王培興 謝青云 曾江 張潤蘭 彭海英
基金項目:江西省贛州市衛(wèi)健委課題(2020-2-27)
作者簡介:王培興,男,本科,主管技師。
【摘要】 目的 探討非結核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法和磁珠法提取的差異。方法 選擇2021年1月—2022年4月贛州市第五人民醫(yī)院就診的68例非結核分枝桿菌感染患者為對象,采集非結核分枝桿菌患者痰液或肺部灌洗液,分別采用玻璃珠提取法(觀察組)和磁珠法(對照組)提取核酸,在熒光定量PCR儀檢測下非結核分枝桿菌核酸為陽性,比較2組檢出率。結果 觀察組玻璃珠法提取檢出率為77.94%略高于對照組磁珠法75.00%,但是2種提取方法檢出率比較差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。結論 非結核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法和磁珠法提取差異較小,但玻璃珠法提取檢出率略高,可為臨床診療提供參考依據(jù)。
【關鍵詞】 非結核分枝桿菌;玻璃珠提取法;磁珠法;熒光定量PCR儀
中圖分類號:R446.1? ? ?文獻標識碼:A
文章編號:1672-1721(2023)31-0102-03
DOI:10.19435/j.1672-1721.2023.31.034
非結核分枝桿菌是指結核分枝桿菌、牛分枝桿菌及麻風分枝桿菌以外的分支桿菌,與結核分枝桿菌相比,具有其獨特的特點,能耐受臨床常用的抗結核藥物,但是病菌生長條件較為嚴格,對于生長溫度的耐受性亦不如結核分枝桿菌[1]。非結核分枝桿菌能引起結核樣病變,且抗原與結核分枝桿菌存在交叉,成為當前研究的熱點。磁珠法是分子診斷實驗中常用的提取方法,該方法能實現(xiàn)自動化、大批量的實驗操作,具有操作簡單、用時短、安全無毒及符合環(huán)保理念等優(yōu)點[2]。磁珠與核酸的特異性結合,能提高核酸的純度及濃度。該提取方法具有傳統(tǒng)DNA提取方法難以比擬的優(yōu)勢,廣泛用于血液、組織、拭子、鼻咽分泌物等樣本中[3]。而玻璃珠提取法具有高分散性、流動性較好的特點,質(zhì)量較輕,具有良好的吸水性、絕緣性、化學性及導熱性,且硬度強度均較好,用于核酸檢測中精度和準確度較高[4]。但是,臨床上非結核分支桿菌核酸提取過程中選擇何種方法缺乏統(tǒng)一的標準[5]。本研究以非結核分支桿菌感染患者為對象,探討非結核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法和磁珠法提取的差異,報告
如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料 選擇2021年1月—2022年4月贛州市第五人民醫(yī)院收治的68例非結核分枝桿菌感染患者,男性27例,女性41例,年齡33~82歲,平均(67.96±6.79)歲;體質(zhì)量指數(shù)(body massindex,BMI)18~29 kg/m2,平均(22.51±3.59)kg/m2;治療方式,門診治療3例,住院治療65例;科室來源,感染科門診
1例,胸外科2例,結核科門診2例,感染科23例,骨科2例,呼吸危重二區(qū)7例,結核科一單元9例,結核科二單元17例,結核科三單元5例。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,患者及家屬簽署同意書。
1.2 納入及排除標準 納入標準:符合臨床關于非結核分枝桿菌感染相關標準[6],并最終獲得確診;均能配合完成標本采集,標本類型以灌洗液、傷口分泌物、痰液及支氣管刷檢為主,患者均可耐受;病情尚穩(wěn)定,能進行溝通和交流。排除標準:認知障礙、確診的器質(zhì)性疾病或伴有自身免疫系統(tǒng)疾病者;中途放棄診療或伴有全身感染性疾病者;檢查前行抗結核方案治療或中轉(zhuǎn)上一級醫(yī)院者。
1.3 方法 采集非結核分枝桿菌患者痰液或肺部灌洗液,分別采用玻璃珠提取法(觀察組)和磁珠法(對照組)提取核酸,在熒光定量PCR儀檢測下非結核分枝桿菌核酸為陽性,比較2組檢出率。
1.3.1 儀器設備及試劑 全自動核酸提取儀Smart32 型,購自于中山大學達安基因股份有限公司;直徑為0.5 mm玻璃珠,購自于美國Sigma公司;Trizol試劑,購自于Invitrogen公司;分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法),購自于成都博奧晶芯生物科技有限公司(國械注準20173401341)。
1.3.2 磁珠法 (1)加樣。取灌洗液、傷口分泌物、痰液及支氣管刷檢等標本,連同蛋白酶K置入樣本中進行處理,借助蛋白酶K的輔助作用,消化蛋白質(zhì)為不同的小片段,加速核酸與蛋白酶的分離。(2)上機。待樣本處理完畢后,將樣本處理板放入全自動核酸提取儀(Smart32型)及安裝磁力套。全自動核酸提取儀帶有磁力棒,借助磁力棒吸附磁珠,并在使用前常規(guī)安裝磁力套,避免樣本之間發(fā)生交叉污染。(3)裂解及結合。借助機械臂運動及加熱實現(xiàn)反應液的充分混合均勻,促進細胞的裂解,并釋放核酸;釋放磁珠并充分混勻后,利用磁珠在高鹽低pH值下對核酸具有較強的親和力特點,完成核酸的吸附。(4)洗滌、干燥及洗脫。機械臂移動到洗滌液中,充分混合均勻后,去除各種雜質(zhì);待上述操作完畢后,靜置機械臂5 min,使得磁力棒吸附的磁珠晾干。機械臂移動到洗脫液中,充分混合均勻后,實現(xiàn)核酸和磁珠的分離,最終獲得的洗脫液即提純后的核酸[7]。
1.3.3 玻璃珠提取法 (1)樣本處理。常規(guī)加入和痰等量的質(zhì)量分數(shù)4%NaOH溶液,充分振蕩混合均勻后,室溫下靜置30 min(對于較濃的痰液可適當延長時間)。取1 mL液化后的液體,放入1.5 mL的無菌離心管中,離心5 min,12 000 r/min,去除上層清液;加入洗液1 mL,充分渦旋后離心5 min,12 000 r/min,去除上層清液。加入核酸提取液50 μL,充分渦旋后加入核酸提取管中,放入核酸提取儀(Extractor36),最大轉(zhuǎn)速下振蕩5 min。95 ℃水浴鍋中放置5 min,離心1 min,5 000 r/min,備用,在(-20±5)℃下保存1個月。(2)陰性對照品準備。取陰性對照品50 μL,將其放置在核酸提取管中,放入核酸提取儀,最大速度下振蕩
5 min,水浴鍋中放置5 min,離心1 min,5 000 r/min,置于-20 ℃冰箱中,備用。(3)陽性對照品的準備。精確程度陽性對照品50 μL,將其放置在核酸提取管中,放入核酸提取儀,最大轉(zhuǎn)速下振蕩5 min,95 ℃下水浴鍋中放置5 min,操作完畢后振蕩1 min,5 000 r/min,置于-20 ℃冰箱中,備用。(4)擴增試劑的準備。取擴增反應液,將其放置在冰盒上,解凍,每個樣本取2 μL,加入擴增反應液管中,每次檢測時設陰性、陽性對照,加入量均為2 μL。(5)PCR擴增程度。37 ℃下300 s,循環(huán)數(shù)1;94 ℃下180 s,循環(huán)數(shù)1;94 ℃下15 s、60 ℃下30 s,循環(huán)數(shù)40;50 ℃下10 s,循環(huán)數(shù)1。選擇FAM與HEX通道,熒光采集點選擇60 ℃ 30 s。根據(jù)分析后的圖像調(diào)整基線、閾值線。基線選擇2~15個循環(huán)的熒光信號,亦可根據(jù)情況進行調(diào)整[8-9]。
1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù),計數(shù)資料以百分比表示,采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2? ?結果
觀察組玻璃珠法提取檢出率為77.94%,略高于對照組磁珠法的75.00%,2組檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。
3? ?討論
目前,臨床上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)150多種非結核分枝桿菌,只有少數(shù)非結核分枝桿菌對人類致病。鐘業(yè)騰等[10]研究表明,非結核分枝桿菌在自然環(huán)境中存在,如土壤、自來水管等,人類傳染主要通過接觸空氣環(huán)境中的非結核分枝桿菌引起發(fā)??;非結核分枝桿菌肺病常繼發(fā)于合并肺部基礎疾病,如支氣管擴張、先天性肺囊腫、繼發(fā)結核等,在結構性肺病基礎上均容易繼發(fā)肺結核分枝桿菌肺病。國外學者調(diào)查結果表明,非結核分枝桿菌在人與人之間傳染相對較少,且致病后起病相對緩慢,全身重度癥狀相對較輕。隨著醫(yī)療技術的不斷發(fā)展,基因組DNA分子在科研、臨床及法醫(yī)界中使用較為廣泛,檢驗過程中以DNA樣本作為研究對象的PCR、Southern Blot及RFLP等技術使用較多,如何選擇合適的DNA提取方法對指導臨床診療具有重要的意義。李崇斌等[11]研究表明,可借助抗煮沸試驗進行區(qū)分及鑒別非結核分枝桿菌是否具備致病性。結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌的鑒別,除熱觸酶試驗外,亦可將菌苔置入含有鹽水小滴的玻片上進行研磨,前者不容易發(fā)生乳化而后者乳化較為明顯。目前,臨床上常用的從組織中提取DNA的方法相對較多,包括蛋白酶K法、TKM法等,分別采用不同的試劑裂解細胞去除蛋白質(zhì),然后再采用乙醇完成核酸的沉淀。但是,上述方法操作均相對繁瑣、對儀器及設備要求較高,難以在基層醫(yī)院推廣應用。
磁珠法是臨床上常用的分離培養(yǎng)方法。借助納米技術,能實現(xiàn)超順磁性納米顆粒表面的改良及修飾,并將其制作為超順磁性氧化硅納米磁珠。從微觀角度看,超順磁性氧化硅納米磁珠能與核酸分子特異性的結合并實現(xiàn)其識別。核酸結合到磁珠上主要依靠靜電作用、疏水作用及氫鍵作用,在鹽酸胍、異硫氰酸胍及外磁場的作用下,從血液樣本中分離RNA,并除去非特異性吸附的雜質(zhì),獲得純化后的DNA。從上述分析結果看出,磁珠法核酸提取具有傳統(tǒng)DNA提取方法無法比擬的優(yōu)勢,廣泛用于血液、組織等標本檢測中。
磁珠法在實現(xiàn)DNA提取時亦存在一定的不足,主要表現(xiàn)在以下方面。(1)技術發(fā)展較為滯后。當前磁珠法提取DNA時仍停留在chelex-100法,并未能研發(fā)出新的檢測方法。(2)價格昂貴。盡管磁珠法經(jīng)過不同廠家的改善及升級優(yōu)化,核酸提取成本得到明顯降低,但該檢測方法價格仍相對較高。
玻璃珠法核酸提取用于非結核分枝桿菌中,能獲得較為理想的PCR擴增模板,具有操作簡單、耗時短、省力的優(yōu)點,可獲得良好的經(jīng)濟效益。LI Y等[12]研究表明,磁珠法核酸提取用于非結核分枝桿菌中,每個標本只需7~8粒玻璃珠即可獲得所需的DNA。本研究中,觀察組玻璃珠法提取檢出率為77.94%略高于對照組磁珠法75.00%,但是2種提取方法結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。從本研究結果看出,非結核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法和磁珠法提取差異較小,且不同提取方法各有優(yōu)缺點。
玻璃珠提取法用于非結核分枝桿菌中具有以下優(yōu)點。(1)高分散性、流動性較好。購置玻璃珠時需了解其分散性、流動性,盡可能選擇分散性及流動性較好的玻璃珠。該方法具有操作簡單、省時省力,能實現(xiàn)不同標本中DNA的提取。(2)質(zhì)量相對較輕。玻璃珠的質(zhì)量相對較輕,在實際使用過程中由于質(zhì)量輕的優(yōu)勢進一步拓展其應用場合,且提取過程中能獲得較為理想的PCR擴增模板。(3)玻璃珠的吸水率較低。優(yōu)質(zhì)的玻璃珠吸水率較低,絕緣性、隔音性亦相對較低,化學性質(zhì)較為穩(wěn)定。玻璃珠法提取基因組DNA的,經(jīng)濟性相對較強,提取操作過程中僅需要7~8粒玻璃珠即可提取所需的DNA。(4)導熱性較低、硬度強度良好。非結核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法能獲得更加完整的RNA,能為后續(xù)PCR檢測奠定基礎。非結核分枝桿菌DNA提取過程中,應根據(jù)醫(yī)院及實驗室的醫(yī)療設備、醫(yī)生的專業(yè)技能等,選擇合適的提取方法,以提升非結核分枝桿菌提取準確性、科學性。
綜上所述,非結核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法和磁珠法提取差異較小,但玻璃珠法提取檢出率略高,可為臨床診療提供參考依據(jù)。
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(收稿日期:2023-06-18)