楊年釗 戴大飛 楊小龍 姚 軍 馬佳慧 趙 軍（皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科，蕪湖 241001）

結(jié)直腸癌是全球第三大常見癌癥，約占所有實(shí)體瘤的10%，直腸腫瘤約占所有結(jié)直腸癌病例的40%，其中約50%表現(xiàn)為局部晚期疾病［1-2］。盡管現(xiàn)代醫(yī)療診治水平（手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、分子靶向療法和免疫療法等）有了很大提高，但結(jié)直腸癌仍然是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因［3］。根據(jù)中國(guó)國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì)，中國(guó)大腸癌的發(fā)病率和死亡率均逐年上升［4］。目前直腸癌形成和進(jìn)展的分子機(jī)制仍不清楚，妨礙了該疾病的有效治療。因此，識(shí)別新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物并探索治療直腸癌的潛在靶點(diǎn)有重要的意義。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，膠原蛋白的沉積增加及其交聯(lián)可影響癌細(xì)胞功能，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，進(jìn)而加速腫瘤進(jìn)展［5-6］。膠原沉積和交聯(lián)取決于賴氨酸殘基的羥基化，這主要由前膠原賴氨酸-2-酮戊二酸-5-雙加氧酶（procollagen-lysine，2-oxoglutarate 5-dioxygenase，PLOD）催化。目前發(fā)現(xiàn)三種賴氨酸羥基化酶，包括PLOD1、PLOD2、PLOD3［7］。PLOD 家族基因的表達(dá)水平受多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和miRNA 種類控制［8］。PLOD3（也稱LH3）基因是PLOD 家族成員，它是一種具有賴氨酰羥化酶、膠原半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（GGT）活性的多功能酶［9］。細(xì)胞外基質(zhì)中PLOD3 的GGT 酶活性對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和活力至關(guān)重要［10］。越來(lái)越多的證據(jù)表明PLOD3 的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如在肺癌中PLOD3 通過(guò)調(diào)控STAT3 信號(hào)通路，激活RAS-MAP激酶促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移［11］。在腦膠質(zhì)瘤中，沉默PLOD3 表達(dá)通過(guò)p53 非依賴性調(diào)節(jié)p21 途徑抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)G1期阻滯；抑制PLOD3 表達(dá)，通過(guò)下調(diào)包括Snail 和Twist 在內(nèi)的間充質(zhì)標(biāo)志物，降低VEGF 的表達(dá)和抑制細(xì)胞的遷移和侵襲［12］。PLOD3是早期肝癌診斷的標(biāo)志物，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明PLOD3 失活可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［13］。DENG等［14］研究通過(guò)12 例結(jié)腸癌和癌旁樣本的PCR 及Western blot 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLOD3 在結(jié)腸癌中呈高表達(dá)，并通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)其與結(jié)腸癌不良預(yù)后有關(guān)，PLOD3 的高表達(dá)與免疫調(diào)節(jié)劑的表達(dá)減少和兩種促腫瘤途徑的活性增強(qiáng)有關(guān)，包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）中的糖異生和TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)。WANG 等［15］研究發(fā)現(xiàn)PLOD3 在胃癌中上調(diào)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，影響胃癌患者預(yù)后。因此，推測(cè)PLOD3 有可能參與直腸癌的發(fā)生發(fā)展，也可能是直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。然而，關(guān)于PLOD3 在直腸癌中的表達(dá)、生物功能及對(duì)預(yù)后的影響尚不清楚，本研究旨在探究PLOD3 在直腸癌中的生物學(xué)功能及預(yù)后價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 PLOD3 mRNA 在腫瘤組織中差異表達(dá)分析采用GEPIA2（TCGA 和GTEx）和TIMER（TCGA）對(duì)PLOD3 在腫瘤中與正常對(duì)照組織中mRNA 差異表達(dá)進(jìn)行分析。采用GENT2（GEO）對(duì)PLOD3 在直腸癌中的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。GEPIA2 涵蓋來(lái)自TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)的9 736 個(gè)腫瘤和8 587 個(gè)正常樣本的RNA 測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)［16］。本研究通過(guò)泛癌分析獲得PLOD3 在不同種類癌癥中的表達(dá)圖譜，使用Logrank 和Mantel-Cox 比較來(lái)自TCGA 及GTEx 的410 個(gè)直腸癌與正常組織中PLOD3 的表達(dá)水平，參數(shù)設(shè)置：P為0.01，fold change 為2。GENT2 包含來(lái)自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)超過(guò)68 000個(gè)樣本，現(xiàn)在提供72種不同組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)［17］。本研究通過(guò)泛癌分析模塊驗(yàn)證PLOD3 在直腸癌中的表達(dá)情況。數(shù)據(jù)平臺(tái)選擇AffymetrixU133Plus2 和AffymetrixU133A，P為0.01。TIMER 主要用于系統(tǒng)評(píng)估不同腫瘤中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況及臨床影響，還可以探索腫瘤和正常組織之間的差異基因表達(dá)以及基因之間的相關(guān)性等［18］。使用DiffExp 模塊，使用Wilcoxon 檢驗(yàn)評(píng)估差異表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 PLOD3 在直腸癌中蛋白表達(dá)分析 HPA 可以獲得來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的常見腫瘤的免疫組化圖譜［19］。本研究使用HPA 評(píng)估正常組織與直腸癌組織中PLOD3的蛋白表達(dá)水平。對(duì)來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的599 例腫瘤和正常直腸組織進(jìn)行分析，抗體選擇HPA001236，根據(jù)染色強(qiáng)度和數(shù)量，將蛋白表達(dá)水平分為4個(gè)級(jí)別：無(wú)、<25%、25%～75%和>75%。

1.3 PLOD3 基因表達(dá)與直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系使用GEPIA（TCGA 和GTEx）進(jìn)行PLOD3 在直腸癌中的生存分析，并使用Kaplan-Meier 驗(yàn)證。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)Kaplan-Meier 曲線評(píng)估有風(fēng)險(xiǎn)患者的OS 和無(wú)病生存期（disease free survival，DFS）。按照中位數(shù)分為高、低表達(dá)兩組，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HR）、95%置信區(qū)間（CI）和P值。Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA、GEO 和EGA［20］。主要用于發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證癌癥患者的生物標(biāo)志物、存活率和預(yù)后。本研究使用K-M plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)確定直腸癌中PLOD3 與OS、DFS 之間的關(guān)聯(lián)。采取單因素分析，按照中位數(shù)分為高、低表達(dá)兩組，顯示有風(fēng)險(xiǎn)的病例數(shù)、HR、95%CI和P值。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析 使用TIMER 評(píng)估PLOD3 在直腸癌中與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（B 細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）的相關(guān)性。采用log2 TMP 表示基因表達(dá)量，Spearman相關(guān)系數(shù)和P值自動(dòng)計(jì)算。

1.5 基因組學(xué)突變分析 cBioPortal 是一種可以可視化和分析癌癥基因組數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)［21］。本研究根據(jù)cBioPortal數(shù)據(jù)評(píng)估在直腸癌中基因類型、突變和拷貝數(shù)變異（CNV），P<0.05 表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。K-M Plot 用于分析在腫瘤突變負(fù)荷（TMB）高低組中PLOD3 表達(dá)量與預(yù)后相關(guān)性，參數(shù)采取默認(rèn)設(shè)置。

1.6 DNA 啟動(dòng)子甲基化分析 采用UALCAN 分析PLOD3 在直腸癌中的甲基化水平（來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的105 個(gè)組織樣本），通過(guò)SurvivalMeth 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證。UALCAN 提供多種來(lái)源癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)（TCGA、MET500、CPTAC 和CBTTC），可以用于評(píng)估表觀遺傳調(diào)控基因啟動(dòng)子甲基化表達(dá)等［22］。本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)對(duì)直腸癌與正常對(duì)照組間進(jìn)行甲基化分析。Beta 值表示甲基化水平，P值自動(dòng)計(jì)算。SurvivalMeth 是一個(gè)分析DNA 甲基化與預(yù)后關(guān)系的工具，其數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA、CCLE 和GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)，包括36 種癌癥的13 371 個(gè)樣本中的81 個(gè)DNA 甲基化譜［23］。本研究采用SurvivalMeth 分析評(píng)估直腸癌中PLOD3 啟動(dòng)子甲基化情況及其與預(yù)后的關(guān)系。采用t檢驗(yàn)，閾值為0.01。

1.7 PLOD3 基因共表達(dá)及基因功能富集分析 本研究使用GeneMANIA（GEO 數(shù)據(jù)）構(gòu)建了PLOD3 和共表達(dá)基因的基因-基因網(wǎng)絡(luò)。NetworkAnalyst 構(gòu)建了PLOD3 和共表達(dá)基因的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。NetworkAnalyst 是一個(gè)集成了組織、細(xì)胞特異性PPI網(wǎng)絡(luò)、基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［24］。GeneMANIA（來(lái)源GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)）是一個(gè)用于分析目標(biāo)基因的遺傳和蛋白質(zhì)相互作用、共表達(dá)、途徑、共定位和域-蛋白質(zhì)相似性在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析工具［25］。參數(shù)采取默認(rèn)設(shè)置，Pearson 相關(guān)系數(shù)和P值自動(dòng)計(jì)算，根據(jù)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行排序，提取前20 最相關(guān)共表達(dá)基因。該研究使用Metascape 對(duì)PLOD3 及其共表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析。Metascape 是一款用于基因注釋和基因集富集分析的工具［26］。在本研究中，該工具用于評(píng)估PLOD3 及其共表達(dá)基因的功能。PPI網(wǎng)絡(luò)使用mCODE分析，富集系數(shù)>1.5，P值設(shè)為0.01，P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然后使用DAVID再次進(jìn)行功能富集分析，DAVID包含一套全面的功能注釋工具，用于更好地闡明目標(biāo)基因的生物學(xué)功能［27］。本研究使用DAVID 對(duì)PLOD3 及其密切相關(guān)的共表達(dá)基因進(jìn)行了GO 和KEGG 通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 PLOD3 在直腸癌中異常表達(dá) 分別從GEPIA2、UALCAN、GENT2、TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取PLOD3基因的相關(guān)信息。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)信息比較多種腫瘤類型與正常組織中PLOD3 的表達(dá)情況。不同數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果均顯示，與正常組織相比，腫瘤中的PLOD3呈高表達(dá)，與正常直腸組織相比，直腸癌中PLOD3表達(dá)量顯著升高（P<0.05，圖1A～C）。GEPIA 結(jié)果顯示在直腸癌不同病理分期中PLOD3 表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1D）。確定PLOD3 在直腸癌中轉(zhuǎn)錄水平變化后，本研究使用HPA分析PLOD3在直腸癌與正常組織中蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示在直腸癌樣本中的PLOD3 蛋白呈高表達(dá)（圖2A、B），在正常直腸組織中PLOD3 蛋白不表達(dá)（圖2C、D）。以上結(jié)果表明，直腸癌中PLOD3 在mRNA 及蛋白水平上均過(guò)表達(dá)。

圖1 PLOD3 mRNA在腫瘤中差異表達(dá)Fig.1 Differential expression of PLOD3 mRNA in tumors

圖2 人類蛋白質(zhì)圖譜顯示PLOD3的免疫組化圖像Fig.2 Human Protein Atlas showing immunohistochemical images of PLOD3

2.2 PLOD3對(duì)直腸癌預(yù)后的評(píng)估價(jià)值 使用GEPIA和K-M Plot 進(jìn)行生存分析，評(píng)估PLOD3 與直腸癌預(yù)后的關(guān)系。PLOD3 的OS 曲線顯示PLOD3 的高轉(zhuǎn)錄水平與直腸癌患者的較短OS 顯著相關(guān)（P<0.05，圖3A、C）。DFS 曲線顯示PLOD3 的高轉(zhuǎn)錄水平與直腸癌患者的DFS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B、D）。

圖3 PLOD3在直腸癌中的生存分析Fig.3 Survival analysis of PLOD3 in rectal cancer

2.3 直腸癌患者PLOD3 基因的免疫細(xì)胞浸潤(rùn) 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)可以影響直腸癌的預(yù)后，本研究使用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估了PLOD3 基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示PLOD3 與CD8+T 細(xì)胞負(fù)相關(guān)（Cor=-0.261，P=1.92e-3），與CD4+T 細(xì)胞正相關(guān)（Cor=0.196，P=2.07e-2），而 與B 細(xì) 胞（Cor=-0.119，P=1.62e-1）、巨噬細(xì)胞（Cor=0.101，P=2.39e-1）、中性粒細(xì)胞（Cor=-0.093，P=2.78e-1）及樹突狀細(xì)胞（Cor=-0.125，P=1.41e-1）的相關(guān)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示PLOD3 在直腸癌中免疫微環(huán)境中有調(diào)節(jié)腫瘤免疫活性的作用（圖4A）。

圖4 PLOD3 表達(dá)與直腸癌中免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性及PLOD3基因突變分析Fig.4 Correlation between PLOD3 expression and immune infiltration level in rectal cancer and analysis of PLOD3 gene mutation

2.4 直腸癌患者PLOD3 基因頻率的改變 使用cBioPortal 數(shù)據(jù)庫(kù)分析直腸癌患者中PLOD3 基因突變情況。結(jié)果顯示直腸癌患者顯著性的PLOD3 基因改變（10%），包括擴(kuò)增、深度缺失、截?cái)嗤蛔?、錯(cuò)義突變和轉(zhuǎn)錄上調(diào)（圖4B、C）。K-M Plot 生存數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示在腫瘤突變負(fù)荷（TMB）高危組中，PLOD3 mRNA 高表達(dá)與直腸癌患者較短的OS 顯著相關(guān)（P<0.05，圖4D）。

2.5 PLOD3 在直腸癌中共表達(dá)及功能富集分析使用GeneMANIA、NetworkAnalyst 構(gòu)建PLOD3 及其功能相關(guān)共表達(dá)基因的網(wǎng)絡(luò)，探索PLOD3 在直腸癌中的可能機(jī)制。結(jié)果顯示：PLOD1、COLGALT1、PLOD2、COLGALT2、P4HB、POR、FBXO6、TECPR1、GBE1、COL4A2、AL445524.2、HADHA、OGFOD3、EEF1G、TGM2、CPT1A、EGLN2、P4HA1、EGLN3、FAM153A 等基因與PLOD3 的調(diào)節(jié)功能相關(guān)（圖5）。使用DAVID、Metascape 評(píng)估PLOD3 與其功能相關(guān)的前20 個(gè)基因的生物學(xué)功能，結(jié)果顯示，前5 個(gè)富集項(xiàng)目分別為蛋白質(zhì)羥基化、膠原蛋白生物合成和修飾酶、賴氨酸降解、細(xì)胞修飾氨基酸代謝過(guò)程、脂肪酸氧化（圖6A、B）；構(gòu)建了由ID 著色的功能富集網(wǎng)絡(luò)（圖6C）。為了進(jìn)一步研究PLOD3 與直腸癌的關(guān)系，課題組構(gòu)建了PPI 網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行了分子復(fù)合物檢測(cè)（mCODE）分析，結(jié)果顯示PLOD3 功能主要與膠原蛋白生物合成和修飾酶、膠原蛋白的形成、細(xì)胞外基質(zhì)的組成有關(guān)（圖6D～F）。

圖6 直腸癌中PLOD3及其20個(gè)共表達(dá)基因的富集分析Fig.6 Enrichment analysis of PLOD3 and its co-expressed 20 genes in rectal cancer

2.6 在直腸癌中PLOD3 啟動(dòng)子甲基化分析 使用UALCAN和SurvivalMeth進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示在直腸癌患者中PLOD3 啟動(dòng)子甲基化水平較對(duì)照組顯著降低（P<0.05，圖7A、B）。為了進(jìn)一步分析PLOD3 啟動(dòng)子甲基化對(duì)直腸癌患者生存的影響，本研究使用SurvivalMeth 生存分析功能，根據(jù)直腸癌患者甲基化中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分為高危組和低危組，結(jié)果顯示高危組患者甲基化水平顯著降低（P<0.05，圖7C），且高危組與較短的OS 顯著相關(guān)（P<0.05，圖7D）。

圖7 直腸癌中PLOD3基因的甲基化分析Fig.7 Methylation analysis of PLOD3 gene in rectal cancer

3 討論

前膠原賴氨酸-2-酮戊二酸-5-雙加氧酶（PLODs）是調(diào)節(jié)賴氨酸羥基化和穩(wěn)定膠原蛋白的酶家族，PLOD3 基因是PLODs 家族中的一員，除具有與PLOD1、PLOD2 一樣的賴氨酰羥化酶、膠原半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性外，還具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（GGT）活性［9］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明PLOD3 的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如肺癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌等。然而，關(guān)于PLOD3 在直腸癌中的功能尚不清楚［11-15］。在本研究發(fā)現(xiàn)PLOD3 在直腸癌中mRNA 及蛋白表達(dá)水平均顯著高表達(dá)，且PLOD3 表達(dá)較高的患者OS 較差。本研究在直腸癌中的這些發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道的PLOD 家族基因在其他腫瘤中的表達(dá)趨勢(shì)相一致。因此，PLOD3基因可能是直腸癌患者的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。

免疫細(xì)胞在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞行為中發(fā)揮重要作用，越來(lái)越多的證據(jù)支持它們?cè)陬A(yù)測(cè)許多癌癥類型的結(jié)果和治療效果方面的重要性［28］。HARADA等［29］發(fā)現(xiàn)在使用放化療之前具有更多CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的直腸癌對(duì)放化療更敏感，有更長(zhǎng)的DFS 和OS。SCHOLLBACH 等［30］發(fā)現(xiàn)在局部晚期直腸癌中，具有較多的CD8+T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)可帶來(lái)良好的OS。因此，本研究分析了在直腸癌中PLOD3 基因表達(dá)水平與各種腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞（B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）的相關(guān)性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在直腸癌中PLOD3 與CD8+T 免疫浸潤(rùn)細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，提示PLOD3 在調(diào)節(jié)腫瘤免疫學(xué)中起負(fù)面作用，因此PLOD3 可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫進(jìn)而影響患者的OS。

從基因組學(xué)角度分析，腫瘤是一種由DNA 變異累積而引起的遺傳疾病，基因組的改變導(dǎo)致細(xì)胞功能致病性變化［31］。腫瘤突變負(fù)荷（TMB）指每百萬(wàn)堿基中被檢測(cè)出的體細(xì)胞基因編碼錯(cuò)誤、堿基替換、基因插入或缺失錯(cuò)誤的總數(shù)，高度突變的腫瘤被認(rèn)為含有增加的新抗原負(fù)荷，使其具有免疫原性，并對(duì)免疫治療有反應(yīng)［32］。為了探究PLOD3 在直腸癌發(fā)生發(fā)展中基因組變化，本研究使用cBioPortal對(duì)來(lái)自TCGA 的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)直腸癌患者中PLOD3 基因突變率為10%，K-M Plot 結(jié)果顯示在TMB 高危組中PLOD3 的mRNA 高表達(dá)與直腸癌患者較短的OS 顯著相關(guān)。因此，PLOD3 有可能成為這些高頻突變基因組（H-TMB）直腸癌患者的協(xié)同治療靶點(diǎn)。

近年來(lái)，很多證據(jù)表明表觀遺傳與腫瘤密切相關(guān)，包括：DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 調(diào)控［33］。DNA 甲基化是在基因組CpG 二核苷酸的胞嘧啶5 號(hào)碳位共價(jià)鍵上結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)，在基因穩(wěn)定和基因表達(dá)中起重要作用，甲基化能夠“關(guān)閉”基因的表達(dá)，與癌癥、衰老等疾病密切相關(guān)［34］。在結(jié)直腸腫瘤中，甲基化修飾是致癌過(guò)程中重要的分子機(jī)制［35］。本研究發(fā)現(xiàn)PLOD3 在直腸癌患者組織中啟動(dòng)子甲基化水平比正常直腸組織顯著降低。高危組患者PLOD3 甲基化水平顯著降低，高危組與較短的OS 顯著相關(guān)。因此，在直腸癌中PLOD3 可能是通過(guò)DNA甲基化發(fā)揮功能。

以往的研究表明，PLOD 家族成員在其他疾病中的作用機(jī)制主要是通過(guò)對(duì)眾多信號(hào)通路的調(diào)節(jié)［36］。在本研究中，為了進(jìn)一步了解PLOD3 在直腸癌中的生物學(xué)功能，我們探索了可能與PLOD3 功能相關(guān)的重要基因并進(jìn)行了GO 和KEGG 功能富集分析。結(jié)果顯示這些基因主要參與蛋白質(zhì)羥基化、膠原蛋白生物合成和修飾酶、賴氨酸降解、細(xì)胞修飾氨基酸代謝過(guò)程、脂肪酸氧化、細(xì)胞外基質(zhì)的組成。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要的成分，為腫瘤細(xì)胞提供多種生化信號(hào)，與腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［37］。異常的賴氨酸降解與膠原相關(guān)疾病的進(jìn)展有關(guān)，包括癌癥和纖維化［38］。PLOD 基因家族通過(guò)調(diào)節(jié)膠原蛋白生物合成與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)［39］。因此，PLOD3在直腸癌的確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)了PLOD3 對(duì)直腸癌患者的預(yù)后價(jià)值。盡管本研究揭示了PLOD3 在直腸癌中的表達(dá)模式和潛在的臨床和科學(xué)意義，但仍存在一定的局限性。第一：本課題組使用的數(shù)據(jù)來(lái)自多個(gè)不同的數(shù)據(jù)庫(kù)，很難保證不同數(shù)據(jù)庫(kù)之間的統(tǒng)一性，課題組無(wú)法核實(shí)這些數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)。第二：PLOD3 表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。第三：應(yīng)通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞和動(dòng)物水平進(jìn)一步驗(yàn)證直腸癌中PLOD3 的功能及可能機(jī)制，也需要大量的臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究說(shuō)明了PLOD3 在直腸癌中具有重要作用，提供了關(guān)于PLOD3 在直腸癌中的功能及預(yù)后的證據(jù)，為直腸癌的診斷、尋找潛在治療靶點(diǎn)、個(gè)體化治療及預(yù)后評(píng)估提供參考。