陳 誠(chéng),喬西波,孫 億,康 麗,姜運(yùn)良*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,泰安 271018; 2.山東紀(jì)華家禽育種股份有限公司,莒縣 276800)

瑯琊雞俗稱日照麻雞,原產(chǎn)于膠南、日照等地;由于在歷史上這些地區(qū)曾屬于瑯琊郡而得名。1977年被列入山東省畜禽地方良種,1978年被正式定名為瑯琊雞[1]。成年瑯琊雞的公雞頸部羽毛為金黃色,尾羽為黑綠色,其余羽毛為紅褐色,故有“火紅大公雞”的美譽(yù)。成年瑯琊雞的母雞體型小巧,尾羽呈黑色,其余覆蓋黃褐色麻羽?，樼痣u體型小巧、運(yùn)動(dòng)量大、覓食能力強(qiáng),具有較強(qiáng)的抗病能力。作為肉蛋兼用型品種,瑯琊雞的屠宰率較高,肉質(zhì)鮮嫩可口;雞蛋的蛋黃比率高,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富且口感較好[2-3]。隨著外來(lái)高產(chǎn)肉雞和蛋雞品種的引進(jìn)、雜交及商業(yè)化,瑯琊雞因其生長(zhǎng)速度慢、開產(chǎn)日齡較晚、產(chǎn)蛋率和產(chǎn)肉率較低等受到較大沖擊,導(dǎo)致瑯琊雞的數(shù)量銳減。因此,提高瑯琊雞的開產(chǎn)日齡、產(chǎn)蛋量等產(chǎn)蛋性狀,對(duì)于更好地保護(hù)和開發(fā)利用這一古老品種具有重要意義。

雞等家禽的產(chǎn)蛋能力取決于卵巢及卵泡的發(fā)育,受下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)的調(diào)節(jié),其中垂體分泌的促卵泡素(FSH)、黃體生成素(LH)以及卵巢產(chǎn)生的類固醇激素(雄激素、雌激素、孕酮等)發(fā)揮了重要作用。FSH是促進(jìn)卵泡發(fā)育的主要激素,能夠促進(jìn)卵泡膜上的血管生成,增加卵泡壁細(xì)胞處的氧氣攝入量,使卵巢血液循環(huán)加快;還能減弱顆粒細(xì)胞之間的緊密連接,讓卵母細(xì)胞更容易吸收卵黃,促進(jìn)卵黃沉積而使卵泡體積及重量增加[4-6]。FSH需要與促卵泡素受體(FSHR)結(jié)合才能發(fā)揮作用。FSHR是G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員[7],其 cDNA序列和全序列于2005年初步完成[8-9]。該基因位于雞3號(hào)染色體上,全長(zhǎng)77 664 bp,包含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子[10]。

卵泡選擇是影響雞產(chǎn)蛋性能的關(guān)鍵步驟,涉及到卵泡顆粒細(xì)胞的分化和增殖。卵巢中卵泡的選擇主要由FSH通過(guò)FSHR介導(dǎo)的環(huán)腺苷一磷酸(cAMP)途徑實(shí)現(xiàn)。等級(jí)前卵泡的顆粒細(xì)胞處于未分化狀態(tài),當(dāng)卵泡顆粒細(xì)胞開始分化時(shí)FSHRmRNA含量升高,垂體前葉釋放的FSH增多,通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入卵巢卵泡,小黃卵泡被選擇進(jìn)入等級(jí)卵泡序列[11]。另外,在家禽卵巢發(fā)育過(guò)程中,左側(cè)卵巢比右側(cè)卵巢的FSHR表達(dá)量高,從而使左側(cè)卵巢優(yōu)先發(fā)育,因此FSHR也對(duì)家禽卵巢的不對(duì)稱發(fā)育產(chǎn)生影響[12-13]。已有的研究表明,FSHR啟動(dòng)子區(qū)的-868位點(diǎn)的一個(gè)200 bp的插入缺失突變與新楊褐雞[14-15]的開產(chǎn)日齡有關(guān)。本研究對(duì)該位點(diǎn)在瑯琊雞群體中的多態(tài)性及其遺傳效應(yīng)進(jìn)行分析,為瑯琊雞的保種和開發(fā)應(yīng)用服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及其基因型檢測(cè)

該研究所用382只瑯琊雞母雞飼養(yǎng)于山東紀(jì)華家禽育種股份有限公司瑯琊雞原種雞場(chǎng),所用雞只來(lái)自同一雞舍,飼養(yǎng)條件一樣,單籠飼養(yǎng),自由采食,光照采用16D+8L。對(duì)每只雞分別記錄開產(chǎn)日齡(AFE)和每天的產(chǎn)蛋數(shù),然后統(tǒng)計(jì)32周的產(chǎn)蛋數(shù)(E32)、47周的產(chǎn)蛋數(shù)(E47)、最大連續(xù)產(chǎn)蛋天數(shù)(MCS)和平均連續(xù)產(chǎn)蛋天數(shù)(ACL)。雞FSHR基因-868位點(diǎn)的基因型檢測(cè)參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。具體步驟如下:取血樣20 μL,采用天根血液基因組DNA提取試劑盒(DP348)提取雞血液基因組DNA,用Eppendorf Bio-Photoeter plus分光光度計(jì)并結(jié)合1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。參照文獻(xiàn)[14]設(shè)計(jì)-868位點(diǎn)200 bp插入缺失多態(tài)性檢測(cè)的引物-868F和-868R(表1)。PCR反應(yīng)體系為20 μL:ddH2O 14.5 μL,10×Ex Taq Buffer 2 μL,dNTP mixture 1.6 μL,上、下游引物各0.4 μL,ExTaqDNA聚合酶0.1 μL和基因DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 10 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1.2 組織樣品采集

隨機(jī)選取相同日齡、正常產(chǎn)蛋的FSHR基因-868位點(diǎn)3種基因型的瑯琊雞母雞各3只,按照山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物福利的要求屠宰(No.: SDAUA-2021-097),分別取卵巢、等級(jí)前卵泡和等級(jí)卵泡,凍存于液氮中,用于FSHR基因表達(dá)的分析。

1.3 組織總RNA的提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用RNA Easy Fast 動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒(DP451)提取瑯琊雞等級(jí)前卵泡、等級(jí)卵泡以及卵巢組織的總RNA,用Eppendorf Bio-Photoeter plus分光光度計(jì)并結(jié)合1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的純度和濃度。用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,利用特異性引物(表1)[14]進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),檢測(cè)FSHR基因mRNA在等級(jí)前、等級(jí)卵泡及卵巢中的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)定量PCR體系包括2×SYBR Green ProTaqHS Premix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA 2 μL和ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);熔解曲線條件為95 ℃ 1 s,57 ℃ 30 s,95 ℃ 1 s。

1.4 蛋白提取及Western Blotting

用碧云天生物技術(shù)公司的Western及IP細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑(每1 mL裂解液加入20 μL蛋白酶抑制劑)分別處理雞等級(jí)前卵泡、等級(jí)卵泡及卵巢組織,提取總蛋白,用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)測(cè)定蛋白濃度。在進(jìn)行Western Blotting之前,金屬浴 100 ℃ 10 min對(duì)組織蛋白進(jìn)行變性,蛋白上樣量為30 μg。采用碧云天BeyoGelTMPLUS PAGE預(yù)制膠,110 V 約1.5 h進(jìn)行電泳;利用新賽美的快速轉(zhuǎn)膜液400 mA 20 min轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜完成后用快速封閉液在搖床下封閉10 min,再用PBS洗3次,每次10 min;用通用型抗體稀釋液分別稀釋目的一抗(FSHR Rabbit Polyclonal antibody,proteintech)和內(nèi)參一抗(GAPDH抗體,小鼠單抗,碧云天);稀釋比例1∶1 000,在搖床下分別孵育2 h,孵育完成后用PBS洗膜3次,每次10 min;二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L);顯影用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在C300凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行。根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)下所顯示出的蛋白條帶,用分析軟件Image J對(duì)條帶灰度值分析FSHR蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用EXCEL計(jì)算瑯琊雞群體在-868位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率,并進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡分析。用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件包中的一般線性模型分析基因型與產(chǎn)蛋性狀的關(guān)系。對(duì)于qRT-PCR和Western Blotting,每個(gè)樣本的結(jié)果至少重復(fù)3次,數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,用單因素方差分析進(jìn)行組間的差異顯著性分析,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 瑯琊雞FSHR 5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)多態(tài)性

以檢測(cè)符合要求的瑯琊雞基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可以區(qū)分出3種基因型,即插入純合型(I+I+)、缺失純合型(I-I-)和雜合型(I+I-)(圖1)。

1.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),從上到下分別為2 000、1 000、750、500、250和100 bp;2、6、8、9、10. 基因型I-I-;11. 基因型I+I+;3、4、5、7.基因型I+I- 1. DNA marker, from up to down: 2 000, 1 000, 750, 500, 250 and 100 bp; 2, 6, 8, 9, 10. Genotype I-I- ; 11. Genotype I+I+; 3, 4, 5, 7. Genotype I+I-圖1 瑯琊雞FSHR 5′調(diào)控區(qū)-868多態(tài)性位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增(1%瓊脂糖凝膠)Fig.1 PCR amplification of the 5′-regulatory region at -868 polymorphic site of FSHR gene in Langya chicken (1% agarose)

對(duì)382只瑯琊雞群體FSHR5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)處的等位基因和基因型頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,并進(jìn)行Hardy-Weinberg群體遺傳平衡學(xué)分析。由表2可見,此位點(diǎn)3種基因型個(gè)體均存在,I-為優(yōu)勢(shì)等位基因,群體顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。

表2 FSHR 5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)在瑯琊雞群體中的基因型和等位基因頻率分布Table 2 Genotype and allelic frequencies at the -868 polymorphic site in the 5′-regulatory region of FSHR gene in Langya chicken population

2.2 瑯琊雞FSHR 5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)多態(tài)性與產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)分析

對(duì)FSHR5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)多態(tài)性與382只具有產(chǎn)蛋記錄的瑯琊雞進(jìn)行的關(guān)聯(lián)分析表明(表3):不同基因型個(gè)體的開產(chǎn)日齡(AFE)、32周產(chǎn)蛋數(shù)(E32)和平均連產(chǎn)天數(shù)(ACL)的差異不顯著(P>0.05),但47周產(chǎn)蛋數(shù)(E47)的差異顯著(P<0.05),I+I-基因型個(gè)體的E47顯著高于I-I-基因型個(gè)體;最大連產(chǎn)天數(shù)(MCS)差異顯著(P<0.01),I+I+和I+I-基因型個(gè)體的MCS顯著高于I-I-基因型個(gè)體。

進(jìn)一步分析了不同基因型瑯琊雞換羽后134天的產(chǎn)蛋量,結(jié)果表明(表4),-868位點(diǎn)對(duì)換羽后產(chǎn)蛋量的影響顯著(P<0.05),I-I-基因型個(gè)體產(chǎn)蛋數(shù)在3種基因型中最低,I+I-基因型個(gè)體換羽后134天的產(chǎn)蛋數(shù)(134D)顯著高于I-I-基因型個(gè)體(P<0.05)。

2.3 5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)不同基因型FSHR基因的表達(dá)對(duì)比

在等級(jí)前卵泡中,I+I+基因型個(gè)體的FSHRmRNA表達(dá)水平顯著高于I-I-基因型個(gè)體(P<0.05),蛋白水平差異不顯著(圖2)。FSHR的mRNA和蛋白表達(dá)水平在3種基因型個(gè)體的等級(jí)卵泡中以I-I-基因型個(gè)體最低,但在3種基因型間差異不顯著(P>0.05)(圖3)。在除卵泡外的卵巢組織中,I-I-基因型個(gè)體的FSHRmRNA表達(dá)水平較低,但與其他基因型差異不顯著(P> 0.05);I+I-基因型個(gè)體蛋白水平顯著高于I-I-基因型個(gè)體(P<0.05)(圖4)。

表3 FSHR 5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)多態(tài)性與瑯琊雞產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 3 Association analysis of the -868 locus polymorphism in the 5′ regulatory region of FSHR with egg laying traits in Langya chickens

表4 FSHR 5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)多態(tài)性與瑯琊雞換羽后134天產(chǎn)蛋量的關(guān)聯(lián)分析Table 4 Association analysis of the -868 locus polymorphism in the 5′ regulatory region of FSHR with egg number at 134 days after moulting in Langya chickens

*.P<0.05,下同 *.P<0.05, the same as below圖2 FSHR mRNA(A)和蛋白(B)在雞等級(jí)前卵泡中的表達(dá)Fig.2 The expression of the FSHR mRNA (A) and protein (B) in chicken pre-hierarchical follicles

圖4 FSHR mRNA(A)和蛋白(B)在雞卵巢中的表達(dá)Fig.4 The expression of the FSHR mRNA (A) and protein (B) in chicken ovaries

3 討 論

鑒于FSH在動(dòng)物生殖中的重要作用,人們對(duì)其受體FSHR的多態(tài)性有廣泛的研究,尤其在與人的不孕不育的關(guān)系方面,包括女性的多囊卵巢綜合征、卵巢功能低下[16-25]以及男性的不育癥[26]; 而在家畜FSHR多態(tài)性的研究相對(duì)較少。研究表明,FSHR外顯子10的多態(tài)性影響皖南黑豬和巴克夏豬的產(chǎn)仔數(shù)[27], 外顯子1的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)影響小梅山豬的產(chǎn)仔數(shù)[28], 另外3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(74、532 和1 166)影響豬的黃體數(shù)[29];綿羊FSHR的多態(tài)性影響其mRNA的降解和轉(zhuǎn)錄活性[30-31],也與其產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)[32-33];牛FSHR5′側(cè)翼區(qū)也存在一處多態(tài)性[34]。

在最初對(duì)雞FSHR多態(tài)性的研究中,發(fā)現(xiàn)其5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)存在200 bp的插入/缺失突變,所分析的魯禽雞群體中插入型純合子(I+I+)最少,不同基因型32周(E32)和42周(E42)產(chǎn)蛋數(shù)差異不顯著,但I(xiàn)-I-基因型個(gè)體的產(chǎn)蛋量最低[15]。進(jìn)一步對(duì)文昌雞群體的研究顯示,此位點(diǎn)對(duì)開產(chǎn)日齡(AFE)和39周產(chǎn)蛋數(shù)的效應(yīng)未達(dá)到顯著水平,I-I-基因型個(gè)體的產(chǎn)蛋量亦最低;又對(duì)新楊褐蛋雞群體進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)對(duì)AFE有顯著影響,I-I-基因型個(gè)體開產(chǎn)較早[14]。在另一項(xiàng)對(duì)蘇墾雞的研究中,I-為優(yōu)勢(shì)等位基因,I-I-基因型個(gè)體的開產(chǎn)日齡顯著早于I+I+基因型個(gè)體[35]。本研究對(duì)382只瑯琊雞FSHR5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)處的多態(tài)性分析表明,I-I-基因型頻率最高,I-為此位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因;對(duì)瑯琊雞AFE和E32的效應(yīng)不顯著,但對(duì)E47的效應(yīng)顯著,且I-I-基因型個(gè)體的產(chǎn)蛋量顯著低于I+I-基因型個(gè)體;對(duì)最大連產(chǎn)天數(shù)(MCS)的效應(yīng)達(dá)到極顯著水平,且I-I-基因型顯著低于其它基因型。綜合上述結(jié)果,推測(cè)該位點(diǎn)處200 bp的插入通過(guò)影響MCS影響瑯琊雞的E47。為了分析強(qiáng)制換羽是否影響FSHR不同基因型的效應(yīng),進(jìn)一步對(duì)-868位點(diǎn)與瑯琊雞換羽后的產(chǎn)蛋量進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果也表明,I-I-基因型個(gè)體在換羽后134天的產(chǎn)蛋數(shù)顯著低于I+I-基因型個(gè)體。

為了探討該位點(diǎn)影響雞產(chǎn)蛋性能的分子機(jī)制,進(jìn)一步比較了瑯琊雞FSHR5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)不同基因型個(gè)體卵泡和卵巢中FSHR的表達(dá)水平。qRT-PCR的結(jié)果顯示,在等級(jí)前卵泡中I+I+基因型個(gè)體的FSHRmRNA表達(dá)量最高,I-I-基因型個(gè)體最低且顯著低于I+I+基因型個(gè)體,這與在新楊褐雞群中FSHRmRNA在小白和小黃卵泡中的分析結(jié)果基本一致[14]。本研究又進(jìn)一步在瑯琊雞等級(jí)卵泡及卵巢上進(jìn)行了上述的比較,發(fā)現(xiàn)不同基因型間的差異雖未達(dá)到顯著水平但是I-I-基因型個(gè)體的FSHRmRNA表達(dá)量仍最低。在蛋白水平上,Western Blotting的檢測(cè)結(jié)果顯示FSHR5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的差異與mRNA的變化基本一致,I-I-基因型個(gè)體的FSHR蛋白表達(dá)量最低。有對(duì)北京油雞FSHR基因多態(tài)性與其mRNA水平關(guān)系的研究[36],但沒有涉及本研究報(bào)道的位點(diǎn)。

從以上對(duì)瑯琊雞-868位點(diǎn)多態(tài)性的分析能夠看出,I+I+基因型個(gè)體所對(duì)應(yīng)的后期產(chǎn)蛋量要比I-I-基因型個(gè)體多,I-I-基因型個(gè)體的開產(chǎn)日齡有早于I+I+基因型個(gè)體的趨勢(shì)。本研究對(duì)瑯琊雞群體FSHR不同基因型個(gè)體產(chǎn)蛋性能分析的結(jié)果顯示,I+I-基因型個(gè)體的47周產(chǎn)蛋數(shù)(E47,n=382)、換羽后134天產(chǎn)蛋數(shù)(134D,n=269)顯著高于其它兩種基因型個(gè)體。推測(cè)可能與等位基因間的互作有關(guān),其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。雜種優(yōu)勢(shì)的利用成為畜牧業(yè)生產(chǎn)和新品種培育的重要手段之一,一般是指利用不同品種或者同品種間的不同純系親本進(jìn)行雜交得到雜種第一代,其表現(xiàn)出的特征要優(yōu)于純系親本。在雞產(chǎn)蛋性能方面,大骨雞GDF9基因第二外顯子SNP G1609T位點(diǎn)雜合型個(gè)體的產(chǎn)蛋量及蛋重方面較高[37];在京海黃雞GDF9基因多態(tài)性中,g.2420T> C這個(gè)位點(diǎn)的雜合型C2T2在300日齡時(shí)平均蛋重顯著高于T2T2純合型[38]。與本研究結(jié)果相似。

在家禽中,除了雞以外,也有對(duì)番鴨FSHR多態(tài)性的研究,共發(fā)現(xiàn)16個(gè)SNPs,其中位于編碼區(qū)的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(A227G和C320T)分別與59周的產(chǎn)蛋數(shù)、開產(chǎn)日齡有關(guān)[39]。作為一個(gè)古老的地方雞品種,瑯琊雞在產(chǎn)蛋性能方面需要進(jìn)行選育提高?，F(xiàn)有雞群中I+I+和I+I-基因型的個(gè)體約占50%。通過(guò)基因型檢測(cè)和定向選配,逐步淘汰I-I-基因型個(gè)體,群體中I+的頻率會(huì)越來(lái)越高,從而能夠提高瑯琊雞整體的產(chǎn)蛋性能。此外,在以瑯琊雞為親本的優(yōu)質(zhì)雞育種中,選擇I+I+和I+I-基因型個(gè)體也可以提高父母代雞的產(chǎn)蛋性能。

4 結(jié) 論

本研究分析了瑯琊雞FSHR基因-868位點(diǎn)的多態(tài)性及其遺傳效應(yīng),發(fā)現(xiàn)FSHR5′調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)瑯琊雞E47和MCS效應(yīng)顯著,亦對(duì)換羽后134 d的產(chǎn)蛋量產(chǎn)生顯著影響,I+I+基因型個(gè)體的FSHR表達(dá)量較高。通過(guò)基因型選擇逐步降低I-等位基因頻率,預(yù)期可以提高瑯琊雞的產(chǎn)蛋性能。