袁小波 彭小珊 周麗麗 唐 靜（湘潭市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心，湘潭 411100）

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥，也是導(dǎo)致成年人失明的主要原因之一［1］。目前，糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究認(rèn)為，持續(xù)的高血糖造成的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs）損傷是其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，因此，抑制高糖引起的HRMECs損傷對(duì)于糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療尤為重要［2］。蕎麥黃酮是蕎麥的主要活性成分，具有降血糖、降脂、抗炎等功效［3］。有報(bào)道稱，蕎麥黃酮可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和纖維化，其作用機(jī)制與下調(diào)細(xì)胞中長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）遠(yuǎn)端缺失同源盒6反義RNA1（distal-less homeobox 6 antisense RNA1，DLX6-AS1）表達(dá)有關(guān)［4］。然而，蕎麥黃酮能否影響HRMECs 損傷還未知。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種炎癥因子，除參與調(diào)控炎癥反應(yīng)外，還對(duì)細(xì)胞凋亡、氧化損傷等具有調(diào)控作用［5］。研究顯示，HMGB1 在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織及高糖誘導(dǎo)的HRMECs 中均表達(dá)升高，敲減HMGB1 可通過(guò)抑制半胱天冬酶-3（caspase-3）活化及促進(jìn)B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表達(dá)，減少高糖誘導(dǎo)的HRMECs 凋亡［6-7］。本研究建立高糖誘導(dǎo)的HRMECs 損傷模型，旨在觀察蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 損傷的影響及其能否通過(guò)調(diào)控HMGB1 發(fā)揮作用，以期為其用于糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HRMECs（上海信裕生物科技有限公司，批號(hào)：220518）；DMEM 培養(yǎng)液、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒（北京索萊寶，批號(hào)：2022061211、2022270509、2022051627、2022041408）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）實(shí)驗(yàn)試劑盒、胎牛血清（浙江天杭，批號(hào)：220425、220503）；蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)所需抗體（中國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：20220408）；引物序列、HMGB1過(guò)表達(dá)載體（pcDNA-HMGB1）和空載體（pcDNA）（上海生工，批號(hào)：20220517、20220515、20220426）；LipofectamineTM2000試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：2022051611）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6 和IL-10 試劑盒（南京建成，批 號(hào)：220415、220520、220504、220328、220501、220408）。

1.2 方法

1.2.1 制備蕎麥黃酮 參照文獻(xiàn)［3］方法制備蕎麥黃酮：將購(gòu)買并經(jīng)鑒定的蕎麥花葉進(jìn)行干燥，以1∶7（質(zhì)量∶體積）添加50%乙醇，60 ℃回流2 h，提取3 次，合并濾液。將濾液用AB-8 打孔吸附樹(shù)脂分離，用水洗柱子，用50%乙醇解吸被吸附的提取物即為蕎麥黃酮。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇HRMECs，用完全培養(yǎng)液（含10 %胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液）置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于6 孔板中接種2.5 ml HRMECs（5.0×104個(gè)/ml），培養(yǎng)24 h 后，利用LipofectamineTM2000 試劑盒分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-HMGB1，轉(zhuǎn)染時(shí)間為12 h，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 ①于96 孔板中接種0.2 ml HRMECs（5.0×104個(gè)/ml），培養(yǎng)4 h 后，分別用含0、0.125、0.25、0.5、1、1.25、1.5、1.75、2 mg/ml 蕎麥黃酮的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。②于96 孔板中接種0.2 ml HRMECs（5.0×104個(gè)/ml），培養(yǎng)4 h后，分為正常對(duì)照（NC）組、HG 組、HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組，NC 組細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，HG 組細(xì)胞用含30 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h［7］，HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組細(xì)胞分別用0.5、1.0、2.0 mg/ml 蕎麥黃酮和30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h［4］。③于96孔板中接種0.2 ml 轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-HMGB1 的HRMECs（5.0×104個(gè)/ml），均按照HG+高蕎麥黃酮組進(jìn)行處理，并分別記為HG+蕎麥黃酮+pcDNA 組和HG+蕎麥黃酮+pcDNA-HMGB1 組。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔中加10 μl CCK-8，孵育細(xì)胞2 h，置于酶標(biāo)儀卡槽中，設(shè)置波長(zhǎng)450 nm，檢測(cè)各孔光密度（OD）值。細(xì)胞抑制率（%）=（1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 于6 孔板中接種2.5 ml HRMECs 或轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-HMGB1的HRMECs，培養(yǎng)4 h 后，按照上述1.2.3 中②和③分別分組培養(yǎng)。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，PBS 清洗細(xì)胞。加500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加10 μl Annexin V-FITC，避光孵育15 min，再加5 μl PI，避光孵育5 min后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。

1.2.5 比色法檢測(cè)MDA、LDH 和SOD 細(xì)胞接種和培養(yǎng)同1.2.4。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞用PBS 清洗后，加裂解液裂解，3 500 r/min 離心10 min后，取上清液，分別利用MDA、SOD 試劑盒檢測(cè)上清液中MDA含量、SOD 活性。將各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液3 500 r/min離心10 min，取上清液，利用LDH 試劑盒檢測(cè)LDH漏出量。

1.2.6 ELISA 檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-10 細(xì)胞接種和培養(yǎng)同1.2.4。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 500 r/min 離心10 min。取上清液，分別采用TNF-α、IL-6 和IL-10 ELISA 試劑盒檢測(cè)其水平。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞接種和培養(yǎng)同1.2.4。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞用PBS清洗。用RIPA 試劑獲取細(xì)胞中總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。用SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn)分離總蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h。于4 ℃冰箱中分別用B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、HMGB1（1∶1 000）和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（1∶1 000）一抗孵育過(guò)夜，洗膜后，再用山羊抗兔二抗（1∶2 000）于37 ℃孵育1 h。加顯影液顯影，曝光拍照，Image J軟件分析Bax、Bcl-2 和HMGB1 相 對(duì)GAPDH 的 表達(dá)量。

1.2.8 RT-PCR 檢測(cè)HMGB1 mRNA 表達(dá) 細(xì)胞接種和培養(yǎng)同1.2.4。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，采用RNA 提取試劑盒提取各組細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：HMGB1正向5′-TGCAGATGACAAGCAGCCTT-3′，反 向5′-GCTGCATCAGGCTTTCCTTT-3′；GAPDH 正 向5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反 向5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。2-ΔΔCt法計(jì) 算HMGB1 mRNA 相對(duì)GAPDH的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各檢測(cè)指標(biāo)均符合正態(tài)分布，以xˉ±s 表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較先用單因素方差進(jìn)行分析，使用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蕎麥黃酮對(duì)HRMECs活性的影響 與0 mg/ml蕎麥黃酮組比較，不同劑量（0.125、0.25、0.5、1、1.25、1.5、1.75、2 mg/ml）蕎麥黃酮組HRMECs 抑制率無(wú)顯著變化，說(shuō)明此劑量范圍內(nèi)的蕎麥黃酮對(duì)HRMECs活性無(wú)顯著影響。見(jiàn)圖1。

圖1 蕎麥黃酮對(duì)HRMECs抑制率的影響Fig.1 Effect of buckwheat flavone on inhibition rate of HRMECs

2.2 蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 凋亡的影響 與NG 組比較，HG 組HRMECs 抑制率、凋亡率、細(xì)胞中Bax 蛋白表達(dá)升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。與HG 組比較，HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組HRMECs抑制率、凋亡率、細(xì)胞中Bax 蛋白表達(dá)降低（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)升高（P<0.05），且HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2、表1。

表1 蕎麥黃酮對(duì)HRMECs凋亡的影響（，n=3）Tab.1 Effects of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis（，n=3）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

圖2 蕎麥黃酮對(duì)HG 誘導(dǎo)的HRMECs 凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of buckwheat flavone on HG-induced HRMECs apoptosis and expressions of Bax and Bcl-2 protein

2.3 蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 氧化應(yīng)激的影響 與NG 組比較，HG 組HRMECs 中MDA 含量、LDH 漏出量升高（P<0.05），SOD 活性降低（P<0.05）。與HG 組比較，HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組HRMECs 中MDA含量、LDH 漏出量降低（P<0.05），SOD活性升高（P<0.05），且HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 氧化應(yīng)激的影響（，n=3）Tab.2 Effects of buckwheat flavone on high glucose-induced oxidative stress of HRMECs（，n=3）

表2 蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 氧化應(yīng)激的影響（，n=3）Tab.2 Effects of buckwheat flavone on high glucose-induced oxidative stress of HRMECs（，n=3）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

2.4 蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 炎癥因子表達(dá)的影響 與NG 組比較，HG 組IL-6 和TNF-α 水平升高（P<0.05），IL-10水平降低（P<0.05）。與HG 組比較，HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組IL-6 和TNF-α 水平降低（P<0.05），IL-10 水平升高（P<0.05），且HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs炎癥因子表達(dá)的影響（，n=3，pg/ml）Tab.3 Effects of buckwheat flavone on expressions of inflammatory factors in HRMECs induced by high glucose（，n=3，pg/ml）

表3 蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs炎癥因子表達(dá)的影響（，n=3，pg/ml）Tab.3 Effects of buckwheat flavone on expressions of inflammatory factors in HRMECs induced by high glucose（，n=3，pg/ml）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

2.5 蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮HRMECs 細(xì)胞中HMGB1 表達(dá)的影響 與NG 組比較，HG 組HMGB1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）。與HG 組比較，HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組HMGB1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），且HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3、表4。

表4 蕎麥黃酮對(duì)HG 誘導(dǎo)的HRMECs 中HMGB1 表達(dá)的影響（，n=3）Tab.4 Effects of buckwheat flavone on expression of HMGB1 in HG-induced HRMECs（，n=3）

表4 蕎麥黃酮對(duì)HG 誘導(dǎo)的HRMECs 中HMGB1 表達(dá)的影響（，n=3）Tab.4 Effects of buckwheat flavone on expression of HMGB1 in HG-induced HRMECs（，n=3）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

圖3 蕎麥黃酮對(duì)HG 誘導(dǎo)的HRMECs 中HMGB1 蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of buckwheat flavone on expression of HMGB1 protein in HG-induced HRMECs

2.6 過(guò)表達(dá)HMGB1 逆轉(zhuǎn)蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 凋亡的影響 HG+蕎麥黃酮+pcDNAHMGB1組HRMECs中HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)量均高于HG+蕎麥黃酮+pcDNA組（P<0.05）。與HG+蕎麥黃酮+pcDNA 組比較，HG+蕎麥黃酮+pcDNAHMGB1 組HRMECs 抑制率、凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)均升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。見(jiàn)圖4、表5。

表5 過(guò)表達(dá)HMGB1逆轉(zhuǎn)蕎麥黃酮對(duì)HRMECs凋亡的影響（，n=3）Tab.5 Overexpression of HMGB1 reverses effect of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis（，n=3）

表5 過(guò)表達(dá)HMGB1逆轉(zhuǎn)蕎麥黃酮對(duì)HRMECs凋亡的影響（，n=3）Tab.5 Overexpression of HMGB1 reverses effect of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis（，n=3）

Note：Compared with HG+buckwheat flavone+pcDNA group，1）P<0.05.

圖4 過(guò)表達(dá)HMGB1 逆轉(zhuǎn)蕎麥黃酮對(duì)HRMECs 凋亡及HMGB1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Overexpression of HMGB1 reversed effects of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis and protein expressions of HMGB1，Bax，Bcl-2

2.7 過(guò)表達(dá)HMGB1 逆轉(zhuǎn)蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 氧化應(yīng)激和炎癥因子表達(dá)的影響 與HG+蕎麥黃酮+pcDNA 組比較，HG+蕎麥黃酮+pc-DNA-HMGB1 組HRMECs 中MDA 含量、LDH 漏出量升高（P<0.05），SOD 活性降低（P<0.05），IL-6 和TNF-α 水平升高（P<0.05），IL-10 水平降低（P<0.05）。見(jiàn)表6。

表6 過(guò)表達(dá)HMGB1逆轉(zhuǎn)蕎麥黃酮對(duì)HG誘導(dǎo)的HRMECs氧化應(yīng)激和炎癥因子表達(dá)的影響（，n=3）Tab.6 Overexpression of HMGB1 reverses effects of buckwheat flavone on HG-induced oxidative stress and inflammatory factors expressions in HRMECs（，n=3）

表6 過(guò)表達(dá)HMGB1逆轉(zhuǎn)蕎麥黃酮對(duì)HG誘導(dǎo)的HRMECs氧化應(yīng)激和炎癥因子表達(dá)的影響（，n=3）Tab.6 Overexpression of HMGB1 reverses effects of buckwheat flavone on HG-induced oxidative stress and inflammatory factors expressions in HRMECs（，n=3）

Note：Compared with HG+buckwheat flavone+pcDNA group，1）P<0.05.

3 討論

近年來(lái)，由于居民飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)［8］。作為糖尿病的并發(fā)癥之一，糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率也隨之升高［9］。糖尿病患者長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)，高血糖可誘發(fā)HRMECs 產(chǎn)生過(guò)度的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)甚至凋亡，這也是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的重要原因。因此，抑制高糖誘導(dǎo)的HRMECs 損傷對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的蕎麥黃酮對(duì)HRMECs 活性無(wú)顯著影響，將適量濃度的蕎麥黃酮作用于高糖誘導(dǎo)的HRMECs，結(jié)果顯示，蕎麥黃酮能夠呈劑量依賴性地增強(qiáng)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 活性，并減少細(xì)胞凋亡，提示其對(duì)HRMECs 發(fā)揮保護(hù)作用。Bax 是一種促凋亡分子，其表達(dá)增加時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2 則發(fā)揮抗凋亡作用，其表達(dá)增加對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用［10］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，蕎麥黃酮抑制了高糖誘導(dǎo)的HRMECs 中Bax 蛋白表達(dá)，促進(jìn)了Bcl-2蛋白表達(dá)，說(shuō)明其發(fā)揮抗高糖誘導(dǎo)的HRMECs凋亡與調(diào)控Bax/Bcl-2有關(guān)。

持續(xù)的高血糖可誘導(dǎo)HRMECs 氧自由基生成增加，自由基進(jìn)一步與細(xì)胞膜脂質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及核酸發(fā)生一系列氧化反應(yīng)，造成細(xì)胞氧化損傷［11］。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其水平高低可間接反映細(xì)胞氧化應(yīng)激水平［12］。SOD 是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除自由基，減輕自由基對(duì)機(jī)體組織的氧化損傷［13］。在細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，LDH 被釋放。因此，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH漏出量越高，說(shuō)明細(xì)胞受損越嚴(yán)重［14］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，蕎麥黃酮降低了高糖誘導(dǎo)的HRMECs 中MDA含量和LDH 漏出量，提高了細(xì)胞中SOD 活性，且呈劑量依賴性，提示蕎麥黃酮能夠減輕高糖誘導(dǎo)的HRMECs 氧化損傷。此外，持續(xù)的高血糖還可誘導(dǎo)HRMECs 發(fā)生炎癥反應(yīng)，分泌過(guò)量炎癥因子促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。研究顯示，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視網(wǎng)膜組織中IL-6 和TNF-α 呈高表達(dá)，促進(jìn)該疾病的發(fā)展［15］。IL-10屬于抗炎因子，對(duì)IL-6和TNF-α 等促炎因子具有抵抗作用，可緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變患者炎癥狀態(tài)［16］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，蕎麥黃酮抑制了高糖誘導(dǎo)的HRMECs分泌IL-6和TNF-α，而促進(jìn)其分泌IL-10，且呈劑量依賴性，這說(shuō)明蕎麥黃酮可減輕高糖誘導(dǎo)的HRMECs炎癥損傷。

HMGB1是一種炎癥因子，其參與調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等生理或病理過(guò)程。研究顯示，miR-205-5p 可通過(guò)靶向下調(diào)HMGB1 減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減輕腦缺血再灌注損傷［17］。既往研究顯示，HMGB1也參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展，抑制HMGB1基因表達(dá)能夠改善糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈的血流，并抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡［18］。本研究結(jié)果顯示，蕎麥黃酮呈劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的HRMECs 中HMGB1 mRNA 和蛋白表達(dá)，而過(guò)表達(dá)HMGB1 則逆轉(zhuǎn)了蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs增殖活性、凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響，進(jìn)一步提示蕎麥黃酮可能通過(guò)下調(diào)HMGB1 抑制高糖誘導(dǎo)的HRMECs 凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。

綜上，一定劑量的蕎麥黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)具有顯著抑制作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中HMGB1 表達(dá)有關(guān)。HMGB1 受上游miRNA 調(diào)控，而miRNA 又受環(huán)狀RNA 和lncRNA 調(diào)控，因此，蕎麥黃酮可能通過(guò)作用于環(huán)狀RNA 或lncRNA 進(jìn)而靶向miRNA 來(lái)調(diào)控HMGB1 表達(dá)，從而減輕高糖誘導(dǎo)的HRMECs 損傷，其具體作用的環(huán)狀RNA 或lncRNA 及miRNA 有待進(jìn)一步探究。