨(dú)特的作用。同時(shí)多酚類化合物在醫(yī)藥、食品、運(yùn)輸保鮮、化妝品等應(yīng)用及其相關(guān)領(lǐng)域的運(yùn)用發(fā)揮著巨大的作用[5]。

草莓是薔薇科草莓屬的多年生草本植物,果實(shí)色澤鮮艷,有著獨(dú)特的果實(shí)香味[6]。草莓果實(shí)富含多酚等生物活性物質(zhì),其含量多少與抗氧化能力密切相關(guān)[7]。不同品種的草莓在多酚含量上也有著顯著的差異[8]。本研究對草莓多酚提取工藝、多酚含量及抗氧化性進(jìn)行了研究,對豐富草莓果實(shí)多酚的研究內(nèi)容、草莓功能性品種的選育、產(chǎn)品的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 單因素對草莓多酚含量的影響

以紅顏草莓成熟期果實(shí)為試驗(yàn)材料,用液氮將果實(shí)研磨成粉末,用0.1%酸化甲醇作提取液,利用超聲輔助法進(jìn)行提取。對甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間和提取次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)且每個(gè)因素均設(shè)置5個(gè)水平,甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%*、50%、60%和70%;超聲時(shí)間分別為10、15、20*、25、30 min;料液比分別為1∶8、1∶9、1∶10*、1∶11、1∶12(g∶mL);提取次數(shù)分別為1次、2次*、3次、4次和5次。當(dāng)其中一個(gè)因素為變量時(shí),*標(biāo)記的因素保持恒定水平試驗(yàn)。

1.2 最佳工藝參數(shù)的確定

以1.1單因素對草莓多酚含量的影響結(jié)果為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)四因素三水平正交組合(見表1)[9],對提取方法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,從而確定最佳的工藝參數(shù)[10]。

表1 正交試驗(yàn)組合表

1.3 多酚含量的測定

采用福林酚比色法[11]進(jìn)行測定,以標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體試驗(yàn)操作如下:先吸取一定體積的提取液于試管中,添加福林酚試劑0.2 mL,混勻后靜置4 min,再加入10% Na2CO3溶液1 mL,最后用ddH2O定容至8 mL,將定容后的混合物置于35 ℃下水浴1 h,在760 nm的波長下對其進(jìn)行吸光值的測定。

1.4 抗氧化能力的測定

以清除DPPH自由基能力,亞鐵還原能力和清除ABTS自由基能力3個(gè)指標(biāo)評價(jià)草莓果實(shí)抗氧化能力[11]。

DPPH法測定抗氧化能力[12]。樣品組:吸取0.2 mL樣品稀釋液,加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2.8 mL,室溫避光反應(yīng)30 min;空白組:用40%甲醇替代樣品稀釋液。于517 nm 波長下測定吸光值,蒸餾水調(diào)零。

FRAP法測定抗氧化能力[13]。樣品組:吸取0.1 mL樣品稀釋液,加入4.9 mL FRAP溶液[0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH=3.6)∶10 mmol/L TPTZ:20 mmol/L三氯化鐵=10∶1∶1(V/V/V)] ,室溫避光反應(yīng)10 min;空白組:用40%甲醇替代樣品稀釋液。于593 nm 波長下測定吸光值。

ABTS法測定抗氧化能力[14]。樣品組:吸取0.1 mL樣品稀釋液,加入3.9 mL ABTS+溶液(7 mmol/L的ABTS儲備液和140 mmol/L的過硫酸鉀溶液在室溫下暗反應(yīng)12～16 h配制而成),室溫避光反應(yīng)10 min;空白組:用40%甲醇替代樣品稀釋液。于734 nm 波長下測定吸光值,蒸餾水調(diào)零。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Excel 2007、SPSS 25、SAS 9.2、OriginPro 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓多酚提取單因素試驗(yàn)

隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大多酚含量表現(xiàn)為先升高后降低。甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%對應(yīng)的多酚含量達(dá)到大值(見圖1)。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%時(shí),草莓提取的多酚含量顯著(P<0.05)低于甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)草莓提取的多酚含量。由圖2可知,隨著料液比的增大,草莓多酚含量呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。當(dāng)料液比為1∶9時(shí)對應(yīng)的草莓達(dá)到最大值,當(dāng)料液比為1∶8、1∶11、1∶12時(shí),草莓提取的多酚含量顯著(P<0.05)低于料液比為1∶9時(shí)對應(yīng)的草莓多酚含量。再繼續(xù)增加料液比會導(dǎo)致其他雜質(zhì)增多,而導(dǎo)致提取草莓多酚的含量下降。由圖3可知,隨著超聲時(shí)間的延長,草莓提取的多酚含量呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí),對應(yīng)的草莓提取的多酚含量達(dá)到最大值。超聲時(shí)間的長短對草莓提取的多酚含量的影響無顯著性差異。由圖4可知,隨著提取次數(shù)的增大,草莓提取的多酚含量呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí),對應(yīng)的多酚含量達(dá)到最大值,當(dāng)提取次數(shù)為1、4、5次時(shí),草莓提取的多酚含量顯著低于提取次數(shù)為2、3次的草莓果實(shí)提取的多酚含量。

圖1 不同濃度甲醇對草莓多酚含量的影響

圖2 料液比對草莓多酚含量的影響

圖3 超聲提取時(shí)間對草莓多酚含量的影響

圖4 超聲次數(shù)對草莓多酚含量的影響

2.2 草莓果實(shí)多酚提取條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采取4因素3水平正交試驗(yàn)L9(34)對草莓多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過正交試驗(yàn)結(jié)果(見表2)可以發(fā)現(xiàn)RD>RA>RB>RC,故影響草莓果實(shí)多酚含量的因素從高到低依次是提取次數(shù)>甲醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>超聲時(shí)間,同時(shí)可以看出其最佳提取工藝條件為A3B2C2D3,即甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%,料液比為1∶9,超聲時(shí)間為15 min,提取次數(shù)為3次,由于A3B2C2D3在正交試驗(yàn)中沒有出現(xiàn),故根據(jù)此提取方法進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn),在該提取條件下測得的草莓果實(shí)多酚含量為2.01 mg/g,高于以上9組試驗(yàn)。因此確定最優(yōu)的提取條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%,料液比為1∶9,超聲時(shí)間為15 min,提取次數(shù)為3次。將正交數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后發(fā)現(xiàn)(見表3):因素C(超聲時(shí)間)對多酚提取量的影響呈顯著水平(P<0.05),因素A(甲醇體積分?jǐn)?shù))、B(料液比)和D(提取次數(shù))對多酚提取量的影響呈極顯著水平(P<0.01)。

表2 草莓多酚提取工藝正交結(jié)果分析

表3 正交結(jié)果方差分析

2.3 紅顏草莓果實(shí)多酚及抗氧化性的動態(tài)變化

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳工藝參數(shù),對紅顏草莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的多酚含量進(jìn)行測定(見圖5)。結(jié)果表明:多酚含量在草莓果實(shí)發(fā)育的3個(gè)時(shí)期均存在顯著性差異(P<0.05),且隨果實(shí)發(fā)育表現(xiàn)為先降低再升高的趨勢,多酚含量在轉(zhuǎn)色期最低,在成熟期最高。為了探究草莓的抗氧化能力,對紅顏草莓果實(shí)發(fā)育的3個(gè)時(shí)期的抗氧化性進(jìn)行測定(見圖6)。結(jié)果表明:在紅顏草莓果實(shí)的白熟期、轉(zhuǎn)色期、成熟期3個(gè)時(shí)期中,從白熟期到轉(zhuǎn)色期的清除DPPH自由基能力、亞鐵還原能力和清除ABTS自由基能力均表現(xiàn)為降低的趨勢,到成熟期又表現(xiàn)為升高的趨勢,并且達(dá)到3個(gè)時(shí)期中的最大值。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn),在果實(shí)發(fā)育的同一時(shí)期,抗氧化指標(biāo)之間也存在著差異,表現(xiàn)為清除ABTS自由基能力最強(qiáng),其次為亞鐵還原能力,最低為清除DPPH自由基能力。

圖5 紅顏草莓果實(shí)多酚含量動態(tài)變化

圖6 紅顏草莓果實(shí)抗氧化能力分析

2.4 不同品種草莓果實(shí)多酚含量的分析

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳工藝參數(shù),對5個(gè)草莓品種進(jìn)行了果實(shí)多酚含量的測定(見圖7)。多酚含量在不同草莓品種間存在差異,雪里香草莓的多酚含量(2.52 mg/g)在5個(gè)品種中含量最高,且與其余4個(gè)品種均呈顯著性差異(P<0.05),其次為雪兔、紅顏和隋珠3個(gè)品種,多酚含量最低的為章姬草莓(1.58 mg/g),且顯著(P<0.05)低于其他品種。

圖7 不同品種草莓果實(shí)多酚含量

3 討論

多酚類化合物廣泛的存在于植物體內(nèi),原材料豐富,導(dǎo)致提取的方法也多種多樣,現(xiàn)有的多酚提取方法有:溶劑萃取法[15]、超聲波輔助提取法[16]、生物酶解提取法[17]、超臨界CO2萃取法[18]、膜技術(shù)提取法[19]和超高壓提取法[20]等。這些研究方法為多酚從原材料中提取提供了非常重要的科學(xué)依據(jù)。一般認(rèn)為超過20 kHz的機(jī)械波被稱為超聲波,而超聲波輔助提取于其他提取方法相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn),提取率更高且消耗更少[21]。研究者目前也多采用超聲輔助提取法對活性物質(zhì)進(jìn)行提取,4個(gè)因素對薜荔果多酚提取量影響最大的是提取時(shí)間,最小的是料液比[22]。在香菇的多酚提取研究中發(fā)現(xiàn),最小的影響因素同樣為乙醇濃度,但最大的影響因素為提取溫度[23]。對黑老虎果皮多酚提取工藝研究中發(fā)現(xiàn),各個(gè)因素對多酚得率的影響由高到低分別為:料液比、超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)[24]。在紅棗的研究中,各因素對多酚得率的影響主次因素分別為:超聲溫度、料液比、甲醇濃度、超聲時(shí)間[25]。通過前人的研究中可以發(fā)現(xiàn),各因素對多酚含量的影響在不同物種間差異較大,因此在提取時(shí)不能照搬其他物種的提取條件,需要分析后在本物種中進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)。本研究利用紅顏草莓為試驗(yàn)材料,以超聲波輔助提取法(40 kHz)對多酚含量進(jìn)行提取,以酸化甲醇為提取液,分析4個(gè)因素,包括甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間和提取次數(shù)對草莓多酚含量影響進(jìn)行分析后,得出多酚提取量受提取因素的影響最大的是提取次數(shù),其次是甲醇體積分?jǐn)?shù),再次是料液比,最小的是超聲時(shí)間。同時(shí)確定了最佳提取工藝條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)60%,料液比1∶9,超聲時(shí)間15 min,提取次數(shù)3次,該條件下多酚提取量為2.01 mg/g。多酚類物質(zhì)種類豐富,在植物體中有幾千種,同時(shí)不同植物中多酚物質(zhì)種類、數(shù)量和含量都有較大的區(qū)別,因此導(dǎo)致了對多酚提取工藝進(jìn)行研究時(shí)在不同物種中存在較大差異。

根據(jù)確定的最優(yōu)提取條件,對紅顏草莓果實(shí)的3個(gè)發(fā)育時(shí)期(白熟期、轉(zhuǎn)色期和成熟期)多酚含量進(jìn)行測定后發(fā)現(xiàn),紅顏草莓果實(shí)的多酚含量從白熟期到轉(zhuǎn)色期呈現(xiàn)為降低趨勢,到成熟期又表現(xiàn)為升高的趨勢,且在成熟期含量最大。在其他果樹研究中發(fā)現(xiàn),蘋果[26]、木棗[27]、石榴[28]果實(shí)發(fā)育中多酚含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,與草莓果實(shí)生長發(fā)育有較大的差異。其原因可能是草莓在轉(zhuǎn)色期光合產(chǎn)物較少,影響了草莓多酚物質(zhì)的積累,而在成熟期隨著草莓果實(shí)轉(zhuǎn)色的完成草莓果實(shí)的營養(yǎng)物質(zhì)積累達(dá)到最大值,多酚含量也達(dá)到最大值。為了進(jìn)一步研究不同品種草莓間多酚含量的差異,選擇了5個(gè)品種的草莓對其果實(shí)多酚含量進(jìn)行測定后發(fā)現(xiàn),5個(gè)品種草莓之間的多酚含量存在著差異,其中雪里香草莓的多酚含量最高(2.52 mg/g),章姬草莓最低(1.58 mg/g)。在不同的研究中發(fā)現(xiàn),草莓樣品的提取方法對多酚含量的影響較大。王志巧[29]等人對草莓干樣的多酚含量進(jìn)行測定,得出最佳提取條件為提取溶劑50%乙醇,料液比1∶20,時(shí)間3 h,溫度70 ℃,在此條件下草莓多酚類化合物含量最高為24.6 mg/g。程安瑋[30]等人,對比了冷凍干燥、熱風(fēng)干燥、真空干燥方式及干燥溫度對草莓多酚含量的影響,得出結(jié)論冷凍干燥方式可以較好的保持草莓果粉中的多酚。李芬芬[31]等用超聲波輔助法提取草莓干樣中的多酚含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與常規(guī)方法相比,提取草莓中的多酚含量較高,為10.96 mg/g。超聲波輔助法利用超聲波產(chǎn)生的機(jī)械作用,能夠加快體系的傳速和傳熱速度,加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放,從而大大提高了植物中多酚含量的擴(kuò)散和浸出,提高提取量。

通過分析草莓的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)紅顏草莓果實(shí)的抗氧化能力在果實(shí)成熟期最強(qiáng),在果實(shí)轉(zhuǎn)色期最低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)草莓果實(shí)對清除ABTS自由基能力最強(qiáng),其次為亞鐵還原能力,最低為清除DPPH自由基能力。以不同成熟期的草莓果實(shí)為材料,以DPPH自由基清除能力和亞鐵還原能力為抗氧化評價(jià)指標(biāo),隨著果實(shí)的發(fā)育期草莓果實(shí)的抗氧化能力呈先下降后上升的趨勢,且下降趨勢比較明顯[32]。王婉馨[33]等以4個(gè)紅色草莓品種和2個(gè)白色草莓品種果實(shí)為材料,結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅顏草莓果實(shí)對清除ABTS自由基能力最高,妙香草莓的亞鐵還原能力最高,這些均與本研究結(jié)果一致。在其他果樹中也有同樣的研究,以不同發(fā)育期的蘋果果實(shí)為材料,發(fā)現(xiàn)抗氧化能力幼果期較高,隨著發(fā)育呈減少趨勢,同時(shí)發(fā)現(xiàn)蘋果果實(shí)對清除ABTS自由基能力最強(qiáng)[34]。分析不同成熟期的紅棗的抗氧化能力后發(fā)現(xiàn),棗果實(shí)清除DPPH自由基能力隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸降低,最后趨于平穩(wěn),且未成熟的棗果實(shí)清除DPPH自由基能力最強(qiáng)[35]。這些結(jié)果與本研究結(jié)果存在一定的差異,這可能是由于多酚含量的差異所致。

4 結(jié)論

基于單因素和正交試驗(yàn)分析得出草莓果實(shí)多酚提取的最佳提取工藝為甲醇體積分?jǐn)?shù)60%,料液比1∶9,超聲時(shí)間15 min,提取次數(shù)3次,在最優(yōu)的工藝參數(shù)下提取的多酚含量為2.01 mg/g。提取次數(shù)對多酚提取量影響最大。紅顏草莓在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的抗氧化能力表現(xiàn)為成熟期>白熟期>轉(zhuǎn)色期。在最優(yōu)提取工藝的處理下,雪里香草莓果實(shí)的多酚含量在5個(gè)草莓品種中多酚含量最高,章姬草莓果實(shí)的多酚含量最低,不同品種草莓多酚含量存在差異。