李云亮，謝鵬飛，劉曉霜，晁嘉品，趙曉雪，王曉靜，馬海樂,

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212000；2.衛(wèi)仕寵物營養(yǎng)科學研究院（江蘇）有限公司，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase EC.3.2.1.23），全稱為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，可通過切割乳糖中由β-1-4-糖苷鍵連接的D-半乳糖殘基，使乳糖降解成為可被機體吸收的β-半乳糖和葡萄糖[1]。β-半乳糖苷酶來源豐富[2]，廣泛存在于哺乳動物、植物和微生物中。在幼年哺乳動物的皮膚、特別是小腸等器官組織中存在豐富的β-半乳糖苷酶[3-4]，而成年個體的消化道內(nèi)β-半乳糖苷酶含量較低，無法很好地分解和利用乳糖；雖然很多食物、植物中均發(fā)現(xiàn)了β-半乳糖苷酶，如番茄[5]、水稻[6]、擬南芥[7]、蘋果[8]和咖啡豆[9]等，然而植物來源的β-半乳糖苷酶在組織中含量并不高，因此提取得率較低[10]；微生物中β-半乳糖苷酶資源很豐富，大腸桿菌、酵母菌、霉菌等細菌、真菌均能產(chǎn)β-半乳糖苷酶。

目前商業(yè)化使用的β-半乳糖苷酶主要采用大腸桿菌、黑曲霉等微生物發(fā)酵法制備，但存在酶活不高、穩(wěn)定性較差等問題，且很多微生物發(fā)酵產(chǎn)物多以胞內(nèi)酶的形式存在，導致酶純化工藝復雜、成本增加。為解決此類問題，研究學者對β-半乳糖苷酶基因進行異源表達，或者將其改造后再進行異源表達，即將β-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)入至外源宿主菌[11]中，利用宿主細胞自身代謝資源（能量分子、氨基酸等）來實現(xiàn)表達[12]，展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景?；诖?，本文對β-半乳糖苷酶的應(yīng)用、β-半乳糖苷酶基因的來源及其異源表達、表達宿主和表達方式展開綜合論述，為β-半乳糖苷酶的開發(fā)與改良提供科學依據(jù)與理論參考。

1 β-半乳糖苷酶的來源及改造

1.1 β-半乳糖苷酶來源

目前NCBI 中登記的β-半乳糖苷酶基因已有1.7 萬余個，圖1 中顯示真核生物共12188 個、細菌4393 個、古生菌415 個以及病毒19 個（截止2023.04.06）。同一家族來源的β-半乳糖苷酶具有相似的催化機制，不同家族來源的β-半乳糖苷酶則在酶學性質(zhì)上有著較大差異，表1 列出了較為常見的不同來源的β-半乳糖苷酶特性。賀璐等[13]發(fā)現(xiàn)細菌來源的β-半乳糖苷酶多為常溫酶，如大腸桿菌和保加利亞乳桿菌來源的β-半乳糖苷酶最適反應(yīng)溫度一般在40 ℃左右，最適作用pH 在6.5～7.5 之間。酵母菌來源的β-半乳糖苷酶具有較強的水解活性[14]，常用于牛乳和乳清中乳糖的水解。霉菌來源的β-半乳糖苷酶最適反應(yīng)溫度通常在50 ℃以上，最適pH 偏酸性，其中黑曲酶[15]來源的β-半乳糖苷酶耐熱耐酸性較強，可用于干酪、牛乳和酸性乳清的水解處理，而米曲霉[16]來源的β-半乳糖苷酶則具有較強的轉(zhuǎn)糖基活性，可用于生產(chǎn)低聚半乳糖。

表1 不同來源β-半乳糖苷酶特性Table 1 Characteristics of β-galactosidase from different sources

圖1 已登記β-半乳糖苷酶基因來源（截止2023.04.06）Fig.1 Registered gene sources of β-galactosidase（until 2023.04.06）

1.2 β-半乳糖苷酶改造

天然微生物以及動植物中的β-半乳糖苷酶存在熱穩(wěn)定性差、酶活低等問題，往往不能很好地滿足目前工業(yè)發(fā)展需求，可通過分子進化手段對β-半乳糖苷酶基因進行定向改造，將其在體外模擬隨機突變[28]、重組，使得目的基因發(fā)生大量變異，篩選獲得具有特定性質(zhì)的目的基因。彭慧等[29]將來源于T.scotoductus的野生型β-半乳糖苷酶GaLT0 的N 端氨基酸序列插入一個經(jīng)過人工改造的雙親短肽序列（AEAEAKAKAEAEAKAKAEAEAKAK），經(jīng)改造后的β-半乳糖苷酶，穩(wěn)定性更高，55 ℃環(huán)境下半衰期提高了10 倍，2 h 內(nèi)可水解牛奶中95%的乳糖。楊萍[30]通過將來源于米曲酶的乳糖酶基因作為出發(fā)點，通過PCR 引物設(shè)計，對基因序列中第211 位氨基酸進行改造，將Thr 突變?yōu)锳sn、Asp、Ser、Pro 和Gly，發(fā)現(xiàn)當?shù)?11 位氨基酸突變?yōu)镻ro 后，在60 ℃環(huán)境下的半衰期相對于野生型的2.06 min 提高到177.73 min，極大地改良了乳糖酶的熱穩(wěn)定性。對β-半乳糖苷酶基因的改造不僅局限于使其具有更廣泛的環(huán)境適應(yīng)范圍，還可以增加自身表達水平、提高酶活力。李晨霞等[31]通過易錯PCR 技術(shù)構(gòu)建了米曲霉β-半乳糖苷酶（AoBgal35A）的突變體文庫[32]并對其進行分析，發(fā)現(xiàn)AoBgal35A 中第955 位的蘇氨酸（Thr）突變?yōu)楸彼幔ˋla），使得極性殘基突變?yōu)榉菢O性殘基，最終獲得的β-半乳糖苷酶的最適pH 提高了0.5，酶活達4760 U/mL，是目前米曲酶來源的β-半乳糖苷酶基因在畢赤酵母中獲得的最高表達水平。目前隨著研究的不斷深入，日趨成熟和完善的多種新型分子進化技術(shù)如DNA 改組[33]、易錯PCR[34]、交錯延伸等方法將有望成為β-半乳糖苷酶基因改造的有效工具。

2 β-半乳糖苷酶的異源表達系統(tǒng)

選擇合適的表達系統(tǒng)是使β-半乳糖苷酶基因得以高效表達的關(guān)鍵因素，目前β-半乳糖苷酶異源表達的系統(tǒng)主要分為原核生物和真核生物表達系統(tǒng)，表2 列出了目前常用的表達系統(tǒng)及其特點。

表2 常見表達系統(tǒng)特點Table 2 Characteristics of common expression systems

2.1 原核表達系統(tǒng)

原核表達系統(tǒng)中最常見的是大腸桿菌表達系統(tǒng)[40]，大腸桿菌生長速度極快，具有連續(xù)發(fā)酵的能力，以及表達量高、生產(chǎn)成本低[41]、遺傳背景清晰[42]等特點，利用其作為表達宿主表達β-半乳糖苷酶基因，技術(shù)路線成熟、可行性高[43]。陳衛(wèi)等[44]將來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶基因連接至大腸桿菌表達載體pET-20b 中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 中誘導表達的重組蛋白比酶活為6.66 U/mg 蛋白，相比于出發(fā)菌株提高了50 倍。徐順清等[45]將來源于乳酸克魯維酵母的乳糖酶基因克隆至大腸桿菌表達載體pET-28a（+）上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 后28 ℃誘導4.5 h，測得乳糖酶酶活為44.78 U/mL 發(fā)酵液，但在添加Ca2+、Zn2+、Fe2、CO2+、Mg2+和Mn2+金屬離子后，酶活分別提高了18.53%、54.49%、293.65%、347.56%、422.95%和549.81%，而Cu2+的添加使得酶活完全被抑制，這為之后完善β-半乳糖苷酶發(fā)酵體系提供了理論依據(jù)。利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)β-半乳糖苷酶時，若稀有密碼子連續(xù)出現(xiàn)，則會一直蛋白質(zhì)的合成，發(fā)生密碼子錯配等現(xiàn)象，所以可在基因的設(shè)計前進行密碼子的優(yōu)化，如非連續(xù)性多核苷酸定點突變法對cDNA 中稀有密碼子進行定點突變，或提高某種氨基酸的tRNA 濃度等。此外，蛋白在表達過程中會存在內(nèi)毒素等有害物質(zhì)殘留風險，限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，所以食品級表達系統(tǒng)的建立對β-半乳糖苷酶的生產(chǎn)也是十分重要的。

乳酸菌，如乳酸乳球菌、乳桿菌和嗜熱鏈球菌等屬于安全的益生菌[46]，利用其作為表達的宿主菌，具有較高的安全性，近些年來該表達系統(tǒng)正成為研究的熱點。孫芝蘭等[47]將Paenibacillussp.K1 乳糖酶基因構(gòu)建至載體pSEC 和Pmg36e 上，電擊轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌（Lactococcus lactisMG1614）中，其表達后獲得的β-半乳糖苷酶對1%的乳糖進行發(fā)酵，乳糖殘余量為0.56%，水解率增加一倍。由于乳酸乳球菌具有較高的食品安全特性，可使用其系統(tǒng)進行食品工業(yè)中相關(guān)蛋白酶制劑的開發(fā)。乳酸菌表達系統(tǒng)大多都是胞內(nèi)表達，自身也存在分泌困難[48]等問題，而芽孢桿菌表達系統(tǒng)與乳酸菌表達系統(tǒng)相比，具備較強的分泌高活性蛋白的能力[49]。許俊勇等[50]首次將來源于環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）的β-半乳糖苷酶基因在枯草芽孢中進行異源表達，經(jīng)過3 L 罐的高密度培養(yǎng)，最終獲得的酶活為138.29 U/mL，是普通搖瓶發(fā)酵的20.3 倍。

利用上述原核表達系統(tǒng)表達的β-半乳糖苷酶以游離酶的形式表達時，可采用酶固定化的方法增強其穩(wěn)定性和重復使用性，如包埋法[51]、吸附法[52]等，但這些方法存在操作過程復雜、成本較高的缺點。為了簡化工藝，酶自固定化法應(yīng)運而生，自固定化指的是酶（或融合酶）在特定條件下，自發(fā)形成不溶狀態(tài)的過程，可采取將含有水不溶性的融合標簽基因和可溶性酶基因組合在一起，使酶以不溶性包涵體的形式表達。王曉靜[53]以李云亮[54]構(gòu)建的金槍魚多肽TunaAI 32 聚體基因為基礎(chǔ)設(shè)計出了兩種水不溶性的融合標簽基因，并與乳糖酶基因進行融合表達，該自固定化乳糖酶的熱穩(wěn)定性比市售乳糖酶更強，在60 ℃保溫1 h 后相對酶活仍達到57.35%，其在低溫環(huán)境中儲藏10 d，仍可保持90%以上的酶活，展示出了良好的應(yīng)用前景。因此自固定化融合標簽開發(fā)和設(shè)計可成為今后科研人員的研究重點之一。

2.2 真核表達系統(tǒng)

真核表達系統(tǒng)相對于原核表達系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾功能[49]，內(nèi)部具有嚴格調(diào)控基因[55]的能力，表達的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)，利用這一特點，真核表達系統(tǒng)常被用于具有復雜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的表達，其中以酵母表達系統(tǒng)最為常見[56]。王敏等[57]將來源于米曲酶β-半乳糖苷酶的基因片段轉(zhuǎn)化至乳酸克魯維酵母GG799 中，在連續(xù)發(fā)酵120 h 后，獲得的蛋白酶活為120.65 U/mL，由于Pklac1 載體含有真菌乙酰胺酶基因，發(fā)酵過程中不用添加任何抗生素，獲得的β-半乳糖苷酶經(jīng)過超濾即可獲得較純酶液，簡化了后期處理過程。而釀酒酵母作為表達宿主也適合用于釀酒工業(yè)和面包等食品的生產(chǎn)加工過程中。酵母表達系統(tǒng)雖增加了蛋白胞外分泌的可能性，使得蛋白純化過程相對于胞內(nèi)表達系統(tǒng)更加容易，但酵母表達系統(tǒng)也存在著分泌蛋白量少，發(fā)酵密度低的問題。

而在哺乳動物表達系統(tǒng)中，可采用哺乳動物細胞作為表達宿主，通過其表達的外源蛋白接近于天然蛋白質(zhì)，可用于重組藥物的生產(chǎn)中，但在表達過程中，外源蛋白的生物學活性與宿主免疫原性有時也會產(chǎn)生差別，導致蛋白不能持久穩(wěn)定表達。此外，此系統(tǒng)所用的表達宿主價格較為昂貴，不太符合大規(guī)模對于β-半乳糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)中。對于真菌表達系統(tǒng)，由于表達自身半乳糖苷酶系（α-型和β-型）的能力比較強，利用該類型宿主表達經(jīng)改造后β-半乳糖苷酶具有很大的價值，但目前相關(guān)研究較少，未來有必要對真菌表達系統(tǒng)開展深入研究，為其工業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

3 β-半乳糖苷酶在食品中的應(yīng)用

根據(jù)我國食品添加劑使用衛(wèi)生標準GB 1886.174-2016[58]，黑曲酶來源的β-半乳糖苷酶可以作為食品添加劑進行使用。β-半乳糖苷酶作為安全性較高的生物酶制劑，其水解乳糖活性及轉(zhuǎn)糖基活性使其在食品工業(yè)等領(lǐng)域大有作為。

3.1 緩解乳糖不耐癥問題

乳糖不耐癥是由負責消化乳糖的腸道β-半乳糖苷酶的活性減少或喪失引起的一種疾病，其以乳糖吸收不良為特征，可能導致腹鳴、腹痛、腹瀉和腸胃脹氣等臨床癥狀，在哺乳動物中普遍發(fā)生于羔羊、仔貓和仔犬等各種幼仔中。據(jù)統(tǒng)計在人體內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性隨年齡的增長而下降，少數(shù)人完全乳糖不耐受，成年人體內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性僅為正常嬰幼兒的5%～10%[59]。目前最有效的方法是在乳制品生產(chǎn)過程中添加β-半乳糖苷酶以分解乳糖，制備低乳糖或者無乳糖的牛奶產(chǎn)品[60]。劉杰等[61]在牛乳中添加0.65%的β-半乳糖苷酶反應(yīng)2 h 可水解72.48%的乳糖，并與益生菌微膠囊混合制備了新型低乳糖益生菌乳粉。我國目前市面上的低乳糖奶制品[62]有零乳糖牛奶、無乳糖舒化奶等，都是通過在生牛乳中添加β-半乳糖苷酶的方式降低乳糖含量。

3.2 生產(chǎn)低聚半乳糖

低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）作為一種益生因子調(diào)理腸胃功能、可被腸道內(nèi)青春雙歧桿菌[63]、兩岐雙歧桿菌[64]、嬰兒雙歧桿菌[65]、長雙歧桿菌[66]、短雙歧桿菌[67]、干酪乳桿菌[68]、嗜酸乳桿菌[69]、唾液乳桿菌[70]等八種益生菌所利用，抑制有害菌的生長、維持腸道菌群生態(tài)平衡[71]、減少腸易激綜合癥的發(fā)生[72]，起到提高人體免疫力的作用[73]，極具市場開發(fā)價值。GOS 主流制備方法是酶法，即利用乳糖為原料，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化水解及轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用，從而形成了由葡萄糖與乳糖組成的混合雜質(zhì)低聚糖[74]。吳昊[75]研究了β-半乳糖苷酶在Mg2+作用下，GOS 的生產(chǎn)率為31.37%遠高于對照組，同時將GOS 與抹茶粉進行復合，也解決了抹茶飲料沉淀的問題。據(jù)研究表明GOS 不僅作為腸道菌群的益生元，也可作為食品添加劑使用，改善食品風味，提高產(chǎn)品質(zhì)地，具有廣闊的市場應(yīng)用前景[76]。

3.3 改良乳制品

在乳制品的加工過程中，由于乳糖溶解度較低，在濃縮乳制品或者冷凍乳制品時，一部分鈣鹽和乳糖結(jié)合導致蛋白質(zhì)沉淀、乳糖結(jié)晶，使得產(chǎn)品口感下降[77]，故而在生產(chǎn)加工過程中添加β-半乳糖苷酶水解乳糖，可以避免由乳糖引起的蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象。另外，在酸乳生產(chǎn)加工中，因發(fā)酵周期長，李興[78]發(fā)現(xiàn)添加β-半乳糖苷酶可使酸乳凝固時間減少15%～20%，有效縮短發(fā)酵周期，且蔗糖用量和產(chǎn)品口感都有所改善[79]；在乳清的加工中，因乳清含有約4%左右乳糖，添加β-半乳糖苷酶后可產(chǎn)生乳清糖漿[2]，乳清糖漿甜度類似于蔗糖，但溶解度較乳糖提升了數(shù)倍，可作為蔗糖的替代品被用于乳清酒、乳清飲料的生產(chǎn)中[80]，極大地改善了產(chǎn)品的風味品質(zhì)，同時拓寬乳清的使用范圍。

4 結(jié)語與展望

β-半乳糖苷酶在緩解乳糖不耐受癥、生產(chǎn)GOS和改良乳制品等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。可將動植物，尤其是微生物來源的β-半乳糖苷酶基因進行修飾后轉(zhuǎn)入至大腸桿菌BL21、釀酒酵母等表達宿主菌中，通過原核或真核表達系統(tǒng)進行異源表達，相對于傳統(tǒng)發(fā)酵法，此方式可有效提高其產(chǎn)量與酶活，降低生產(chǎn)成本。但是目前主流的真核或原核表達系統(tǒng)依然存在純化成本高、安全性偏低等問題，今后除了在現(xiàn)有的異源表達系統(tǒng)基礎(chǔ)上開展大量、深度的研究外，還需要對兼具安全性和高分泌表達能力的表達系統(tǒng)進行探索；此外，如何開發(fā)新型載體和自固定化融合標簽基因，以簡化β-半乳糖苷酶固定化的生產(chǎn)工藝并提高產(chǎn)品質(zhì)量，也應(yīng)是相關(guān)科研人員努力探索的方向之一。加大對β-半乳糖苷酶的異源表達系統(tǒng)的研究力度，不僅對傳統(tǒng)食品科學工程領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義，更有助于拓展β-半乳糖苷酶在醫(yī)療、基因診斷治療和環(huán)境監(jiān)測等多個領(lǐng)域的應(yīng)用范疇。