石青青，劉 玲，馬欣旭，張 甜，王藝霖，陳海霞，王化寧

(空軍軍醫(yī)大學(xué)：1西京醫(yī)院心身科，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

焦慮癥是最常見的精神障礙之一[1]，其癥狀范圍廣泛，多與其他精神疾病共病[2]。然而，其潛在的病理生理機制仍有待進(jìn)一步探討。目前越來越多的研究將炎癥和氧化應(yīng)激與焦慮癥聯(lián)系起來，被認(rèn)為是導(dǎo)致焦慮癥的重要機制[3-4]。海馬是調(diào)節(jié)情緒的重要腦區(qū)之一，且與焦慮癥的發(fā)病機制有關(guān)[5]。研究顯示，焦慮模型小鼠海馬的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活、促炎細(xì)胞因子釋放和氧化應(yīng)激水平升高[6-8]。程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)及其配體(programmed cell death ligand 1，PD-L1)在生理免疫穩(wěn)態(tài)中起到核心作用，包括調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化還原平衡[9-10]。然而，其在焦慮癥中的作用尚不明確。因此，本研究利用慢性束縛應(yīng)激(chronic restraint stress，CRS)焦慮模型小鼠，觀察PD-1/PD-L1在CRS小鼠海馬中的表達(dá)水平變化以及對炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的改變，為進(jìn)一步揭示焦慮癥的潛在分子機制提供新思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡大小的清潔級雄性C57BL/6小鼠由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。整個實驗過程符合關(guān)于哺乳動物的飼養(yǎng)及使用規(guī)定，并獲空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號：KY201930030)。

1.1.2 主要試劑和儀器 低溫高速離心機(Micro17/Micro17R，賽默飛世爾科技公司，美國)；電泳儀(基礎(chǔ)型電源164-5050，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，美國)；電轉(zhuǎn)儀(半干轉(zhuǎn)印槽170-3940，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，美國)；全自動化學(xué)曝光分析系統(tǒng)(COMPLEX 2000，南京巴傲得生物科技有限公司，中國)；正置熒光顯微鏡(MF23-M，廣州市明美光電技術(shù)有限公司，中國)；超聲破碎儀(Scientz-ⅡD，寧波新芝生物科技股份有限公司，中國)；無水甲醇(67-56-1，天津市永大化學(xué)試劑有限公司，中國)；超敏發(fā)光液(4AW011-200，北京四正柏生物科技有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及步驟 24只雄性C57BL/6小鼠用聚丙烯PP材質(zhì)的白色、不透明鼠籠進(jìn)行飼養(yǎng)，在清潔級的動物房環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠1周。動物房的溫度控制在22 ℃，濕度控制在55%，照明和黑暗每隔12 h進(jìn)行交替循環(huán)。適應(yīng)1周之后將實驗小鼠隨機分為正常組和模型組，每組12只。正常組不進(jìn)行干預(yù)，模型組進(jìn)行CRS刺激，每日束縛2 h(9∶00～11∶00)，連續(xù)14 d，實驗期間正常組小鼠正常進(jìn)食和飲水，模型組小鼠造模期間禁食，禁水。造模開始后，每隔3 d記錄小鼠的體質(zhì)量變化，造模結(jié)束后24 h進(jìn)行曠場和高架十字迷宮行為學(xué)實驗，評估小鼠的焦慮樣行為。行為學(xué)實驗結(jié)束后，用異氟醚麻醉小鼠取出海馬組織用于后續(xù)實驗。

1.2.2 CRS模型構(gòu)建 提前將50 mL的離心管燙出氣孔平均分散于管壁，離心管蓋子中間也燙出氣孔，孔眼大小和小鼠尾巴粗細(xì)一致，用于后續(xù)造模的束縛管。造模開始前，確保束縛管的數(shù)量是足夠的，造模開始后，將一只小鼠輕輕拿到干凈的空籠子中，安撫并引導(dǎo)小鼠進(jìn)束縛管，不可用暴力將小鼠推進(jìn)束縛管。小鼠進(jìn)去后，蓋上離心管蓋子，小鼠尾巴穿過蓋子中心的小孔，模型組的每只小鼠按此方法進(jìn)行束縛。束縛結(jié)束后，用紙巾擦拭干凈小鼠身上的糞便和尿液，放回原籠中正常飼養(yǎng)，束縛管和蓋子先用清水清洗干凈，再泡在750 mL/L乙醇中15 min，放置在通風(fēng)處晾干，下次使用。

1.2.3 曠場實驗 曠場實驗又稱為敞箱實驗，是評估實驗小鼠自發(fā)活動能力、探索行為和緊張焦慮情緒的一種行為學(xué)測試。整個實驗測試過程由攝像頭進(jìn)行錄像和電腦控制，實驗裝置是由4個大小(50 cm×50 cm×100 cm)、形狀一樣的箱子組成，實驗開始前先將實驗小鼠提前放置在行為學(xué)實驗室適應(yīng)30 min，在此期間設(shè)置好電腦程序。開始實驗時，將小鼠放置在箱子的中心，按下電腦開始鍵進(jìn)行行為跟追、記錄，每只小鼠實驗10 min。一輪測試結(jié)束后，用乙醇擦拭箱底及箱體，防止對下一輪實驗小鼠造成氣味影響，導(dǎo)致實驗誤差。然后對跟蹤視頻進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，觀察指標(biāo)包括運動速度、運動距離、運動時間等。

1.2.4 高架十字迷宮實驗 高架十字迷宮是評價實驗小鼠焦慮狀態(tài)的測評方法。實驗裝置由開臂和閉臂組成，各兩條，大小為寬5 cm×長35 cm×高15 cm，迷宮離地面50 cm左右，實驗全程由攝像頭和電腦進(jìn)行監(jiān)控操作。實驗開始前，將實驗小鼠提前置于行為學(xué)實驗室適應(yīng)30 min，期間調(diào)試電腦程序。開始時將小鼠放置在開臂與閉臂交叉的中心位置，按下電腦開始鍵進(jìn)行行為跟追錄像，每只小鼠追蹤記錄10 min，實驗結(jié)束后換下一只小鼠，每換一只小鼠都要用乙醇擦拭干凈臂底和臂體，避免氣味影響下只小鼠的實驗結(jié)果。最后對實驗視頻進(jìn)行分析、整理，統(tǒng)計實驗指標(biāo)包括進(jìn)入開臂的次數(shù)、時間、百分比等。

1.2.5 蛋白免疫印跡 蛋白免疫印跡實驗是把電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)上，然后利用抗原-抗體反應(yīng)檢測特異性表達(dá)的蛋白分子的技術(shù)。實驗步驟為：①凝膠配制：先配分離膠，根據(jù)所選用的分離膠濃度按量在燒杯混勻，倒入膠板中，大概4.5～5.0 mL，中間不能有氣泡，甲醇或者750 mL/L乙醇壓線后靜置20～25 min；倒掉甲醇或者750 mL/L乙醇后，按量配制濃縮膠加在凝好的分離膠上，立刻插上梳子，靜置20～25 min。②加樣：將提前提取好的小鼠海馬蛋白樣品，按照定量的結(jié)果每孔上樣量為20～30 μg，加樣的順序先正常組后模型組。③電泳：按照負(fù)極對負(fù)極，正極對正極，打開直流穩(wěn)壓電源，先調(diào)至80 V，待樣品跑至分離膠與濃縮膠的分界線時，將電壓改為120 V，溴酚藍(lán)跑至底部1 cm處停止。④半干式轉(zhuǎn)膜：用尺子將聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)裁剪成8 cm×6 cm大小，泡在甲醇中激活30 s左右，后將激活的PVDF膜、凝膠、厚濾紙按照厚濾紙(略大)-PVDF膜-凝膠-厚濾紙(略小)的順序平鋪在半干轉(zhuǎn)盒子里，用滾輪按壓趕走氣泡，蓋上蓋子后裝在半干轉(zhuǎn)儀上進(jìn)行電轉(zhuǎn)，1.0 A恒流電轉(zhuǎn)25 min。⑤封閉：將電轉(zhuǎn)好的PVDF膜置于50 g/L脫脂奶粉(2.5 g的脫脂奶粉，50 mL的1×TBST溶液)的孵育盒中，室溫下在水平搖床上孵育1.5～2.0 h。⑥一抗：封閉后的PVDF膜用1×TBST洗3次，每次10 min，洗滌期間用一抗稀釋液配制要檢測的目的蛋白對應(yīng)的一抗PD-1(Abcam，1∶1 000，英國)、PD-L1(Abcam，1∶1 000，英國)、IL-1Ra(Abcam，1∶2 000，英國)、NF-κB(Abcam，1∶1 000，英國)、IL-1β(Abcam，1∶1 000，英國)、Nrf2(Proteintech，1∶500，美國)、Keap1(Proteintech，1∶2 000，美國)、HO-1(Abcam，1∶1 000，英國)和β-actin(Abcam，1∶5 000，英國)，將不同大小分子量的目的條帶與對應(yīng)的一抗在4 ℃水平搖床上孵育12 h以上。⑦二抗：次日，將一抗回收，用1×TBST洗滌未被結(jié)合的一抗和雜質(zhì)，洗3次，每次10 min，期間用1×TBST配制一抗所對應(yīng)的二抗(兔二抗，Biorbyt，1∶10 000，英國)，條帶洗滌結(jié)束后與相應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育，室溫下在搖床上孵育1.5～2.0 h。⑧顯影：二抗孵育結(jié)束用1×TBST洗3次，每次10 min，洗滌結(jié)束后配制顯影液(A液∶B液=1∶1)，條帶正面朝上放在發(fā)光儀的載物臺上均勻滴加顯影液進(jìn)行發(fā)光。⑨數(shù)據(jù)處理：曝出的條帶用ImageJ軟件進(jìn)行量化分析，用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.6 免疫熒光染色 海馬組織經(jīng)糖水梯度脫水后，切成14 μm的薄片。將片子放在暗盒中室溫靜置30 min，用PBS清洗3次，每次8 min。清洗結(jié)束后，浸泡在抗原修復(fù)液中5 min，加入2 mL/L PBST，室溫靜置20 min后進(jìn)行細(xì)胞打孔，室溫下用10 g/L BSA封閉1.5 h。封閉結(jié)束后，PBS清洗片子3次，每次10 min，分別加入50 μL的一抗PD-L1(Abcam，1∶50，英國)和一抗PD-1(Abcam，1∶50，英國)，4 ℃孵育過夜。次日，倒掉一抗，清洗片子3次，每次10 min，加入熒光兔二抗(Invitrogen，A32731，美國)室溫孵育2 h。倒掉二抗，清洗片子3次，每次10 min，加入DAPI(Merck，D9542-1MG，美國)室溫孵育10 min，清洗3次，每次6 min。封片，熒光顯微鏡下觀察圖片并拍照、分析。

2 結(jié)果

2.1 CRS對小鼠體質(zhì)量變化的影響

焦慮會導(dǎo)致體質(zhì)量發(fā)生改變，從造模第1日開始，每隔3 d記錄下兩組實驗小鼠的體質(zhì)量變化，最后1 d造模結(jié)束24 h后測最后一次體質(zhì)量。記錄下的體質(zhì)量結(jié)果顯示，造模開始后正常小鼠的體質(zhì)量緩慢增加，模型組小鼠的體質(zhì)量則呈下降趨勢，第0、3、6日兩組小鼠的體質(zhì)量變化無顯著性差異，從造模第9日開始，相比正常組，第9、12、15日模型組小鼠的體質(zhì)量與正常組相比出現(xiàn)顯著性的下降(P<0.05，P<0.01，圖1)。結(jié)果顯示，CRS誘導(dǎo)的焦慮模型會導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量發(fā)生改變，使小鼠體質(zhì)量減輕。

n=12；aP<0.05，bP<0.01 vs 正常組。圖1 造模開始后兩組小鼠體質(zhì)量變化折線圖

2.2 CRS對小鼠焦慮樣行為的影響

曠場實驗結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠在曠場中心停留的時間以及在中心區(qū)域活動的距離顯著減少(P<0.01，P<0.05)，去中心區(qū)域探索的次數(shù)也減少了，但無顯著性差異，兩組小鼠在曠場活動的總距離無太大變化(表1)。結(jié)果說明，CRS誘導(dǎo)的焦慮樣模型小鼠，其自發(fā)活動能力及探索行為下降，提示出現(xiàn)了緊張焦慮的情緒。

表1 兩組小鼠曠場實驗結(jié)果的比較

高架十字迷宮是比較經(jīng)典的用來評估實驗動物焦慮狀態(tài)的實驗，該實驗結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比較，模型組小鼠在開臂的時間顯著減少(P<0.01)，進(jìn)入開臂的次數(shù)以及在開臂探索的距離均顯著減少(P<0.01)，在開臂和閉臂總的運動距離也減少了，但無差異性變化(表2)。該結(jié)果以及曠場實驗的結(jié)果表明，CRS誘導(dǎo)的焦慮樣模型是成功的，使小鼠產(chǎn)生了焦慮樣行為表現(xiàn)。

表2 兩組小鼠高架十字迷宮實驗結(jié)果的比較

2.3 CRS小鼠海馬區(qū)相關(guān)炎癥指標(biāo)的變化

為了探究炎癥反應(yīng)在小鼠腦中的表達(dá)變化，行為學(xué)實驗結(jié)束之后，收集海馬組織，利用Western blotting技術(shù)觀察相關(guān)炎癥指標(biāo)在兩組小鼠海馬中的表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組PD-1和PD-L1的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)，NF-κB表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；與正常組相比，模型組抗炎細(xì)胞因子IL-1Ra降低，相反，促炎細(xì)胞因子IL-1β上升，但無顯著性變化(圖2)。結(jié)果表明，在焦慮小鼠海馬中PD-1/PD-L1的表達(dá)水平發(fā)生了改變，且相關(guān)炎癥分子也發(fā)生了變化，提示焦慮可能會觸發(fā)某一炎癥信號，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。

A：5個炎癥指標(biāo)的免疫印跡條帶圖；B：免疫印跡條帶的灰度值分析結(jié)果統(tǒng)計(n=6；bP<0.01)。圖2 兩組小鼠海馬區(qū)相關(guān)炎癥指標(biāo)的表達(dá)水平

2.4 CRS小鼠海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)PD-1/PD-L1陽性細(xì)胞的表達(dá)變化

進(jìn)一步，我們利用免疫熒光直接觀察了小鼠海馬DG區(qū)PD-L1和PD-1陽性細(xì)胞的表達(dá)情況。熒光結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的PD-L1和PD-1陽性細(xì)胞較少(圖3A、C)。進(jìn)一步定量結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠的PD-L1和PD-1陽性細(xì)胞數(shù)量顯著降低(圖3B、D，P<0.05)。該結(jié)果與PD-L1和PD-1的蛋白表達(dá)結(jié)果相一致，說明焦慮會導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)PD-L1和PD-1的表達(dá)改變。

A：PD-L1的免疫熒光圖片；B：PD-L1的陽性細(xì)胞定量分析；C：PD-1的免疫熒光圖片；D：PD-1的陽性細(xì)胞定量分析。DG：海馬齒狀回。n=3；aP<0.05，標(biāo)尺為100 μm。圖3 兩組小鼠海馬DG區(qū)PD-L1和PD-1陽性細(xì)胞的表達(dá)

2.5 CRS小鼠海馬區(qū)氧化應(yīng)激通路相關(guān)指標(biāo)的變化

緊接著，同樣用Western blotting技術(shù)檢測了CRS小鼠海馬區(qū)氧化應(yīng)激通路Nrf2/Keap1/HO-1的蛋白分子表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與正常組相比較，模型組Nrf2、Keap1和HO-1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖4)。結(jié)果說明，CRS會導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生，提示焦慮除了會激活炎癥反應(yīng)還會導(dǎo)致氧化還原失衡。

A：3個氧化應(yīng)激指標(biāo)的免疫印跡條帶圖；B：免疫印跡條帶的灰度值分析結(jié)果統(tǒng)計(n=6；aP<0.05，bP<0.01)。圖4 兩組小鼠海馬區(qū)氧化應(yīng)激通路相關(guān)蛋白分子的表達(dá)水平

3 討論

據(jù)報道，超過30%的成人和青少年在他們的一生當(dāng)中出現(xiàn)過焦慮癥狀，25%～80%入院接受手術(shù)的患者經(jīng)歷過術(shù)前焦慮，焦慮所帶來的負(fù)面情緒和狀態(tài)已嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[11]。CRS動物模型常用于探索慢性應(yīng)激引起的焦慮的發(fā)病機制和病理生理學(xué)[12]。有文獻(xiàn)顯示，小鼠束縛應(yīng)激14 d，每日6 h，可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)明顯的焦慮樣行為[13]。另有文獻(xiàn)表明，每日束縛應(yīng)激2 h，連續(xù)21 d，可導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生焦慮和抑郁樣行為[14]。通過文獻(xiàn)，本實驗每日給予小鼠束縛應(yīng)激14 d，每日2 h，行為學(xué)結(jié)果顯著。與正常組小鼠相比，模型組小鼠去中心探索的次數(shù)、在中心區(qū)域停留的時間以及在中心活動的距離顯著下降，并且模型組小鼠在高架十字迷宮實驗中去開臂的次數(shù)、在開臂停留的時間和在開臂運動的距離也減少了。行為學(xué)結(jié)果表明，給予小鼠束縛應(yīng)激一段時間，可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為。此外，我們在14 d的束縛應(yīng)激期間還記錄了小鼠每隔3 d的體質(zhì)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的體質(zhì)量相比正常組是下降的，且造模第9日開始后模型組與正常組小鼠體質(zhì)量出現(xiàn)顯著性的差異，該結(jié)果與焦慮引起體質(zhì)量減輕的報道是一致的[15-16]。

海馬是哺乳動物大腦中維持新神經(jīng)元生成的區(qū)域之一，成人海馬神經(jīng)發(fā)生與學(xué)習(xí)和記憶以及情緒調(diào)節(jié)有關(guān)[17]。然而，成人海馬神經(jīng)發(fā)生非常容易受到應(yīng)激的影響[18]，因此，成人海馬神經(jīng)發(fā)生的改變與應(yīng)激引起的心理障礙如焦慮癥、抑郁癥和恐慌癥等密切相關(guān)[19]。研究表明，腹側(cè)海馬(ventral hippocampus，vHPC)參與調(diào)節(jié)焦慮樣行為[11]。一項研究利用光遺傳學(xué)或藥物刺激vHPC區(qū)域發(fā)現(xiàn)vHPC雙側(cè)受損會增加小鼠的焦慮樣行為[20]。根據(jù)已有文獻(xiàn)報道，海馬是研究焦慮的關(guān)鍵且重要的區(qū)域之一，尤其是海馬的DG區(qū)域與神經(jīng)炎癥有密切的聯(lián)系[8，21-22]。越來越多的證據(jù)表明，應(yīng)激會增加炎癥，而炎癥是許多疾病的關(guān)鍵介質(zhì)[23-24]。在慢性應(yīng)激下，小膠質(zhì)細(xì)胞會釋放促炎細(xì)胞因子IL-1β，從而加劇應(yīng)激動物的焦慮樣行為，而細(xì)胞因子IL-1β被抑制后則可以逆轉(zhuǎn)小鼠的焦慮樣行為[25-26]，此外，IL-1Ra是IL-1β的天然抑制劑，給予焦慮小鼠IL-1Ra治療，同樣可以減少IL-1β的表達(dá)水平[26]。與該報道一致，我們的Western blotting結(jié)果顯示，CRS之后，小鼠海馬中的IL-1Ra與IL-1β的蛋白表達(dá)水平趨勢相反，無顯著性變化的原因可能是小鼠組內(nèi)差異較大。除此之外，NF-κB是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，活化的NF-κB易位進(jìn)入細(xì)胞核后，會觸發(fā)更多促炎細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α等的表達(dá)[27]。研究表明，束縛應(yīng)激可以上調(diào)皮層中的NF-κB水平并增加前額葉皮層和海馬中的JNK和p38 MAPK的表達(dá)。我們的結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬中NF-κB的表達(dá)水平顯著高于正常組，說明焦慮會激活NF-κB活性，進(jìn)一步觸發(fā)炎癥信號，從而加劇焦慮樣行為。PD-1/PD-L1兩者是受體與配體的關(guān)系，主要在腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫耐受的誘導(dǎo)和維持中發(fā)揮著重要的作用，PD-1及其配體PD-L1或PD-L2負(fù)責(zé)癌癥中T細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞毒性分泌，從而降低抗腫瘤免疫反應(yīng)[28]。PD-L1在小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，可由各種促炎細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、VEGF和IL-10誘導(dǎo)，也可由TLR、IRF1、STAT1、STAT3誘導(dǎo)，且PD-1/PD-L1抑制通路在小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[29-30]，但目前人們對PD-1/PD-L1在焦慮癥患者或在焦慮模型小鼠中的表達(dá)變化以及炎癥反應(yīng)的潛在機制尚無報道。而本實驗通過Western blotting驗證發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1在應(yīng)激小鼠中的表達(dá)是下調(diào)的，進(jìn)一步又通過免疫熒光直接觀察了PD-1/PD-L1在海馬DG區(qū)的陽性細(xì)胞數(shù)量，與蛋白表達(dá)結(jié)果一致。此結(jié)果對后續(xù)探討PD-1/PD-L1在焦慮疾病中的分子機制有著非常重要的作用，后續(xù)實驗我們將進(jìn)一步明確PD-1/PD-L1在焦慮樣小鼠中可能的分子機制。

氧化應(yīng)激常常伴隨炎癥反應(yīng)發(fā)生，兩者均是焦慮等精神疾病的典型病理特征[31]。一項動物實驗結(jié)果表明，CRS會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，并顯著改變大腦中促氧化劑和抗氧化因子之間的平衡[32]。Nrf2/Keap1/HO-1信號通路是重要的抗氧化通路，參與調(diào)節(jié)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡[32]。當(dāng)氧化應(yīng)激被激活時，Nrf2與Keap1解離，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，啟動抗氧化蛋白HO-1的轉(zhuǎn)錄，并抑制NF-κB的活性[33-34]。我們的結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比，CRS之后的小鼠海馬中Nrf2、Keap1和HO-1的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而NF-κB的表達(dá)水平顯著升高。該結(jié)果進(jìn)一步證實，在焦慮模型小鼠中出現(xiàn)了氧化與還原的失衡，激活了氧化應(yīng)激信號通路。

綜上所述，CRS誘導(dǎo)會引起小鼠的體質(zhì)量減輕，使小鼠產(chǎn)生焦慮樣行為，還會觸發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激信號通路。此外，我們還觀察到PD-1/PD-L1在焦慮小鼠海馬中下調(diào)這一現(xiàn)象。本研究為研究焦慮癥的分子病理機制提供了新思路和理論基礎(chǔ)。后續(xù)我們將會通過藥物干預(yù)、基因干預(yù)等手段進(jìn)一步探索PD-1/PD-L1在焦慮模型小鼠腦中的作用及其與炎癥和氧化應(yīng)激通路關(guān)系的可能分子機制。