郜平平,付金玉,王麗仰,史碩博*,張躍平*,張 迪*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 100193;2.北京化工大學(xué)北京軟物質(zhì)科學(xué)與工程高精尖創(chuàng)新中心,北京 100029)

皮膚癬菌病是由致病性真菌引起的淺表皮膚病[1]。犬小孢子菌(Microsporumcanis, Mc)、石膏樣小孢子菌(Nanniziagypsea, Ng)和須毛癬菌(Trichophytonmentagrophytes, Tm)是導(dǎo)致犬貓皮膚癬菌病的最常見的病原微生物[2]?；疾游锏呐R床表現(xiàn)不一,典型癥狀是圓形或不規(guī)則的脫毛灶、伴有不同程度的皮屑[3]。皮膚癬菌病是一種自限性的疾病,大多數(shù)動物經(jīng)過有效的治療后在數(shù)周至數(shù)月內(nèi)即可痊愈[4]。但該病會影響動物的生活質(zhì)量,且具有傳染性,對公共安全造成一定的影響[5-6]。因此,快速、準(zhǔn)確的診斷對及時治療和防止皮膚癬菌病的傳播具有重要意義[7]。目前,皮膚癬菌病的診斷方法有伍德氏燈檢查、直接鏡檢、真菌培養(yǎng)及PCR檢測[2]。伍德氏燈檢查和直接鏡檢的假陽性和假陰性均較高[5];真菌培養(yǎng)的準(zhǔn)確率較高,但培養(yǎng)所需時間約2周,耗時較長[8]。通過PCR技術(shù)擴(kuò)增皮膚癬菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)區(qū)域的特異性序列,可以在2～3 h內(nèi)得到結(jié)果,且敏感性和特異性均較高[9],但這種方法所需儀器較為昂貴、操作繁瑣、對人員要求高,在寵物臨床上使用具有局限性[10]。從上述對臨床常用檢測方法的分析可知,目前寵物臨床缺少一種敏感性和特異性均較高的現(xiàn)場快速檢測方法。

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)技術(shù)是近年來熱門的高特異性基因編輯技術(shù)及檢測技術(shù)[11]。CRISPR-Cas12a系統(tǒng)是由RNA引導(dǎo)的DNA靶向的CRISPR系統(tǒng)[12]。Cas12a-crRNA復(fù)合物可特異性識別靶標(biāo)雙鏈DNA,并激活Cas12a的反式核酸酶切割活性,不加區(qū)分地切割任意單鏈DNA(single-stranded DNA, ssDNA)[13]。利用其反式切割后的信號放大特性,通過篩選適宜的靶標(biāo)核酸并設(shè)計高效信號報告分子,即可實現(xiàn)特定病原菌的高靈敏度、高特異性和低成本檢測[14]。目前,研究人員已經(jīng)開發(fā)了多種用于病原菌檢測的CRISPR-Cas12生物傳感新平臺,包括DETECER[15]、HOLMES[16]及HUDSON[17]等。通過結(jié)合等溫擴(kuò)增技術(shù),如重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification, RPA)[18]或環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[19-21],實現(xiàn)了病原菌的靈敏、特異性檢測[22]。本研究建立了一種基于RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù)檢測犬貓三種常見皮膚癬菌的方法(圖1),以期快速診斷犬貓皮膚癬菌病。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

須毛癬菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC28185)及石膏樣小孢子菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC14683)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院外科實驗室提供,作為須毛癬菌和石膏樣小孢子菌的前期試驗菌株。選取一株經(jīng)真菌培養(yǎng)及測序確定為犬小孢子菌的臨床分離菌株作為犬小孢子菌的前期試驗菌株。

1.2 臨床樣本的采集、處理及鑒定

檢測步驟如下:(1)從犬貓病灶樣本中提取DNA;(2)用RPA擴(kuò)增靶基因;(3)Cas12a反應(yīng);(4)在藍(lán)光下肉眼觀察熒光信號。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖 The detection steps are as follows: (1) Extraction of DNA from focus samples of dogs and cats; (2) Amplification the target gene by RPA method; (3) Cas12a reaction; (4) Observation of fluorescence signal under blue light by the naked eyes.The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖1 利用RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù)檢測犬貓皮膚癬菌的示意圖Fig.1 Schematic of detection of dermatophytes in dogs and cats by RPA-CRISPR/Cas12a

使用無菌棉拭子、拔毛或膠帶粘貼法采集23例皮膚癬菌患病動物病灶處或病灶邊緣的毛發(fā)及皮屑,皮膚癬菌患病動物均通過伍德氏燈檢查、直接鏡檢和真菌培養(yǎng)進(jìn)行確診,另外采集1份未患有皮膚癬菌病的貓的毛發(fā)作為陰性對照。每份臨床樣本均分為2份,一份用于提取DNA,提取方法為向臨床樣本中加入50 μL提取緩沖液(50 mmol·L-1NaOH,1 mol·L-1Tris-HCl,pH 8.0),95 ℃加熱10 min,12 000 r·min-1離心5 min,上清即為提取的DNA;另一份接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud’s agar, SDA),30 ℃培養(yǎng)10～14 d,取少量菌絲用乳酸酚棉藍(lán)染色后,通過鏡檢觀察大分生孢子形態(tài)進(jìn)行初步鑒定。使用ITS1/ITS4引物(表1)對真菌菌落進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR產(chǎn)物測序后,通過NCBI blast 比對分析,以鑒定真菌種類。

表1 引物及crRNA序列Table 1 Primers and crRNA used in this study

1.3 主要試劑及儀器

SDA培養(yǎng)基及乳酸酚棉藍(lán)染色液購自北京索萊寶科技有限公司;Twist-Amp Basic試劑盒購自英國TwistDX公司;T7高產(chǎn)率轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司;RNA Clean &Concentrator TM-5購自美國Zymo Research生物科技公司;Q5高保真聚合酶、RNA酶抑制劑及NEB緩沖液購自美國紐英倫生物科技公司;Cas12a(FrancisellatularensisCas12a)按照本實驗室前期的表達(dá)純化方法,使用大腸桿菌表達(dá)并通過鎳柱進(jìn)行純化[23];引物、ssDNA的合成及基因測序均交由生工(中國上海)生物工程有限公司完成;Nano Drop 2000C購自美國賽默飛世爾科技公司;Azure C300凝膠成像系統(tǒng)購自美國Azure Biosystems公司。

1.4 PCR、RPA引物及crRNA的設(shè)計及合成

根據(jù)犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌及須毛癬菌ITS的基因序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號分別如下:犬小孢子菌AF168127.1,石膏樣小孢子菌NR_131271.1,須毛癬菌MH858319.1),設(shè)計可同時識別犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌及須毛癬菌的crRNA(crRNA-DM),以及可分別特異性識別犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌及須毛癬菌的crRNA(crRNA-Mc、crRNA-Ng及crRNA-Tm)。根據(jù)crRNA所在的區(qū)域,設(shè)計可同時擴(kuò)增上述三種皮膚癬菌的PCR引物及RPA引物(表1)。

使用crRNA引物,通過DNA退火方案形成crRNA轉(zhuǎn)錄模板。使用T7高產(chǎn)率轉(zhuǎn)錄試劑盒37 ℃過夜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,使用RNA Clean&ConcentratorTM-5純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。用Nano Drop 2000C進(jìn)行檢測并定量,分裝保存至-80 ℃。

1.5 CRISPR/Cas12a檢測方法的建立

使用PCR-F/PCR-R引物對(表1),利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶基因。采用25 μL PCR反應(yīng)體系:5 μL 5 ×Q5反應(yīng)緩沖液、0.5 μL dNTPs、各1.25 μL的上、下游引物、0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶、5 μL 5 ×Q5 High GC Enchaner、9.75 μL ddH2O和2 μL DNA模板。擴(kuò)增條件:98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,58 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,共35個循環(huán);最后72 ℃延伸2 min。

分別使用crRNA-DM、crRNA-Mc、crRNA-Ng及crRNA-Tm進(jìn)行CRISPR/Cas12a反應(yīng)以檢測犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌和須毛癬菌前期試驗菌株。Cas12a反應(yīng)體系20 μL:其中包含500 nmol·L-1Cas12a,500 nmol·L-1crRNA,2 μL擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物,500 nmol·L-1ssDNA(FAM-GATCAAGAGCTA-BHQ1),0.5 μL RNA酶抑制劑,1.5 μL NEB r3.1緩沖液。該反應(yīng)在37 ℃孵育15 min,并使用多標(biāo)記微孔板檢測儀檢測熒光信號量。將Cas12a反應(yīng)產(chǎn)物置于Azure C300凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行目測,觀察顏色變化。

1.6 CRISPR/Cas12a檢測靈敏度評價

使用PCR-F/PCR-R引物對擴(kuò)增犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌和須毛癬菌試驗菌株,通過PCR純化試劑盒(OMEGA)純化擴(kuò)增產(chǎn)物,用Nano Drop 2000C進(jìn)行定量。將PCR產(chǎn)物梯度稀釋(0.1、1、10和100 nmol·L-1),參與Cas12a反應(yīng)。

1.7 RPA-CRISPR/Cas12a檢測靈敏度評價

使用不同拷貝數(shù)(100、101、102、103、104、105、106和107)的上述純化后的PCR產(chǎn)物作為RPA反應(yīng)的模板,使用Twist-Amp Basic試劑盒進(jìn)行RPA擴(kuò)增,39 ℃反應(yīng)15 min。取2 μL RPA反應(yīng)產(chǎn)物參與Cas12a反應(yīng)。

1.8 RPA-CRISPR/Cas12a檢測臨床樣本的敏感性與特異性評價

用RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù)檢測從24份臨床樣本中直接提取的DNA,并與標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果進(jìn)行比較,以評價Cas12a檢測方法的敏感性和特異性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CRISPR/Cas12a檢測方法的建立

分別使用crRNA-DM、crRNA-Mc、crRNA-Ng及crRNA-Tm檢測犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌和須毛癬菌前期試驗菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。crRNA-DM可以在DNA模板為犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌及須毛癬菌時均出現(xiàn)熒光量的明顯升高,而crRNA-Mc、crRNA-Ng及crRNA-Tm僅在DNA模板分別為犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌及須毛癬菌時才會出現(xiàn)熒光量的明顯升高,且熒光量與陰性對照相比差異極顯著(P<0.001)(圖2A～D),肉眼觀察可見靶標(biāo)基因參與的反應(yīng)熒光明顯,非靶標(biāo)基因和陰性對照參與的反應(yīng)幾乎不可見熒光(圖2E～H)。因此,將熒光量與陰性對照相比差異極顯著(P<0.001)的檢測結(jié)果判定為陽性。

2.2 CRISPR/Cas12a的檢測靈敏度

使用不同濃度的靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Cas12a反應(yīng)。對于crRNA-Tm和crRNA-Mc,當(dāng)靶基因濃度≥10 nmol·L-1時,試驗組與對照組的熒光信號差異極顯著(P<0.001)(圖3A、B)。對于crRNA-DM和crRNA-Ng,當(dāng)靶基因濃度≥100 nmol·L-1時,試驗組與對照組的熒光信號差異極顯著(P<0.001)(圖3C、D)。結(jié)果顯示,CRISPR/Cas12a的檢測靈敏度可低至10～100 nmol·L-1。

A.D. 分別為使用crRNA-Tm、crRNA-Mc、crRNA-Ng及crRNA-DM的熒光檢測結(jié)果。Ct為不含目的基因的陰性對照。***.P<0.001 A-D. Fluorescence detection results of crRNA-Tm, crRNA-Mc, crRNA-Ng and crRNA-DM respectively. Ct, negative control without the target DNA.***.P<0.001圖3 CRISPR/Cas12a熒光報告系統(tǒng)的檢測靈敏度Fig.3 Detection sensitivity of the CRISPR/Cas12a fluorescence reporting system

A.C. RPA-CRISPR/Cas12a的熒光檢測結(jié)果;D～F. A～C所對應(yīng)的目視檢查結(jié)果。Ct為不含目的基因的陰性對照。***.P<0.001 A-C. Fluorescence detection of RPA-CRISPR/Cas12a; D-F. Visual detection to figures A-C. Ct, negative control without the target DNA. ***.P<0.001圖4 RPA-CRISPR/Cas12a熒光報告系統(tǒng)的檢測靈敏度Fig.4 Detection sensitivity of the RPA-CRISPR/Cas12a fluorescence reporting system

2.3 RPA-CRISPR/Cas12a的檢測靈敏度

將靶基因進(jìn)行10倍梯度稀釋后,進(jìn)行RPA-CRISPR/Cas12a檢測。當(dāng)使用100～107個拷貝的靶基因參與反應(yīng)時,試驗組和無模板對照組的熒光值均存在顯著性差異(P<0.001)(圖4A～C)。肉眼觀察可見試驗組的每個反應(yīng)均有非常明顯的熒光信號,且與無模板對照組差別明顯(圖4D～F)。結(jié)果表明,RPA-CRISPR/Cas12a的檢測靈敏度可低至單個拷貝。

2.4 臨床樣本RPA-CRISPR/Cas12a檢測效果評價

共采集了24份臨床樣本用于評價RPA-CRISPR/Cas12a檢測方法的敏感性和特異性。1～23號樣本伍德氏燈檢查結(jié)果均為陽性(4號和6號樣本未進(jìn)行伍德氏燈檢查),直接鏡檢均可見小分生孢子或菌絲,經(jīng)真菌培養(yǎng)、使用ITS1/ITS4引物對擴(kuò)增真菌ITS區(qū)域及測序后均鑒定為犬小孢子菌(圖5)。24號樣本上述檢查均為陰性。對24份臨床樣本直接提取基因組DNA后,進(jìn)行RPA-CRISPR/Cas12a檢測。使用crRNA-DM參與反應(yīng)時,除24號樣本外,其余23個樣本的試驗組和對照組的熒光值差異顯著(P<0.001),肉眼觀察可見試驗組熒光信號均非常明顯,且與陰性對照差別明顯。使用crRNA-Mc參與反應(yīng)時可得到與crRNA-DM相同的結(jié)果。使用crRNA-Tm和crRNA-Ng參與反應(yīng)時,24個樣本的試驗組和對照組均未見明顯的熒光信號。RPA-CRISPR/Cas12a成功檢測到了臨床樣本中的23例犬小孢子菌陽性樣本和1例皮膚癬菌陰性樣本。結(jié)果表明,對于crRNA-DM和crRNA-Mc,RPA-CRISPR/Cas12a檢測方法具有100%的敏感性和100%特異性(表2)。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～23. 對23例臨床樣本培養(yǎng)菌落的ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的目的片段;Ct. 空白對照 M. DL2000 DNA marker; 1-23. PCR products of the ITS region of colony culture from 1 to 23 clinical samples; Ct. blank control without any DNA target圖5 23例皮膚癬菌菌落ITS區(qū)域的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR products of ITS region of dermatophyte colonies in 23 cases

表2 RPA-CRISPR/Cas12a檢測的敏感性與特異性評價Table 2 Evaluation of the sensitivity and specificity of RPA-CRISPR/Cas12a detection

3 討 論

皮膚癬菌病是一種由親動物性、親土性或親人性的致病性真菌引起的淺表皮膚病。在貓中,超過90%的皮膚癬菌病是由犬小孢子菌引起的[5,24],而石膏樣小孢子菌和須毛癬菌則不太常見[25],英國的一項研究表明,在35年里,由石膏樣小孢子菌導(dǎo)致的犬皮膚癬菌病的占比不到1%[26]。本研究共從寵物臨床采集到23例犬貓皮膚癬菌臨床樣本,經(jīng)真菌培養(yǎng)和測序均鑒定為犬小孢子菌。在本研究的樣本采集范圍內(nèi),犬小孢子菌感染更為常見,而石膏樣小孢子菌和須毛癬菌感染相較而言不太常見。

犬小孢子菌等皮膚癬菌不屬于健康犬貓正常菌群的一部分,一旦獸醫(yī)從健康動物的被毛中分離得到皮膚癬菌,則提示該動物正處于亞臨床感染狀態(tài)或者該動物是病原真菌的攜帶者[1]。目前臨床傳統(tǒng)的診斷方法主要包括伍德氏燈檢查、直接鏡檢和真菌培養(yǎng),臨床上對皮膚癬菌病的診斷主要通過一系列互補(bǔ)的診斷方式聯(lián)合應(yīng)用,尚無明確的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]。伍德氏燈檢查非常方便,但其假陽性和假陰性率均較高。30%～100%犬小孢子菌感染的毛發(fā)在伍德氏燈下能發(fā)出蘋果綠色的熒光[2,27],這些熒光來自犬小孢子菌產(chǎn)生的水溶性代謝物——蝶啶,而石膏樣小孢子菌和須毛癬菌感染的毛發(fā)缺乏熒光[1]。此外,一些外用藥物、碎屑等可能會產(chǎn)生假陽性結(jié)果[5]。研究表明伍德氏燈檢測皮膚癬菌的敏感性和特異性分別為37.5%和96.1%[28]。直接鏡檢是一種相對簡單、快速的診斷方法,但其容易受到采樣技術(shù)、判讀技術(shù)等的影響,導(dǎo)致誤診或漏診的可能。據(jù)評價,該檢測方法的敏感性為59%[5],假陰性率為5%～15%[27]。過去認(rèn)為真菌培養(yǎng)是皮膚癬菌診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但真菌培養(yǎng)耗時較長,難以及時獲得診斷結(jié)果,可能會延誤治療。操作人員的采樣技術(shù)不熟練、接種技術(shù)不正確以及缺乏有經(jīng)驗的專業(yè)人員對培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行評價都可能造成假陽性和假陰性結(jié)果[29]。基于PCR技術(shù)的分子學(xué)診斷方法較為快速準(zhǔn)確,敏感性和特異性均較高[10,30-31]。有研究使用實時熒光定量PCR技術(shù)診斷132只貓是否患有犬小孢子菌導(dǎo)致的皮膚癬菌病,結(jié)果表明這種檢測方法的敏感性為100%,特異性為88.5%[32]。因樣本類型、樣品制備和實驗室條件都與PCR的診斷結(jié)果直接相關(guān),且這種方法所需儀器較為昂貴、操作繁瑣、對人員要求較高[33],在寵物臨床使用具有局限性。實驗室前期曾利用RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù)檢測犬貓皮膚癬菌病,其敏感性和特異性均為100%[23]。但其只針對犬小孢子菌和須毛癬菌,并不能特異性診斷出石膏樣小孢子菌。雖然石膏樣小孢子菌導(dǎo)致的皮膚癬菌病相對占比較低,但其仍然是導(dǎo)致犬貓皮膚癬菌病最常見的病原微生物之一,不容忽視。在本文中,作者首次建立了能夠同時檢測三種皮膚癬菌及特異性檢測石膏樣小孢子菌的RPA-CRISPR/Cas12a的檢測方法。

針對犬貓皮膚癬菌的RPA-CRISPR/Cas12a方法,通過使用不同的crRNA,可以同時或分別檢測到犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌和須毛癬菌。本方法的檢測靈敏度可低至單拷貝,且Cas12a-crRNA復(fù)合物只有在識別到特異性靶標(biāo)時,才能激活其切割活性,這使得本檢測方法具有很高的特異性。使用crRNA-DM和crRNA-Mc對犬貓臨床樣本進(jìn)行檢測時,敏感性和特異性均為100%。因在試驗周期內(nèi)暫未收集到石膏樣小孢子菌和須毛癬菌的臨床樣本,不能準(zhǔn)確地對crRNA-Ng和crRNA-Tm的敏感性和特異性進(jìn)行評價,但使用其對菌落PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測時,crRNA-Ng或crRNA-Tm能夠特異性檢測到石膏樣小孢子菌或須毛癬菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,而不能檢測到非靶標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物,說明crRNA-Ng和crRNA-Tm在檢測皮膚癬菌時效果較好。后續(xù)需要收集更多的臨床樣本來驗證本檢測方法的敏感性和特異性。RPA-CRISPR/Cas12a檢測方法僅需30 min、在37 ℃下即可完成反應(yīng),所需儀器簡單,在獸醫(yī)快速檢測疑似皮膚癬菌感染的病例上極具應(yīng)用潛力。

4 結(jié) 論

RPA-CRISPR/Cas12a熒光法可快速檢測犬貓皮膚癬菌病,可同時或分別檢測犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌和須毛癬菌。本檢測方法所需時間短,敏感性和特異性高,且無需昂貴儀器,適用于臨床犬貓皮膚癬菌病的快速診斷。