袁瑩瑩 劉海燕 郭 芳（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院新生兒科，廣州 510260）

B 族鏈球菌（colonization of group B streptococcus，GBS）感染作為一類于女性的消化道下端和生殖道正常定植的革蘭氏陽性球菌，又被稱為無乳鏈球菌［1］。在新生兒娩出的過程中，吸入或吞進(jìn)GBS可引發(fā)嚴(yán)重的腦膜炎、肺炎、敗血癥，導(dǎo)致其發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的后遺癥，甚至死亡，也是當(dāng)前國(guó)際公認(rèn)可以誘發(fā)新生兒出現(xiàn)侵襲性感染的第一因素［2］。相關(guān)研究數(shù)據(jù)指出，有10%～30%孕婦中存在GBS感染，40%～70%的新生兒可能會(huì)感染GBS［3］。新生兒出現(xiàn)的GBS 感染主要有早發(fā)、晚發(fā)型兩種，早發(fā)疾病引起的新生兒病死率為11.1%，晚發(fā)疾病引起的新生兒病死率為27.8%［4］。T 淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫反應(yīng)細(xì)胞，亦是人體中重要的調(diào)節(jié)免疫的細(xì)胞，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，在機(jī)體正常情況下，體內(nèi)CD4+/CD8+T 維持動(dòng)態(tài)平衡，以保證機(jī)體免疫功能正常［5］。巨噬細(xì)胞屬于人體內(nèi)的免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的主要功能為吞噬侵入體內(nèi)的病原體、死亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞釋放的內(nèi)容物，并作為抗原提呈細(xì)胞激活T 細(xì)胞，機(jī)體對(duì)侵入的病原體做出免疫應(yīng)答反應(yīng)［6］。當(dāng)新生兒感染GBS后，體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)、多肽抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，巨噬細(xì)胞因子能夠激活機(jī)體相關(guān)的免疫細(xì)胞，對(duì)抗GBS，進(jìn)而引起體內(nèi)細(xì)胞免疫功能改變［7］。既往對(duì)新生兒感染GBS的相關(guān)因素報(bào)道研究較多，但GBS 致新生兒巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子及免疫功能改變的研究仍較少見。因此，本研究著重探討GBS 致新生兒巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子及免疫功能改變的情況，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 取2020 年3 月至2022 年1 月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的確診母GBS 定植的新生兒43例，設(shè)為研究組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①依據(jù)美國(guó)2010 版CDC《圍產(chǎn)期GBS 預(yù)防指南》，對(duì)孕34～37 周婦女門診行GBS PCR 快速篩查，如陽性，則進(jìn)一步培養(yǎng)宮頸分泌物，培養(yǎng)陽性納入標(biāo)準(zhǔn)；如培養(yǎng)陰性，但母合并胎膜早破>18 h，或體溫超過38 ℃，或患絨毛膜羊膜炎，考慮存在宮內(nèi)感染可能，也納入本研究；②患兒家屬自愿參與；③進(jìn)行GBS PCR 快速篩查前后均未進(jìn)行抗生素治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①早產(chǎn)引起的呼吸窘迫；②合并心臟疾病；③合并腫瘤；④患有院內(nèi)感染；⑤合并其他類型感染；⑥拒絕參加。同期廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院健康新生兒40 例為對(duì)照組。其中，研究組年齡0～10 d，病程3～10 d，體質(zhì)量2 305～3 368 g；對(duì)照組年齡0～5 d，體質(zhì)量2 380～3 472 g。兩組患兒的性別等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。所有患兒的監(jiān)護(hù)人均知曉此次試驗(yàn)的方案且簽署知情同意書，該方案經(jīng)過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床研究與應(yīng)用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019-ks-KY-04）。

表1 兩組患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general data between 2 groups

1.1.2 試劑與儀器 雙標(biāo)記單克隆抗體CD3+/CD19+和CD4+/CD8+及紅細(xì)胞溶解均購(gòu)自法國(guó)國(guó)際免疫公司。流式細(xì)胞儀（型號(hào)：MAX15036，貝克曼庫(kù)爾特公司）；雙標(biāo)記單克隆抗體CD3+/CD19+和CD4+/CD8+試劑盒由美國(guó)的R&D 公司提供；相關(guān)趨化因子水平血清巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibition factor，MIF）、CXCL9、CXCL10、CCL3的試劑盒由美國(guó)的R&D公司提供。

1.2 方法

1.2.1 干預(yù)方法 孕期女性GBS 的確診手段：無菌聚酯纖維拭子（均為一次性使用）采集孕婦（孕周超過34 周）肛周和陰道的分泌物給予鑒定培養(yǎng)（選擇性GBS 培養(yǎng)平板培養(yǎng)）并將其他常見陰道病原菌排除（如支原體、衣原體等混合感染）。

研究組和對(duì)照組的新生兒出生時(shí)采集臍動(dòng)脈血，檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群水平、NK 細(xì)胞水平、趨化因子以及巨噬細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子濃度水平。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞亞群水平、NK 細(xì)胞水平 新生兒出生時(shí)采集臍動(dòng)脈血2 ml，EDTA 抗凝處理后，2 000 r/min 離心5 min，分離細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞亞群水平（CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、CD3+CD4+T）以及NK 細(xì)胞水平。兩支試管中各加入100 μl EDTA 抗凝靜脈血，再分別加入20 pt 的雙標(biāo)單克隆抗體CD3+/CD19+T 和CD4+/CD8+T，室溫避光孵育20 min后，加 500 μl 紅細(xì)胞溶解液溶解紅細(xì)胞15 min，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，用PBS 緩沖液沖洗2 次，再以0.5 ml PBS 緩沖液懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析5 000 個(gè)細(xì)胞，嚴(yán)格按照相關(guān)的說明書步驟操作，批內(nèi)和批間差異在10%、15%以內(nèi)。

1.2.2.2 血清巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子、相關(guān)趨化因子水平檢測(cè) 新生兒出生時(shí)采集臍動(dòng)脈血2 ml，EDTA抗凝處理后，2 000 r/min 離心5 min，-80 ℃冰箱保存。采用Bio-plex 的懸液芯片多重檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)血清巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子血清中IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平；檢測(cè)相關(guān)趨化因子水平MIF、CX-CL9、CXCL10、CCL3。嚴(yán)格依照相關(guān)試劑盒的說明書步驟操作，將批內(nèi)和批間差異10%、15%以內(nèi)。

1.2.2.3 母GBS 定植的新生兒臨床表現(xiàn) 統(tǒng)計(jì)GBS 血流感染患兒臨床表現(xiàn)。臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、氣促、反應(yīng)差、血壓低、花斑紋、黃疸、抽搐等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS26.0軟件分析，以［n（%）］代表計(jì)數(shù)資料，用χ2檢驗(yàn)比較，組間兩兩對(duì)比用卡方分割法，以代表正態(tài)分布的計(jì)量資料，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，正態(tài)分布資料的相關(guān)性采用Person 相關(guān)性分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的T淋巴細(xì)胞亞群水平及NK細(xì)胞水平變化比較 研究組CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 細(xì)胞水平均高于對(duì)照組，CD3+CD4+T低于對(duì)照組（P<0.05）。此結(jié)果說明母GBS定植對(duì)其T 淋巴細(xì)胞亞群水平及NK 細(xì)胞水平具有一定影響，見表2。

表2 T淋巴細(xì)胞亞群水平及NK細(xì)胞水平變化比較（）Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets and NK cell levels（）

表2 T淋巴細(xì)胞亞群水平及NK細(xì)胞水平變化比較（）Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets and NK cell levels（）

2.2 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平 兩組IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10水平進(jìn)行對(duì)比，研究組患兒IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平均高于對(duì)照組（P<0.05）。母GBS 定植新生兒的IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平明顯較高，見表3。

表3 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10水平比較（，pg/ml）Tab.3 Comparison of IFN-γ，IL-13，IL-4，IL-10 levels（，pg/ml）

表3 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10水平比較（，pg/ml）Tab.3 Comparison of IFN-γ，IL-13，IL-4，IL-10 levels（，pg/ml）

2.3 巨噬細(xì)胞相關(guān)趨化因子水平 兩組巨噬細(xì)胞相關(guān)趨化因子對(duì)比，研究組患兒MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 水平均高于對(duì)照組（P<0.05）。此結(jié)果亦說明母GBS 定植新生兒與健康新生兒進(jìn)行對(duì)比，MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 水平呈現(xiàn)異常升高的趨勢(shì)，見表4。

表4 巨噬細(xì)胞相關(guān)趨化因子比較（，pg/ml）Tab.4 Comparison of macrophage-related chemokines（，pg/ml）

表4 巨噬細(xì)胞相關(guān)趨化因子比較（，pg/ml）Tab.4 Comparison of macrophage-related chemokines（，pg/ml）

2.4 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、相關(guān)趨化因子、細(xì)胞免疫功能與新生兒GBS感染相關(guān)性分析 Person 相關(guān)性分析顯示，血清CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 細(xì)胞水平、IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 與新生兒GBS 感染呈正相關(guān)，CD3+CD4+T 水平與新生兒GBS 感染呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。見表5。

表5 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、相關(guān)趨化因子、細(xì)胞免疫功能與新生兒GBS感染的相關(guān)性分析Tab.5 IFN-γ，IL-13，IL-4，IL-10，related chemokines，cellular immune function and neonatal GBS infection

2.5 母GBS 定植的新生兒臨床表現(xiàn) 對(duì)母GBS 定植新生兒的臨床表現(xiàn)進(jìn)行追蹤，發(fā)現(xiàn)43例新生兒出現(xiàn)呼吸窘迫4例，休克1例，敗血癥2例，腦膜炎1例，胃液培養(yǎng)陽性2 例。在經(jīng)過臨床對(duì)癥治療后，研究組均治愈出院。

3 討論

GBS自從1938年被首次報(bào)告，直至1970年才被認(rèn)為是新生兒敗血癥、腦膜炎以及肺炎的主要致病菌［9］。歐美國(guó)家GBS 比較常見，是誘發(fā)新生兒出現(xiàn)嚴(yán)重的感染菌群之一，亦被列為細(xì)菌感染新生兒的第一位致病菌［10］。GBS 感染具有患病率高、病死率高、致殘率高的特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)多為肺炎、呼吸衰竭、高熱等。早發(fā)型GBS 感染以肺炎、肺動(dòng)脈高壓和菌血癥為主要的特征，隨著疾病的不斷發(fā)展，新生兒敗血癥后期可發(fā)生心肌功能障礙血壓下降、彌散性血管內(nèi)凝血、周圍中性粒細(xì)胞減少等［11-12］。國(guó)外報(bào)道指出，近20年來，美國(guó)、英國(guó)等歐美國(guó)家出現(xiàn)GBS 感染最高的人群即是新生兒，其具體的發(fā)生率61%、28%，病死率超過2成［13-14］。近年來，隨著我國(guó)生育政策的調(diào)整，我國(guó)每年新生兒人數(shù)不斷增多，新生兒GBS 感染發(fā)病率也不斷上升。新生兒GBS感染的主要途徑則是母嬰感染，大部分是新生兒分娩期間接觸了母體產(chǎn)道存在的細(xì)菌或者是羊膜早破誘發(fā)的各種上行感染［15］。

胚胎期T 淋巴細(xì)胞的來源大多是肝和卵黃囊，正常人體的T 淋巴細(xì)胞來源于骨髓的多能干細(xì)胞，在新生兒時(shí)期，骨髓里面少量的多能干細(xì)胞向著胸腺內(nèi)遷移，之后在胸腺激素的刺激下分化、成熟，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸欢庖呋钚缘腡細(xì)胞［16］。巨噬細(xì)胞主要由單核細(xì)胞分化產(chǎn)生，是一類定制在組織內(nèi)部的白細(xì)胞，其能夠分泌很多類型的酶及各種活性因子，包括血小板的衍生物生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素、多肽轉(zhuǎn)換的生長(zhǎng)因子以及腫瘤壞死因子等［17］。機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，體內(nèi)的巨噬細(xì)胞主要用于機(jī)體損失位置組織、病原體的清除等，促進(jìn)機(jī)體的創(chuàng)傷愈合。本次研究中，研究組CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 細(xì)胞水平均高于對(duì)照組，CD3+CD4+T低于對(duì)照組。分析認(rèn)為：新生兒GBS 感染后，促進(jìn)了體內(nèi)炎癥反應(yīng)，而T 淋巴細(xì)胞作為免疫活性T細(xì)胞，在清除體內(nèi)病原體的同時(shí)，刺激大量CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T 產(chǎn)生，進(jìn)一步導(dǎo)致感染GBS的新生兒體內(nèi)T淋巴細(xì)胞水平異常。研究組患兒IFN-γ、MIF、IL-4、IL-10、IL-13、CXCL9、CXCL10、CCL3 水平均高于對(duì)照組。對(duì)于感染GBS 的新生兒，其體內(nèi)成熟的T 細(xì)胞可以通過血流移動(dòng)到外周免疫的各個(gè)器官，經(jīng)過多個(gè)組織進(jìn)行再循環(huán)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞免疫作用，同時(shí)T 細(xì)胞的再循環(huán)則可加強(qiáng)免疫應(yīng)答，對(duì)抗GBS［18］。GBS 進(jìn)入生殖道向上到宮內(nèi)，導(dǎo)致新生兒感染GBS，而上皮細(xì)胞是抵御病原菌的第一道防線，巨噬細(xì)胞可以吞噬并消滅外部的病原菌，刺激機(jī)體各種細(xì)胞因子不斷地釋放，在新生兒的身體中，巨噬細(xì)胞接觸IFN-γ 后，產(chǎn)生炎癥因子，激活巨噬細(xì)胞殺死病原菌的能力并提高其抗原具體的提呈能力，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子IL-10、IL-4、IL-13 分泌，殺滅入侵的病原體，從而抑制體內(nèi)的炎癥反應(yīng)［19］。三磷酸甘油醛脫氫酶位于GBS 表面，可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞實(shí)施吞噬行為，促進(jìn)IL-4、IL-10 因子的分泌，在GBS 血流感染患兒體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用。

結(jié)合本研究結(jié)果，Person相關(guān)性分析顯示，血清CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 細(xì)胞水平、IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 與新生兒GBS 感染呈正相關(guān)，CD3+CD4+水平與新生兒GBS 感染呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。側(cè)面證實(shí)了新生兒GBS 感染與巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子、T 淋巴細(xì)胞亞群水平存在顯著相關(guān)性，對(duì)于在產(chǎn)前確診母GBS 定植的新生兒，可以盡早檢測(cè)巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子、T 淋巴細(xì)胞亞群水平，從而為臨床上治療、評(píng)估新生兒GBS 感染提供診斷依據(jù)。新生兒出現(xiàn)4例呼吸窘迫，休克1例，敗血癥2例，腦膜炎1例，胃液培養(yǎng)陽性2例。研究組均治愈出院。

研究結(jié)果證實(shí)，對(duì)于新生兒GBS 感染患兒盡早采取針對(duì)性的干預(yù)措施，能有效地改善患兒預(yù)后，降低患兒發(fā)生呼吸窘迫、休克、腦炎等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子及T 淋巴細(xì)胞亞群水平參與了新生兒GBS 感染的免疫應(yīng)答過程，巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子及細(xì)胞免疫功能改變與新生兒GBS 感染相關(guān)。孕晚期母GBS PCR 篩查有利于識(shí)別早發(fā)型GBS 感染。受樣本量限制，本研究結(jié)果有待擴(kuò)大化的中心試驗(yàn)證實(shí)。