陳秀敏 吳熊軍 許文彬 鄧乾葆（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，海口 570311）

宮頸癌是全世界女性第二大常見惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌，發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢，且發(fā)病人群逐漸年輕化［1-3］。隨著診斷技術(shù)和醫(yī)療水平不斷提高，宮頸癌患者預(yù)后得到了明顯改善，但發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后仍很差。此外，部分治愈的宮頸癌患者也會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者生存期嚴重縮短［4］。具有共刺激和共抑制信號的免疫檢查點受體是機體免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)劑，抑制免疫檢查點受體的T 細胞表達是降低腫瘤逃避或削弱宿主免疫力的關(guān)鍵機制。Tim-3是一種新鑒定的免疫檢查點受體，在多種細胞中表達，如NK 細胞、T 細胞、Treg 細胞、肥大細胞及腫瘤細胞［5-6］。越來越多的證據(jù)表明，Tim-3 在腫瘤細胞中的表達可能直接或通過抑制免疫作用促進腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移［7］。腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤中起重要作用，并與腫瘤進程密切相關(guān)。本研究通過檢測宮頸癌組織Tim-3 表達，進一步探究其對宮頸癌體內(nèi)外生長的影響以及對腫瘤微環(huán)境的作用，以期為宮頸癌診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 選擇海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2018年6月至2020年6月收治且病理學(xué)檢查確診為宮頸癌的腫瘤組織30例，并取距宮頸癌組織3 cm以上的組織作為癌旁組織標本?；颊吣挲g32～69 歲，平均（49.62±4.12）歲。所有患者臨床資料完整，手術(shù)前未經(jīng)過化療、放療及免疫治療等任何治療，并排除轉(zhuǎn)移性宮頸癌或患有其他系統(tǒng)惡性腫瘤患者，本研究經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準：K20180524152。

1.1.2 主要材料與試劑 4周齡SPF級雌性BALB/c裸鼠30 只，體質(zhì)量18～20 g，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水攝食，每日光照/黑暗交替12 h。人宮頸癌細胞系HeLa 購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；胰蛋白酶、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗、DMEM 培養(yǎng)液（美國Gibco 公司）；免疫組化染色試劑盒、HE染色試劑盒、ELISA 檢測試劑盒（南京凱基生物公司）；RNA 抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量檢測試劑盒（日本TaKaRa 公司）；CCK-8 試劑盒（美國eBiosence 公司）；EdU 染色試劑盒（南京諾唯贊生物公司）；TUNEL 試劑盒、Transwell 小室（美國Invitrogen 公司）；PVDF 膜、ECL 及BCA 測定試劑盒（上海碧云天生物研究所）；兔抗人Tim-3、Ki-67 單克隆抗體（美國Santacruz 公司）；鼠抗人GAPDH 單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（武漢博士德生物公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；基因引物序列合成、Tim-3 shRNA 慢病毒質(zhì)粒及陰性對照NC shRNA 慢病毒質(zhì)粒設(shè)計構(gòu)建均由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色檢測宮頸癌組織及癌旁組織Tim-3 表達 將收集的宮頸癌組織及癌旁組織置于4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制備組織切片。切片經(jīng)脫蠟脫水處理后，PBS沖洗，加入檸檬酸鈉修復(fù)抗原，0.3%過氧化氫液室溫孵育10 min，10%山羊血清封閉，滴加兔抗人Tim-3（1∶100）一抗4 ℃孵育過夜。次日PBS 沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色，流水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下隨機選擇6 個視野觀察并評分，以染色強度（未染色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2分，黃褐色為3分）和陽性細胞占比（每個視野100 個細胞中染色細胞百分比，<25%為1 分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分）綜合得分進行判定，<4分為陰性，≥4分為陽性。

1.2.2 qRT-PCR 檢測宮頸癌組織、癌旁組織及各組HeLa 細胞Tim-3 mRNA 表達 采用RNA 抽提試劑盒并嚴格按照說明書步驟提取總RNA。收集RNA 樣品，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR 檢測Tim-3 mRNA 表達，PCR 擴增體系根據(jù)試劑盒說明書進行配制，在BioRad CFX96系統(tǒng)設(shè)置程序進行擴增。擴增結(jié)束后，2-ΔΔCt計算基因相對表達，β-actin 為內(nèi)參，引物序列為Tim-3 F：5′-CCAAATCCCAGGCATAAT-3′，R：5′-AAGCGACAACCCAAAGGT-3′；β-actin F：5′-ATGGTGGGAATGGGTCAGA-3′，R：5′-TCTCCATGTCAGCCAGTTG-3′。

1.2.3 細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 取人宮頸癌HeLa細胞復(fù)蘇，添加含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，每2～3 d 進行換液，傳代培養(yǎng)。細胞以2×104個/孔接種于96 孔板，恒溫過夜培養(yǎng)，隨機分為3 組并進行相應(yīng)處理：對照組（正常培養(yǎng)）、NC shRNA 組（轉(zhuǎn)染陰性對照NC shRNA慢病毒質(zhì)粒）、Tim-3 shRNA組（轉(zhuǎn)染Tim-3 shRNA 慢病毒質(zhì)粒），MOI=100，加入5 μg/ml Polybrene 試劑，培養(yǎng)12 h，更換為新鮮培養(yǎng)液，后續(xù)使用0.5 mg/L 嘌呤霉素篩選，每隔1 d 換液，2 周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細胞。

1.2.4 Western blot 檢測各組HeLa 細胞Tim-3 蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染后HeLa 細胞，PBS 清洗，使用新鮮配制的RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，冰上裂解30 min，BCA 定量，制備10%SDS-PAGE 凝膠，取稀釋的各組等量蛋白樣品加入上樣孔，恒壓電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 洗膜，加入兔抗人Tim-3 一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜。次日TBST 洗膜，加入對應(yīng)二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST 再次洗膜，ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以GAPDH 為內(nèi)參，Image Pro-Plus 系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值。

1.2.5 CCK-8 檢測各組HeLa 細胞增殖活性 轉(zhuǎn)染后的HeLa 細胞分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 時，每孔加入10 μl CCK-8，輕輕混勻，繼續(xù)孵育2 h，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔細胞450 nm處吸光度。

1.2.6 EdU 染色檢測各組HeLa細胞增殖水平 收集轉(zhuǎn)染后的HeLa 細胞，調(diào)整密度按1×105個/孔接種于24 孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)液，使用含終濃度為10 μmol/L的EdU培養(yǎng)2 h，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，4%多聚甲醛室溫固定20 min，甘氨酸孵育5 min，PBS洗滌，滴加0.5%Triton X-100透膜10 min，PBS 再次洗滌，加入Apollo567 熒光染料，室溫避光染色30 min，DAPI 避光染核30 min，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察，藍色熒光為細胞核，紅色熒光為EdU標記的陽性細胞。

1.2.7 Transwell 檢測各組HeLa 細胞遷移與侵襲

基質(zhì)膠包被Transwell 小室上層底部，靜置形成基質(zhì)膜。將轉(zhuǎn)染后HeLa 細胞密度調(diào)整為1×105個/ml，Transwell 小室上層移入100 μl 細胞懸液，下層加入500 μl含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液恒溫孵育36 h，取出小室，4%多聚甲醛固定下層穿出細胞，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS清洗后晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察侵襲細胞數(shù)并拍照，隨機選取5個高倍視野計數(shù)，結(jié)果取平均值。Transwell 檢測細胞遷移實驗除不鋪基質(zhì)膠外，其他步驟均與上述侵襲檢測步驟相同。

1.2.8 宮頸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立 將30只SPF 級裸鼠隨機分為NC shRNA 組和Tim-3 shRNA組，每組15只，背部皮膚常規(guī)消毒。取轉(zhuǎn)染NC shRNA和Tim-3 shRNA的HeLa細胞，調(diào)整密度為2×107個/ml，兩組裸鼠分別注射轉(zhuǎn)染NC shRNA、Tim-3 shRNA 的HeLa 細胞，右側(cè)腋窩皮下接種進針，將0.2 ml 單細胞懸液推注于皮下，夾緊針孔以防滲漏。注射完畢后將裸鼠放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，每日觀察接種部位移植瘤生長，背部皮下出現(xiàn)硬結(jié)節(jié)表明腫瘤長出。定時用游標卡尺測量瘤體，計算移植瘤體積，21 d后處死裸鼠，抽取腹主動脈血，解剖取其腫瘤組織和脾臟組織，測量瘤體體積、稱重，將組織一部分固定于10%甲醛，一部分置于液氮迅速冷凍后-80 ℃保存。

1.2.9 HE 染色檢測各組裸鼠腫瘤組織病理學(xué)變化 取固定于10%甲醛的兩組裸鼠腫瘤組織，修剪，常規(guī)石蠟包埋，切4 μm石蠟片，脫蠟去水，HE染色。蘇木精染色4～8 min，流水沖洗，1%鹽酸/乙醇溶液分化，洗凈，曙紅染色2～3 min，脫水透明后封片，晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織變化并拍照。

1.2.10 TUNEL 檢測各組裸鼠腫瘤組織細胞凋亡 腫瘤組織石蠟切片脫水透明，加入20 μg/ml Proteinase K，37 ℃恒溫孵育30 min，室溫繼續(xù)孵育20 min，PBS沖洗，滴加50 μl TUNEL 檢測液，室溫孵育1 h，加過氧化物酶轉(zhuǎn)化劑繼續(xù)孵育30 min，PBS沖洗，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，隨機選擇5個視野計數(shù)該視野下200 個細胞中陽性細胞數(shù)，計算TUNEL陽性細胞率。

1.2.11 ELISA檢測各組裸鼠血清相關(guān)因子水平將抽取的兩組裸鼠血液分別置入EDTA 抗凝管，室溫靜置，4 000 r/min 離心5 min，收集血清，ELISA 檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12 水平，實驗嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.2.12 流式細胞術(shù)檢測各組裸鼠脾臟組織CD4+、CD8+細胞比例 將分離的裸鼠脾臟組織使用生理鹽水洗凈，分離脾臟細胞，添加細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，取100 μl 置于無菌離心管，依次加入10 μl CD4-FITC 單克隆抗體、CD8-PE單克隆抗體，混勻，室溫避光孵育30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μl固定液保存30 min，流式細胞儀檢測脾臟組織CD4+T、CD8+T細胞表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均用表示，單因素方差分析進行多組間數(shù)據(jù)比較，組間比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織及癌旁組織Tim-3 表達比較

qRT-PCR 結(jié)果顯示，宮頸癌組織Tim-3 mRNA 表達較癌旁組織顯著升高（P<0.05，圖1A）。免疫組化染色結(jié)果顯示，癌旁組織無明顯陽性染色，而宮頸癌組織有大量陽性著色胞核和胞質(zhì)，宮頸癌組織Tim-3蛋白表達率（90.00%，27/30）較癌旁組織Tim-3蛋白表達率（6.67%，2/30）顯著升高（P<0.01，圖1B）。

圖1 宮頸癌組織及癌旁組織Tim-3表達Fig.1 Tim-3 expression in cervical cancer tissues and adjacent tissues

2.2 轉(zhuǎn)染后HeLa 細胞Tim-3 表達變化 將Tim-3 shRNA 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa 細胞，qRT-PCR 和Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，Tim-3 shRNA組HeLa 細胞中Tim mRNA 和蛋白表達均顯著下降（P均<0.01），而NC shRNA組與對照組Tim-3 mRNA和蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.214、P=0.259，圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)染后HeLa細胞Tim-3 mRNA與蛋白表達Fig.2 Tim-3 mRNA and protein expression in HeLa cells after transfection

2.3 抑制Tim-3 表達對HeLa 細胞增殖的影響

CCK-8 檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h 和72 h 后，Tim-3 shRNA 組HeLa 細胞活性顯著低于對照組（P均<0.01），NC shRNA 組與對照組細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.241、P=0.426，圖3）。EdU 染色結(jié)果顯示，對照組和NC shRNA 組有大量EdU 標記的陽性細胞表達，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.108），而Tim-3 shRNA 組EdU 標記的陽性細胞較對照組顯著減少（P<0.01，圖4）。

圖3 CCK-8檢測各組HeLa細胞活性Fig.3 CCK-8 detects activity of HeLa cells in each group

圖4 EdU染色檢測各組HeLa細胞增殖Fig.4 EdU staining detects proliferation of HeLa cells in each group

2.4 抑制Tim-3 表達對HeLa 細胞遷移與侵襲的影響 Transwell 檢測結(jié)果顯示，Tim-3 shRNA 組HeLa細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均少于對照組（P均<0.01），而NC shRNA 組和對照組細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.067、P=0.120，圖5）。

圖5 Transwell檢測各組HeLa細胞侵襲與遷移Fig.5 Transwell detects invasion and migration of HeLa cells in each group

2.5 裸鼠宮頸癌移植瘤生長情況 兩組裸鼠腫瘤長出后測量腫瘤體積大小，測量的第6、9、12、15、18、21 天，注射轉(zhuǎn)染Tim-3 shRNA 的HeLa 細胞組裸鼠腫瘤體積顯著小于注射轉(zhuǎn)染NC shRNA 的HeLa細胞組裸鼠腫瘤體積（P均<0.01，圖6）。

圖6 裸鼠移植瘤體積比較Fig.6 Comparison of volume of transplanted tumors in nude mice

2.6 裸鼠宮頸癌移植瘤質(zhì)量 腫瘤長出后第21天時解剖兩組裸鼠腫瘤組織，可見注射轉(zhuǎn)染Tim-3 shRNA 的HeLa 細胞組裸鼠腫瘤組織小于注射轉(zhuǎn)染NC shRNA 的HeLa 細胞組（圖7A）；注射轉(zhuǎn)染Tim-3 shRNA 的 HeLa 細胞組裸鼠腫瘤質(zhì)量顯著低于注射轉(zhuǎn)染NC shRNA的 HeLa細胞組裸鼠（P<0.01，圖7B）；HE 染色、TUNEL 染色和免疫組化染色觀察發(fā)現(xiàn)，相較于注射轉(zhuǎn)染NC shRNA 的HeLa 細胞組裸鼠腫瘤組織，注射轉(zhuǎn)染Tim-3 shRNA 的HeLa 細胞組裸鼠腫瘤組織細胞凋亡數(shù)較多，增殖數(shù)較少（圖7C）。

圖7 裸鼠宮頸癌移植瘤質(zhì)量比較Fig.7 Comparison of quality of cervical cancer xenografts in nude mice

2.7 宮頸癌移植瘤裸鼠血清相關(guān)因子及T 淋巴細胞亞群分布比較 ELISA 結(jié)果顯示，與注射轉(zhuǎn)染NC shRNA 的HeLa 細胞組裸鼠比較，注射轉(zhuǎn)染Tim-3 shRNA 的HeLa 細胞組裸鼠血清TGF-β1、IL-10 含量顯著下降（P均<0.01），IL-2、IL-6 含量顯著升高（P均<0.01，表1）。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示（圖8、表2），與注射轉(zhuǎn)染NC shRNA 的HeLa 細胞組裸鼠比較，注射轉(zhuǎn)染Tim-3 shRNA 的HeLa 細胞組裸鼠脾臟CD4+T 細胞和CD8+T 細胞比例均顯著升高（P均<0.01）。

表1 兩組裸鼠血清TGF-β1、IL-2、IL-6、IL-10 含量比較（，pg/ml）Tab.1 Comparison of TGF-β1，IL-2，IL-6，IL-10 contents in serum of two groups of nude mice（，pg/ml）

表1 兩組裸鼠血清TGF-β1、IL-2、IL-6、IL-10 含量比較（，pg/ml）Tab.1 Comparison of TGF-β1，IL-2，IL-6，IL-10 contents in serum of two groups of nude mice（，pg/ml）

Note：Compared with NC shRNA group，1）P<0.01.

表2 兩組裸鼠脾臟CD4+T、CD8+T細胞比例比較（）Tab.2 Comparison of proportions of CD4+T and CD8+T cells in spleen of nude mice between two groups（）

表2 兩組裸鼠脾臟CD4+T、CD8+T細胞比例比較（）Tab.2 Comparison of proportions of CD4+T and CD8+T cells in spleen of nude mice between two groups（）

Note：Compared with NC shRNA group，1）P<0.01.

圖8 流式細胞術(shù)檢測裸鼠脾臟CD4+、CD8+細胞比例Fig.8 Flow cytometry to detect proportions of CD4+ and CD8+ cells in spleen of nude mice

3 討論

宮頸癌是威脅全世界婦女生命健康的常見惡性腫瘤之一，多數(shù)宮頸癌病例均由HPV 引起。目前宮頸癌主要治療手段包括外科手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療，多數(shù)患者在疾病早期可通過手術(shù)治愈，但中期和晚期因腫瘤出現(xiàn)局部或大面積轉(zhuǎn)移治療效果不佳，且腫瘤細胞耐藥性導(dǎo)致患者預(yù)后差、生存率降低［4］。宮頸癌發(fā)展的分子機制尚未明確，因此迫切需要探索新的生物標志物或治療靶標更好地揭示宮頸癌進展的分子機制，從而開發(fā)出有效的宮頸癌治療方法。

盡管多個證據(jù)表明HPV 感染是引發(fā)宮頸癌的先決條件，但不足以導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生，因為致癌作用還取決于個體遺傳變異和表觀遺傳修飾［8］。近年繪制整個系統(tǒng)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已得到深入發(fā)掘，并極大地增進了研究者對包括腫瘤進展在內(nèi)的多種生物學(xué)過程分子機制的興趣，探索表達異常的生物學(xué)標志物對各種疾病診治至關(guān)重要。Tim-3 最初被確定為調(diào)節(jié)Th1細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的免疫檢查點受體，在固有免疫細胞上表達，并在多種腫瘤和包括慢性病毒感染在內(nèi)的各種炎癥性疾病中發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用［7，9］。研究表明，Tim-3 在不同疾病中表現(xiàn)出不同的表達模式和功能。如在一些非腫瘤性腎臟疾病中，Tim-3 表達增加，并與慢性腎臟疾病患者病理癥狀和血清學(xué)指標呈正相關(guān)［10］；Tim-3能夠加速足細胞損傷，通過觸發(fā)巨噬細胞NF-κB/TNF-α信號通路促進糖尿病腎病進程［11］；Tim-3在胰腺癌組織中高表達，其高表達可能與胰腺癌細胞浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)［12］；肝細胞癌中Tim-3 可用作預(yù)后生物標志物和判斷治療效率的指標［13］。本研究顯示，宮頸癌組織中Tim-3表達較高，推測Tim-3可能參與宮頸癌發(fā)生與發(fā)展。

抗腫瘤效果可歸因于改變生化機制，包括抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期進程、促進細胞凋亡以及調(diào)節(jié)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以上幾種機制已成為抗癌作用的主要指標。本研究中，通過轉(zhuǎn)染Tim-3 shRNA慢病毒質(zhì)粒至人宮頸癌HeLa細胞降低Tim-3表達，結(jié)果顯示HeLa 細胞增殖、遷移與侵襲能力均下降。將轉(zhuǎn)染Tim-3 shRNA 慢病毒質(zhì)粒的HeLa 細胞注射到裸鼠中，通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)降低Tim-3 表達能夠抑制裸鼠腫瘤生長。說明Tim-3 在宮頸癌進展中發(fā)揮作用，降低其表達能夠抑制腫瘤生長。

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是由腫瘤細胞、成纖維細胞、免疫細胞、信號分子和細胞外基質(zhì)組成的細胞生態(tài)位［14］。大量研究表明TME 是抗腫瘤免疫發(fā)揮效應(yīng)的主要場所，更好地了解TME 對免疫應(yīng)答的影響有助于提高免疫療法功效。腫瘤細胞衍生的細胞因子、趨化因子和代謝產(chǎn)物等均 對TME 有重要影響，如TGF-β、IL-10 和CXCL15 能夠抑制自然殺傷性CD8+T 細胞和細胞毒性T 淋巴細胞，幫助腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)的識別和攻擊［15-16］。多數(shù)腫瘤細胞表達高水平的干細胞因子，通過與c-kit 蛋白相互作用誘導(dǎo)肥大細胞遷移至腫瘤部位，此外，肥大細胞通過表達促炎因子使T細胞和NK 細胞失活，并抑制其抗腫瘤活性［17-18］?？梢娔[瘤免疫微環(huán)境的組成決定了對腫瘤免疫療法的反應(yīng)能力。本研究顯示，通過注射轉(zhuǎn)染Tim-3 shRNA慢病毒質(zhì)粒的HeLa 細胞構(gòu)建的宮頸癌移植瘤裸鼠血清TGF-β1、IL-10 含量下降，IL-2、IL-6 含量升高，同時裸鼠脾臟CD4+T 細胞和CD8+T 細胞比例均升高，說明Tim-3 可能參與調(diào)控宮頸癌腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)因子及CD4+T、CD8+T細胞亞群分布。

綜上，Tim-3在宮頸癌組織中高表達，降低Tim-3表達能夠體外抑制宮頸癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移，并在體內(nèi)抑制移植瘤裸鼠腫瘤組織生長，促進組織細胞凋亡，并下調(diào)腫瘤免疫微環(huán)境因子TGF-β1與IL-10，上調(diào)IL-2與IL-6，上調(diào)脾臟CD4+T、CD8+T 細胞比例，為宮頸癌的診治方案提供了理論基礎(chǔ)，也為改善宮頸癌TME中的免疫抑制提供了新途徑。