李林燕,滕 蔓,劉金玲,鄭鹿平,柴書軍,丁 軻,余祖華*,羅 俊*

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院,功能微生物與畜禽健康實驗室,洛陽 471003;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物 免疫學(xué)重點實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物免疫學(xué)重點實驗室,河南省動物免疫學(xué)重點實驗室,鄭州 450002; 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,中英禽病國際研究中心,鄭州 450002)

馬立克病(Marek’s disease,MD)是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)早期感染雛雞引起的一種重要的家禽免疫抑制病和淋巴細胞增生性腫瘤病,通常以外周神經(jīng)、虹膜、皮膚以及多種內(nèi)臟器官組織的單核細胞浸潤為特征。1907年,Marek首次報道該病,并對主要的臨床癥狀和剖檢病變進行了描述[1]。1961年,為了紀(jì)念Jozef Marek的貢獻,Biggs建議使用Marek’s disease來命名該病[2]。MDV感染不僅可引起嚴(yán)重的免疫抑制、增加其它疫病繼發(fā)感染的風(fēng)險,而且誘發(fā)腫瘤導(dǎo)致大批雞死亡,更是給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。MDV的體內(nèi)感染可分為4個階段:第一階段為早期溶細胞性復(fù)制階段,此時病毒主要殺傷淋巴細胞并引起暫時性或持續(xù)性的免疫抑制,該過程主要取決于病毒株的毒力;第二階段為潛伏感染階段,在感染6～7 d之后,病毒感染進入潛伏期,此時不再檢測到溶細胞性復(fù)制,且腫瘤尚未發(fā)生;第三階段為晚期溶細胞性復(fù)制階段,此階段并不一定都發(fā)生,其發(fā)展及程度取決于宿主的抗病力和MDV毒株的毒力;第四階段最終形成淋巴瘤或不形成淋巴瘤[3-4]。

MDV屬于α皰疹病毒亞科,馬立克病病毒屬。與MD相關(guān)的家禽皰疹病毒主要包括3種:禽皰疹病毒2型(血清1型,MDV-1)、禽皰疹病毒3型(血清2型,MDV-2)和火雞皰疹病毒1型(血清3型,MDV-3/HVT)[5]。除減毒疫苗株之外,只有MDV-1野毒株對宿主具有致病性和致瘤性。按照毒力差異,MDV-1分離株又可分為不同的致病型,包括溫和毒型(mild MDV,mMDV)、強毒型(virulent MDV,vMDV)、超強毒型(very virulent MDV,vvMDV)和特超強毒型(very virulent plus MDV,vv+MDV)[6-7]。如CVI988和CU2毒株屬于mMDV[8-9],JM、GA和HPRS-16毒株屬于vMDV[10-12],Md5、RB-1B和GX0101屬于vvMDV[13-15],648A和625毒株屬于vv+MDV[6]。MD是人類歷史上利用病毒疫苗免疫預(yù)防腫瘤疾病發(fā)生的首個成功案例。但是,隨著MD疫苗在全球長期廣泛的使用,MDV流行毒株的毒力持續(xù)增強,目前vv+MDV和變異株的出現(xiàn)已導(dǎo)致MD疫苗免疫保護失敗,近些年國內(nèi)外MD疫情頻繁暴發(fā),給世界養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展帶來新的挑戰(zhàn)[16-19]。

MD的早期診斷對于該病的有效防控和及時止損至關(guān)重要。MD診斷的經(jīng)典方法包括病毒分離培養(yǎng)、瓊脂擴散試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等。最近10年,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、實時熒光定量PCR、重組酶聚合酶擴增等分子生物學(xué)技術(shù)手段相繼建立[20]。其中,ELISA因操作簡單、檢測快速、敏感性高、特異性強,在動物疫病診斷中的應(yīng)用最為成熟?？贵w制備是建立ELISA方法和開發(fā)試劑盒的重要基礎(chǔ)。1982年,Ikuta等[21]首次利用親和色譜法純化了MDV-1和HVT感染CEF培養(yǎng)物作為免疫原,結(jié)合細胞融合技術(shù)制備了MDV和HVT的單克隆抗體雜交瘤細胞庫,并利用不同方法進行了系統(tǒng)的鑒定和分析。1983年,Lee等[22]用自己研制的單克隆抗體,進行了MDV分離株的血清型分類和鑒定。我國在MDV單抗研制方面起步較晚,直到20世紀(jì)80年代末才開始有學(xué)者進行相關(guān)研究,如利用MDV全病毒制備免疫原免疫小鼠制備了一些單克隆抗體等,但并未對其進行深入鑒定和應(yīng)用[23-24]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,有學(xué)者相繼用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達MDV編碼的gB、gI和pp38蛋白[25],Meq蛋白[26-27]以及gE蛋白[28]等作為免疫原制備相應(yīng)的單克隆抗體。由于MDV基因組比較龐大,編碼上百種病毒蛋白和非編碼RNA[29-30],但目前國內(nèi)外已報道且可有效利用的單克隆抗體還非常少,難以滿足MDV基因功能、致病與致瘤機制等相關(guān)基礎(chǔ)研究和MD診斷技術(shù)開發(fā)的需求。因此,本研究利用MDV嚴(yán)格的細胞結(jié)合增殖特性,分別制備MDV感染CEF細胞核和細胞質(zhì)蛋白免疫原,建立了特異性針對MDV編碼的全病毒蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞庫,并從中篩選和鑒定特定病毒蛋白的特異性單克隆抗體,以期為后續(xù)相關(guān)研究提供關(guān)鍵試劑。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞和實驗動物

MDV疫苗株CVI988、SB-1和HVT,均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室保存。vvMDV標(biāo)準(zhǔn)毒株Md5和GX0101,由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授惠贈。293 T細胞和SP2/0骨髓瘤細胞,均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室保存。用于制備CEF的SPF 種蛋,購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。6～8周齡純系雌性BALB/c小鼠,購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2 培養(yǎng)基、抗體和試劑

M199培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS),購自Gibco公司。1640培養(yǎng)基、蛋白預(yù)制膠、DAPI溶液(即用型),均購自Solarbio公司。NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents、LipofectamineTM2000均購自Thermo Scientific公司。胰蛋白酶-EDTA、蛋白酶抑制劑(100×)和ECL顯色液,購自新賽美公司。雞MDV陽性血清和陰性血清,由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室制備并保存。HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG、DyLight 488標(biāo)記羊抗鼠IgG、DyLight 594標(biāo)記羊抗鼠IgG以及DyLight 594標(biāo)記羊抗雞IgG,均購自Abbkine公司。羊抗鼠β-actin內(nèi)參抗體,購自安諾倫(北京)生物科技有限公司。Western blot膜再生液,購自Solarbio公司。小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒,購自Proteintech公司。切向流超濾離心管,購自 Millipore公司。MDV-1 gB蛋白的真核表達質(zhì)粒pEGFP-gB-N1,根據(jù)vvMDV標(biāo)準(zhǔn)毒株Md5(NCBI參考序列:NC_002 229.3)的gB基因全長序列(2 598 bp)進行密碼子優(yōu)化,由上海尚亞生物科技有限公司設(shè)計、合成并構(gòu)建。

1.3 病毒增殖

取8～10 日齡SPF雞胚制備CEF,細胞計數(shù)后用含5% FBS的M199細胞培養(yǎng)液稀釋,按每瓶15 mL (含8×106個細胞)接種至T75細胞瓶中,置于38.5 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置,過夜培養(yǎng)。待CEF長至匯合單層后,更換含1% FBS的M199細胞維持液,并接種vvMDV毒株Md5,感染96 h待出現(xiàn)大量病毒噬斑后,胰蛋白酶-EDTA消化,1 500 r·min-1離心10 min,收集病毒感染的CEF沉淀備用。

1.4 蛋白制備

用PBS重懸細胞團,轉(zhuǎn)移至15 mL離心管,離心后棄凈PBS。用NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic Extracton Reagents提取病毒感染CEF的細胞核和細胞質(zhì)蛋白,簡述如下:首先加入10 mL冰浴的CER Ⅰ(加100 μL 100 ×蛋白酶抑制劑),大力渦旋15 s充分混懸細胞,冰上孵育10 min;然后加入500 μL冰浴的CER Ⅱ,高速渦旋5 s,冰上孵育1 min;再次高速渦旋5 s,16 000 r·min-1、4 ℃離心5 min。吸取上清,轉(zhuǎn)至預(yù)冷的新離心管中,即為胞質(zhì)提取物。剩余沉淀再次離心,16 000 r·min-1、4 ℃離心5 min,棄凈上清。加入50 mL冰浴的NER(加50 μL 100×蛋白酶抑制劑),渦旋混勻15 s,冰浴10 min,再渦旋15 s,重復(fù)4次。16 000 r·min-1、4 ℃離心10 min,立即轉(zhuǎn)移上清至冰浴的新離心管中,即為胞核提取物。最后,用切向流超濾離心管分別濃縮胞質(zhì)提取物和胞核提取物,分離制備免疫原蛋白。

1.5 動物免疫

將濃縮后的胞質(zhì)提取物和胞核提取物作為免疫原,分別免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠。初次免疫,將免疫原蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化,按50 μg·只-1的蛋白劑量頸背部皮下多點注射BALB/c小鼠。此后每隔3周,將免疫原蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后進行二免和三免,免疫方法和劑量與初免相同。三免后3周,采集免疫鼠尾靜脈全血,進行間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescence assay,IFA)檢測多克隆抗體血清效價。

1.6 細胞融合

選取效價較高的免疫鼠,用總量為100 μg的細胞核或細胞質(zhì)蛋白腹腔注射進行超免。3～5 d后,無痛處死超免小鼠,取脾細胞與生長狀態(tài)良好的SP2/0細胞,按常規(guī)方法進行融合。細胞融合培養(yǎng)7 d后,可在顯微鏡下觀察雜交瘤細胞團是否產(chǎn)生,待細胞團長至細胞孔底面積2/3大小時,取50 μL雜交瘤細胞上清進行IFA檢測。

1.7 間接免疫熒光試驗

CEF細胞計數(shù),用含5% FBS的M199培養(yǎng)基稀釋后,將細胞懸液按100 μL·孔-1(含4.5×104個細胞)鋪至96孔板中,置于38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜,待CEF長至致密單層后棄上清,換含1% FBS的M199細胞維持液,接種Md5病毒種。38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3 d。顯微鏡下觀察細胞狀態(tài),待出現(xiàn)較小病毒噬斑時,棄去培養(yǎng)基,每孔加入50 μL預(yù)冷的甲醇/丙酮(1∶1)固定液,室溫固定10 min后棄凈固定液,用含0.05% Tween-20的PBS溶液(PBST)洗3次,甩凈PBST。每孔加入50 μL含5%脫脂奶的PBST,37 ℃溫箱封閉30 min,甩凈,PBST洗3次,甩凈。每孔加入50 μL雜交瘤細胞上清,37 ℃溫箱孵育30 min,甩凈,PBST洗3次,甩凈。每孔加入50 μL用5%脫脂奶PBS稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶500),37 ℃溫箱孵育30 min,甩凈,PBST洗3～5次,甩凈。每孔加100 μL PBST,剔除氣泡,置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。凡是細胞上清與CEF陰性對照發(fā)生染色反應(yīng)的雜交瘤一律丟棄,僅保留與MDV噬斑發(fā)生特異性陽性反應(yīng)的雜交瘤細胞,用于進一步的篩選和鑒定。

1.8 單克隆抗體血清型特異性鑒定

取僅與MDV噬斑發(fā)生特異性陽性反應(yīng)的的雜交瘤細胞株,按照有限稀釋法進行2～3輪的單細胞亞克隆,純化并建立單克隆抗體細胞系。再次利用IFA方法,同“1.7”所述對雜交瘤細胞上清進行檢測,結(jié)果仍僅與MDV噬斑發(fā)生特異性陽性反應(yīng)且與CEF陰性對照無反應(yīng)的單克隆雜交瘤細胞株,凍存后置液氮中長期保存。留取的單克隆抗體雜交瘤細胞上清,分別用Md5、SB-1和HVT感染CEF,按“1.7”方法進行IFA檢測,鑒定其對不同血清型毒株的交叉反應(yīng)性和特異性。

1.9 gB蛋白真核表達及IFA篩選鑒定

將293 T細胞鋪至24孔板,37.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),待細胞長至50%左右匯合度時。按照LipofectamineTM2000說明書,將pEGFP-gB-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293 T 細胞,置于37.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h,置熒光顯微鏡下觀察出現(xiàn)EGFP綠色熒光后,分別用雞MDV陽性血清、陰性血清和陽性雜交瘤細胞上清為待檢一抗,Dylight 594標(biāo)記的羊抗雞IgG或Dylight 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,按照“1.7”方法進行IFA檢測,篩選gB蛋白特異性的陽性單克隆抗體。

1.10 單克隆抗體腹水制備及亞型鑒定

取無菌的液體石蠟,腹腔注射于經(jīng)產(chǎn)BALB/c母鼠,0.5 mL·只-1。1～2周后,腹腔接種單克隆抗體雜交瘤細胞(3×106～6×106·只-1)。1周左右觀察小鼠腹部及精神狀態(tài),待小鼠腹部明顯膨大后,采集腹水,3 500 r·min-1離心10 min,吸取上清,-80 ℃保存?zhèn)溆?。腹水效價按“1.7”方法進行IFA測定,同時按照小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書,對所篩選到的陽性單克隆抗體進行亞型鑒定。

1.11 共聚焦分析

CEF細胞計數(shù)后,用含5% FBS的M199培養(yǎng)基稀釋混勻,以2 mL·孔-1(含1.3×106個細胞)鋪至6孔板中,38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜,待CEF長至致密單層后棄上清,更換含1% FBS的M199細胞維持液并接種Md5病毒種。38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3 d。待顯微鏡下觀察出現(xiàn)典型病毒噬斑時棄去培養(yǎng)基,加胰蛋白酶-EDTA消化、收集、離心后,用含5% FBS的M199培養(yǎng)基重懸,以2 mL·孔-1(含3×105個細胞)鋪至Φ15 mm共聚焦培養(yǎng)皿中,放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d,待細胞貼壁以后,棄去培養(yǎng)基并向每孔中加入500 μL甲醇/丙酮(1∶1)固定液,室溫固定10 min。棄凈固定液,PBST洗3次,棄凈PBST。每孔加入1 mL含5%脫脂奶的PBST,37 ℃溫箱封閉30 min。棄凈封閉液,PBST洗3次,棄凈。每孔加入500 μL 含5%脫脂奶的PBST稀釋的陽性單克隆抗體腹水(1∶10 000),37 ℃溫箱孵育30 min,棄凈,PBST洗3次,棄凈;每孔加入500 μL Dylight 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶1 000),37 ℃溫箱孵育30 min,棄凈,PBST洗3次,棄凈。每孔加入500 μL 含5%脫脂奶的PBST稀釋的雞MDV陽性血清或陰性血清(1∶1 600),37 ℃溫箱孵育30 min,棄凈,PBST洗3次,棄凈;每孔加入200 μL 含5%脫脂奶的PBST稀釋的Dylight 594標(biāo)記的羊抗雞IgG(1∶400),37 ℃溫箱孵育30 min,棄凈,PBST洗3～5次,棄凈。最后,每孔加入500 μL PBST稀釋的DAPI溶液(1∶1 000),室溫孵育10 min,棄凈,PBST洗3～5次,棄凈。每孔滴加1 mL PBST,剔除氣泡,置共聚焦熒光顯微鏡(LSM 800、Zeiss、德國)下觀察并記錄結(jié)果。

1.12 Western blot分析

收集Md5、SB-1和HVT感染的CEF和陰性對照細胞,分別加上樣緩沖液煮沸后離心,取上清點樣進行SDS-PAGE,快速轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用含5%脫脂奶的PBST室溫封閉2 h,用待檢單克隆抗體腹水(1∶10 000)孵育,4 ℃冰箱過夜,PBST振搖洗滌3次,每次5 min。室溫孵育5%脫脂奶稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(1∶1 000),PBST 振搖洗滌3次,每次5 min。按照ECL顯色液使用手冊操作說明進行顯色,凝膠自動成像儀(FUSION FX5、VILBER LOURMAT、法國)上掃描分析結(jié)果。取出顯色后的PVDF膜,加PBST振搖洗滌5 min取出,然后用5 mL Western blot膜再生液振搖洗滌10 min,棄去膜再生液后再用PBST振搖洗滌5 min。最后將PVDF膜再次按序孵育5%脫脂奶稀釋的羊抗鼠β-actin內(nèi)參抗體(1∶1 000)和HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(1∶1 000),ECL再次顯色后,置凝膠自動成像儀上掃描分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 免疫鼠血清多克隆抗體IFA效價測定

用Md5感染CEF,分別提取病毒/細胞培養(yǎng)物的細胞核蛋白和細胞質(zhì)蛋白,各免疫BALB/c小鼠3只。三免后3周采集小鼠尾靜脈全血,IFA測定多克隆抗體效價。結(jié)果顯示,兩種蛋白制備免疫原免疫小鼠均可產(chǎn)生特異性識別MDV噬斑的抗體,胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白免疫鼠大部分的IFA效價都很高、均可達到1∶3 200,并且前者較后者免疫效果更好(圖1)。

2.2 MDV單克隆抗體雜交瘤細胞庫的構(gòu)建及IFA篩選鑒定

各取胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白免疫的1號小鼠,分別超免后取脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞,按照常規(guī)方法進行細胞融合、鋪板及培養(yǎng)。經(jīng)過對雜交瘤細胞上清進行多輪的IFA染色篩選及單細胞亞克隆純化鑒定,共獲得 31 株穩(wěn)定分泌特異性識別MDV噬斑的單克隆雜交瘤細胞(表1),從而建立了一個MDV特異性的單克隆抗體雜交瘤細胞庫。統(tǒng)計顯示,由MDV感染CEF的胞質(zhì)蛋白免疫產(chǎn)生的陽性雜交瘤(編號1～26)占比達到83.9%,而由胞核蛋白免疫產(chǎn)生的陽性雜交瘤(編號27～31)僅占16.1%。分別用不同血清型MDV代表性毒株Md5、SB-1和HVT感染CEF,對表1列示的雜交瘤細胞上清進行IFA檢測。結(jié)果顯示,31株單克隆抗體雜交瘤細胞中,有4株(J-1F3-C6、J-5C3-F4、J-8B10-G11和J-4D9-C5)為MDV-1、MDV-2和HVT保守的陽性雜交瘤細胞,其余27株(87.1%)均為MDV-1特異性的陽性雜交瘤細胞(表1)。

2.3 MDV糖蛋白gB特異性單克隆抗體的篩選鑒定

用pEGFP-gB-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞,真核表達MDV編碼的糖蛋白gB,然后分別以表1中列示的全部31株MDV陽性雜交瘤細胞上清、雞MDV陽性血清或陰性血清為一抗,以Dylight 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG或羊抗雞IgG為二抗,進行IFA染色。結(jié)果顯示,pEGFP-gB-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的各組293T細胞中均可觀察到EGFP的綠色熒光(圖2),說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并且均正常表達。31株待檢MDV陽性雜交瘤細胞上清中,命名為J-1F3-C6的細胞上清和雞MDV陽性血清一樣,可與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達的MDV糖蛋白gB產(chǎn)生特異性的紅色熒光染色、且與pEGFP-gB-N1轉(zhuǎn)染表達的EGFP綠色熒光完全重合,而在MDV陰性血清染色細胞中未見gB蛋白的特異性紅色染色(圖2)。上述結(jié)果表明,J-1F3-C6為特異性識別gB蛋白的單克隆抗體。

2.4 gB蛋白特異性單克隆抗體的制備及亞型鑒定

將 J-1F3-C6單克隆抗體雜交瘤細胞擴大培養(yǎng),腹腔注射經(jīng)產(chǎn)小鼠制備單克隆抗體腹水,然后用 MDV感染的CEF病毒噬斑和IFA染色測定單克隆抗體腹水的抗體效價。結(jié)果顯示,J-1F3-C6單克隆抗體腹水的IFA效價為 1∶25 600。同時用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒進行檢測,結(jié)果顯示J-1F3-C6單克隆抗體的輕鏈型為Kappa、IgG亞型為IgG2a。

2.5 gB蛋白特異性單抗J-1F3-C6的應(yīng)用分析

分別用不同血清型的MDV毒株(包括MDV-1超強毒株Md5、GX0101、疫苗株CVI988和MDV-2疫苗株SB-1)以及HVT分別感染CEF,利用IFA染色檢測J-1F3-C6與不同來源的gB蛋白反應(yīng)譜。結(jié)果顯示,J-1F3-C6單克隆抗體與5種代表性毒株的病毒噬斑均呈現(xiàn)特異性陽性反應(yīng)(圖3)。共聚焦分析結(jié)果顯示,J-1F3-C6對Md5感染CEF中表達的gB蛋白綠色熒光染色主要集中在細胞質(zhì)內(nèi),而雞MDV陽性血清對細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)均有一定程度的紅色熒光染色,并且這兩種熒光具有很好的重疊性(圖4)。進一步對部分毒株感染的CEF培養(yǎng)物進行Western blot分析,結(jié)果顯示J-1F3-C6與Md5和HVT感染細胞樣品均呈現(xiàn)三個分子量大小明顯不同的特異性蛋白反應(yīng)條帶,而SB-1感染細胞樣品和CEF陰性對照中均無對應(yīng)的特異性蛋白反應(yīng)條帶(圖5)。

3 討 論

圖2 MDV糖蛋白gB特異性單克隆抗體的IFA篩選鑒定Fig.2 Screening and identification of monoclonal antibody specific for MDV glycoprotein gB by IFA staining

MDV基因組龐大,編碼上百種病毒蛋白,但目前可利用的單克隆抗體非常少,難以滿足MDV基因功能、致病機制以及診斷試劑等相關(guān)研究的需求。根據(jù)MDV嚴(yán)格的細胞結(jié)合特性,本研究利用細胞核和細胞質(zhì)提取試劑,分別制備了MDV感染CEF的細胞核和細胞質(zhì)蛋白作為免疫原。該方法簡單快速、可操作性強,僅需要1個T75細胞瓶培養(yǎng)的病毒培養(yǎng)物,即可制備足夠多次使用的小鼠免疫原蛋白。利用該方法提取的細胞核和細胞質(zhì)蛋白,雖然未經(jīng)過純化,但提取的蛋白中包含足夠多的MDV全病毒蛋白。相對于原核表達或真核表達的病毒蛋白,該方法提取的免疫原蛋白不僅可能包含病毒編碼的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白,而且它們的天然構(gòu)象能夠得以保持,避免了表達純化過程中對原有生物學(xué)結(jié)構(gòu)的破壞,比體外表達蛋白制備的免疫原更可靠。將提取的MDV感染細胞核蛋白和細胞質(zhì)蛋白經(jīng)超濾濃縮后分別免疫小鼠,產(chǎn)生的免疫抗體效價高并且特異性強,三免后小鼠血清多克隆抗體的IFA效價均可達到1∶3 200以上,說明該方法制備免疫原的可行性強。此外,利用該免疫原制備方法可以實現(xiàn)免疫一種抗原即可獲得針對多種不同病毒蛋白、構(gòu)建MDV單克隆抗體庫的要求。最終,通過細胞融合并結(jié)合IFA染色的特異性篩選方法,成功構(gòu)建了一個包含31個MDV特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株的抗體庫,說明本研究采取的技術(shù)路線和方法非常成功。統(tǒng)計結(jié)果顯示,上述單克隆抗體雜交瘤細胞株中,83.9%(26/31)的雜交瘤都是由細胞質(zhì)提取蛋白免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生,這可能與MDV編碼表達的絕大部分結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白都主要分布于細胞質(zhì)中有關(guān),也與病毒粒子的復(fù)制和包裝主要位于細胞質(zhì)中相一致。相反,MDV編碼的蛋白主要分布于核內(nèi)的較少,如致瘤蛋白Meq等。進一步的MDV血清型或HVT毒株特異性鑒定發(fā)現(xiàn),該單克隆抗體庫中有27株單克隆抗體是MDV-1特異性的,另外4株(J-1F3-C6、J-5C3-F4、J-8B10-G11和J-4D9-C5)是MDV-1、MDV-2和和HVT共同保守的單克隆抗體。該MDV單克隆抗體庫的建立,不僅為后續(xù)MDV單克隆抗體的篩選鑒定及相關(guān)研究奠定了重要基礎(chǔ),而且為其它類似病毒的抗體研制提供了借鑒。

MDV基因組主要由長獨特區(qū)(UL)和短獨特區(qū)(US)構(gòu)成,在其兩側(cè)分別是兩個序列完全相同的反轉(zhuǎn)重復(fù)序列區(qū)TRL/IRL和TRS/IRS。此前研究表明,獨特序列區(qū)中編碼的MDV基因與其它皰疹病毒具有高度的保守性[31]。在MDV-1、MDV-2和HVT編碼的保守結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白中,有9種糖蛋白包括gB(UL27)、gC(UL44)、gD(US6)、gE(US8)、gH(UL22)、gI(US7)、gK(UL53)、gL(UL1)和gM(UL10)在MDV的組裝和復(fù)制中發(fā)揮重要作用。其中,gB蛋白是MDV復(fù)制所必需的,與其他皰疹病毒的保守性最高,在MDV感染和抗感染中起著重要的免疫保護作用[32]。gB蛋白是由三種分子量大小不同的糖蛋白(gP100、gP60和gP49)組成的蛋白復(fù)合物,是一種非分泌性抗原,主要存在于MDV感染細胞的胞質(zhì)內(nèi)和膜表面,可引起體液免疫和細胞免疫,具有一定的中和活性,在MDV基因工程疫苗研發(fā)中也曾被視為一個十分重要的保護性抗原[33]。本研究中,通過用真核表達質(zhì)粒pEGFP-gB-N1轉(zhuǎn)染293 T細胞,對MDV-1編碼的gB蛋白進行表達,并結(jié)合IFA染色的方法從構(gòu)建的MDV單克隆抗體庫中成功篩選鑒定出一株gB蛋白的特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株J-1F3-C6。該株單克隆抗體不僅在IFA染色中可識別全部3種不同類型的家禽皰疹病毒,而且在Western blot分析中也可以同時識別MDV-1毒株和HVT表達的三種分子量大小不同的gB蛋白條帶。此外,用J-1F3-C6進行共聚焦分析的結(jié)果,也進一步驗證了gB蛋白的非分泌性,表達后主要存在于MDV感染細胞的膜表面和胞質(zhì)內(nèi)[34]。

A. J-1F3-C6;B. β-actin圖5 單克隆抗體J-1F3-C6與MDV感染CEF的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of the reactions between MDV-infected CEF cultures and monoclonal antibody J-1F3-C6

在此前的研究中,課題組已嘗試?yán)们邢蛄鞒瑸V濃縮和凝膠層析技術(shù)相結(jié)合的方法,建立一套較為溫和的病毒粒子純化方法并制備免疫原,構(gòu)建了一個MDV單克隆抗體庫并從中篩選特異性的病毒抗體[35]。與此相比,本研究建立的MDV單克隆抗體庫從中篩選特異性的病毒蛋白單克隆抗體的效率更高。最近,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),我們還構(gòu)建了MDV特定的靶蛋白如pp38和meq的基因編輯缺失毒株、并結(jié)合病毒噬斑IFA交叉篩選的策略,建立了一套高效篩選和鑒定MDV特異性單克隆抗體的新技術(shù),大大提高了MDV單克隆抗體篩選的特異性[36-37]。由于gB基因是MDV復(fù)制的必需基因,無法通過基因編輯獲得缺失毒株并用于單克隆抗體的篩選和鑒定。因此,在本研究中作者通過真核表達gB蛋白并結(jié)合IFA染色,從已建立的MDV單克隆抗體庫中進行篩選和鑒定,很好地解決了這一問題。此外,本研究建立的31個MDV單克隆抗體雜交瘤細胞株中,僅將其中一株gB蛋白單克隆抗體的識別靶標(biāo)得以鑒定。在后續(xù)研究中,仍有待對其它30株雜交瘤細胞株分泌抗體識別的抗原蛋白逐一進行挖掘和鑒定,雖然該項任務(wù)十分艱巨,但對其后續(xù)有效利用至關(guān)重要。本文相關(guān)數(shù)據(jù),為后續(xù)MDV的基因功能、致病機制、診斷技術(shù)及產(chǎn)品研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用MDV嚴(yán)格的細胞結(jié)合特性,提取病毒感染細胞蛋白制備免疫原并免疫小鼠,同時結(jié)合IFA染色篩選的方法,建立了一個容量為31株單克隆抗體雜交瘤細胞的MDV單克隆抗體庫,從中篩選鑒定了一株gB蛋白特異性的單克隆抗體J-1F3-C6,并且是MDV-1、MDV-2和HVT毒株保守的單克隆抗體,可用于IFA染色、共聚焦分析及Western blot試驗。