邵潔玲，單守明，馬軍，雷昊，李亞川，劉成敏*

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

酚類(lèi)物質(zhì)是釀酒葡萄果實(shí)中重要的功能成分，由一系列次生代謝產(chǎn)物構(gòu)成，受葡萄品種、栽培條件和成熟度等因素影響[1]。葡萄果實(shí)中的酚類(lèi)物質(zhì)及其衍生物按其化學(xué)結(jié)構(gòu)主要有：黃烷醇類(lèi)、酚酸類(lèi)、黃酮醇類(lèi)和芪類(lèi)等[2-3]，其中黃烷醇類(lèi)結(jié)構(gòu)主要為C2和C3之間的鏈上有飽和苯并吡喃類(lèi)化合物，且在C3位置上有羥基，賦予葡萄酒風(fēng)味和口感[4]；酚酸類(lèi)物質(zhì)主要以七碳原子（C6-C1）和九碳原子（C6-C3）結(jié)構(gòu)存在于葡萄果實(shí)中，形式多樣，一般可作為輔色物質(zhì)[5-6]；黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的特征是在C2和C3原子之間存在雙鍵，并在C3上存在羥基，對(duì)葡萄和葡萄酒的顏色具有重要作用[7]。此外，芪類(lèi)物質(zhì)的特征為二苯乙烯母核或其聚合物，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，如白藜蘆醇，是葡萄中對(duì)人體健康有益的物質(zhì)[8-9]。這些酚類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)增強(qiáng)葡萄酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。

葡萄品種特性是影響果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)合成的重要因素之一。因其自身結(jié)構(gòu)屬性不同，從而使酚類(lèi)物質(zhì)在果實(shí)中的表現(xiàn)有所差異[10]。孫樹(shù)霖等[11]通過(guò)對(duì)3種紅色釀酒葡萄果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)比較認(rèn)為，品種不同，酚類(lèi)物質(zhì)含量差異明顯；王舒?zhèn)サ萚12]探討了成熟度對(duì)‘赤霞珠’葡萄酒酚類(lèi)物質(zhì)的影響，結(jié)果表明，隨著葡萄成熟度的上升，葡萄酒中黃酮醇和黃烷-3-醇含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)因其特殊的地理位置，被業(yè)界稱(chēng)為優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)，‘北玫’和‘北全’歐山雜種目前在該產(chǎn)區(qū)栽培表現(xiàn)良好[13-15]，但對(duì)其葡萄果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)研究還不夠深入。

因此，基于超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)，以‘北玫’和‘北全’為試材，研究葡萄果實(shí)成熟過(guò)程中單體酚物質(zhì)的積累規(guī)律，明確和比較不同品種酚類(lèi)物質(zhì)差異，以期為產(chǎn)區(qū)葡萄品種調(diào)整，豐富葡萄酒市場(chǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年在寧夏銀川平吉堡“寧夏現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綜合開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究”釀酒葡萄示范園進(jìn)行（38°24′N(xiāo)，106°01′E）。試驗(yàn)地位于銀川平原引黃灌區(qū)中部，年降水量170～200 mm，無(wú)霜期160 d左右，沙質(zhì)土壤。供試材料‘北玫’和‘北全’為歐山雜種，晚熟，7年生，在賀蘭山東麓地區(qū)可不埋土越冬，“廠(chǎng)”形樹(shù)形，管理方式基本一致。

試驗(yàn)中所用沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、蘆丁、兒茶素沒(méi)食子酸酯、阿魏酸、柚皮苷、苯甲酸、楊梅素、水楊酸、白藜蘆醇、桑色素、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別對(duì)葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)色初期、轉(zhuǎn)色盛期、成熟期和采收期取樣。于2020年7月12日（轉(zhuǎn)色初期，S1）選取長(zhǎng)勢(shì)一致的葡萄樹(shù)（各10株），每株樹(shù)體陰陽(yáng)面各選擇1穗果，共計(jì)20穗。其余時(shí)期取樣時(shí)間為2020年8月11日（轉(zhuǎn)色盛期，S2）、2020年9月12日（成熟期，S3）、2020年10月3日（采收期，S4），每次從標(biāo)記好的果穗上、中、下部位采果粒，每個(gè)品種共計(jì)120粒，混勻后，液氮速凍，存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 果實(shí)酚類(lèi)指標(biāo)測(cè)定

單寧含量采用福林-丹尼斯法測(cè)定；總酚含量采用福林酚試劑比色法測(cè)定；花色苷含量以pH示差法測(cè)定。

1.2.3 單體酚含量測(cè)定

果實(shí)單體酚的提取參照劉迪迪等[16]的方案略有改動(dòng)。稱(chēng)取2.0 g果實(shí)粉末，加入提取液（5 mL蒸餾水和45 mL乙酸乙酯），置于搖床（30 ℃、170 r·min-1）避光提取30 min，重復(fù)3次，收集上清液于茄形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干（33 ℃），殘?jiān)? mL色譜甲醇溶洗，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾后備用。全程避光操作，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

色譜分析：使用LC-20A島津超快速液相色譜儀配有SPD二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行定性定量檢測(cè)，色譜條件為波長(zhǎng)280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相A：5%甲醇+0.1%甲酸+水，流動(dòng)相B：5%乙腈+0.1%甲酸+甲醇，流速為1.0 mL·min-1。洗脫程序：0～8 min，10% B；8～30 min，10%～30% B；30～35 min，30%B；35～45 min，30%～40% B；45～50 min，40%～50%B；50～52 min，50%～100% B；52～54 min，100%B；54 min，100%～10% B；54～60 min，10% B。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性單體酚成分，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量，單位用mg·kg-1表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016數(shù)據(jù)整理和制表，IBM SPSS Statistics 27進(jìn)行主成分分析（PCA）和單因素方差分析（One-way ANOVA），LSD法進(jìn)行多重比較（P＜0.05），通過(guò)Origin 2021和SIMCA軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩品種果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)分析

由表1可知，‘北玫’轉(zhuǎn)色初期單寧含量最高，整個(gè)時(shí)期兩品種單寧變化趨勢(shì)一致，呈先下降后上升趨勢(shì)，且采收期兩個(gè)品種含量差異不顯著?！泵怠汀比ㄉ站诔墒炱诳焖偕仙蠓e累緩慢并達(dá)到最大值，分別為2.91、2.94 mg·g-1。總酚含量中‘北玫’成熟時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸下降；而‘北全’在轉(zhuǎn)色初期總酚含量最大，呈先降后升趨勢(shì)，采收期高于‘北玫’。

表1 葡萄果實(shí)單寧、花色苷、總酚含量變化Table 1 Changes of tannin, anthocyanin and total phenol contents in grape fruits mg·g-1

2.2 兩品種果實(shí)單體酚類(lèi)物質(zhì)含量分析

2.2.1 兩品種黃烷醇類(lèi)物質(zhì)含量差異分析

如圖1A所示，‘北玫’和‘北全’品種果實(shí)中共檢測(cè)出4種黃烷醇類(lèi)物質(zhì)，兒茶素含量最高，隨著果實(shí)發(fā)育呈先上升后下降的趨勢(shì)，采收期‘北全’含量顯著高于‘北玫’，是‘北玫’的1.25倍，并且兒茶素含量分別占黃烷醇總量的80.35%和84.14%。整個(gè)發(fā)育時(shí)期來(lái)看，‘北玫’葡萄成熟過(guò)程中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯表現(xiàn)最差，且顯著低于‘北全’，采收時(shí)其含量?jī)H為8.74 mg·kg-1。同時(shí)‘北玫’和‘北全’黃烷醇當(dāng)中均是表兒茶素隨著成熟度增加呈現(xiàn)先增后降,而兒茶素沒(méi)食子酸酯則是逐漸增加,在成熟期達(dá)到最大值。

圖1 葡萄果實(shí)不同黃烷醇類(lèi)化合物含量（A）及總量（B）分布Figure 1 Distribution of different flavanols content (A) and total content (B) in fruit

由圖1B所示，果實(shí)成熟過(guò)程中兩個(gè)品種黃烷醇含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。整個(gè)成熟時(shí)期來(lái)看，轉(zhuǎn)色初期，兩品種黃烷醇含量最低；采收期‘北全’含量顯著高于北玫，‘北全’含量為739.79 mg·kg-1，是‘北玫’的1.18倍。兩個(gè)品種均是在成熟期達(dá)到最大值，但‘北全’黃烷醇化合物積累變化幅度相較于‘北玫’表現(xiàn)緩慢。

2.2.2 兩品種酚酸類(lèi)含量差異分析

如圖2A所示，共檢測(cè)出6種酚酸類(lèi)物質(zhì)，含量最多的為綠原酸，隨著果實(shí)成熟，‘北玫’和‘北全’中均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，其含量分別占酚酸總量的69.32%和67.09%；采收時(shí)期，‘北全’綠原酸含量高于‘北玫’，為201.13 mg·kg-1。整個(gè)發(fā)育時(shí)期來(lái)看，‘北全’葡萄成熟過(guò)程中水楊酸表現(xiàn)最差，采收時(shí)僅為0.41 mg·kg-1。另外，咖啡酸含量居第二位，兩品種均在轉(zhuǎn)色盛期達(dá)到最高值，再逐漸緩慢下降，沒(méi)食子酸、阿魏酸、苯甲酸果實(shí)成熟過(guò)程中積累規(guī)律接近，呈先升后降的趨勢(shì)。

圖2 葡萄果實(shí)不同酚酸類(lèi)化合物含量（A）及總量（B）分布Figure 2 Distribution of different phenolic acids content(A) and total content(B) in fruit

由圖2B所知，酚酸總量和黃烷醇總量物質(zhì)積累變化趨勢(shì)相似。轉(zhuǎn)色初期時(shí)，兩品種酚酸總量最低，‘北玫’在轉(zhuǎn)色盛期達(dá)到最高值，之后逐漸下降，采收期為265.44 mg·kg-1；而‘北全’在成熟期達(dá)到最高值，之后逐漸下降，采收期顯著高于‘北玫’，為‘北玫’的1.13倍。

2.2.3 不同品種黃酮醇類(lèi)含量差異分析

如圖3A所示，北玫’和‘北全’共檢測(cè)出6種黃酮醇類(lèi)化合物，且均是蘆丁含量最高，果實(shí)成熟過(guò)程均表現(xiàn)上升趨勢(shì)，采收時(shí)含量分別為19.08、27.74 mg·kg-1，分別占黃酮醇類(lèi)總量的51.59%、55.48%。同時(shí)，其余黃酮醇類(lèi)組分均呈逐漸上升趨勢(shì)，柚皮苷為‘北全’獨(dú)有。

由圖3B所示，果實(shí)成熟過(guò)程中黃酮醇類(lèi)總量呈逐漸上升的趨勢(shì)，成熟期至采收期‘北全’比‘北玫’上升快。兩品種均于采收期達(dá)到最大值，分別為37.78、50.04 mg·kg-1。

2.2.4 兩品種白藜蘆醇含量差異分析

如圖4所示，整個(gè)成熟過(guò)程中‘北玫’和‘北全’中白藜蘆醇含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。各時(shí)期來(lái)看，轉(zhuǎn)色初期和轉(zhuǎn)色盛期‘北玫’高于‘北全’；而成熟期和采收期與之相反，‘北全’高于‘北玫’。采收時(shí)‘北全’含量為0.61 mg·kg-1，為‘北玫’的2.77倍。此外，兩品種白藜蘆醇均是先快速上升在成熟期達(dá)到最

高值，之后快速下降。

2.3 兩品種酚類(lèi)物質(zhì)主成分分析和差異物質(zhì)篩選

為了探究?jī)善贩N葡萄果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)含量的差異，對(duì)采收期果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，分別對(duì)兩品種單體酚提取2個(gè)主成分（PC）。由圖5可知，非花色苷類(lèi)酚含量指標(biāo)的PC1和PC2分別為85.73%和7.69%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為93.42%。兩品種的果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)含量分離明顯，且從揮發(fā)性成分的變量因子和個(gè)體品種的分布來(lái)看，不同揮發(fā)性成分對(duì)不同品種果實(shí)的貢獻(xiàn)有所差異。

圖5 主成分分析Figure 5 PCA analysis

‘北玫’位于第二象限，結(jié)合各指標(biāo)矢量分布兒茶素沒(méi)食子酸酯、桑色素、楊梅素較‘北全’差異顯著?！比挥诘谝幌笙蓿Y(jié)合矢量分布來(lái)看，兒茶素、蘆丁、白藜蘆醇、沒(méi)食子酸、柚皮苷、阿魏酸較‘北玫’差異性顯著。

為進(jìn)一步分析兩品種果實(shí)中單體酚物質(zhì)差異，利用果實(shí)中單體酚含量數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別（OPLS-DA）分析。由圖6所示，該模型可以清晰的將兩品種區(qū)分，模型的R2x、R2y和Q2值分別為0.979、0.999和0.996，表明結(jié)果較好。采用變量重要性投影值（Variable importance in projection，VIP）篩選兩品種果實(shí)中單體酚化合物的特征差異（圖7），其中VIP值大于1的物質(zhì)是體現(xiàn)樣品間差異的主要成分。共篩選出5個(gè)VIP＞1的物質(zhì)，按貢獻(xiàn)度從高到低依次為兒茶素、兒茶素沒(méi)食子酸酯、綠原酸、表兒茶素、柚皮苷。

圖6 兩品種OPLS-DA模型得分圖Figure 6 Score of OPLS-DA model for two varieties

圖7 OPLS-DA模型中出峰的VIP值Figure 7 VIP value of indicators in OPLS-DA model

3 討論與結(jié)論

寧夏賀蘭山東麓是我國(guó)葡萄種植優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)，冬季寒冷干燥，低溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，該產(chǎn)區(qū)主栽的歐亞種葡萄對(duì)極端低溫的耐受性較差，而冬季埋土防寒不僅加速了樹(shù)體的老化和死亡，而且使勞動(dòng)力成本不斷升高，成為提高葡萄尤其是葡萄酒生產(chǎn)成本的主要原因，因此免埋土葡萄品種的選擇是該區(qū)域的重要研究課題。葡萄采收期的確定將直接影響葡萄果實(shí)的品質(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)含量，進(jìn)而對(duì)葡萄酒的品質(zhì)產(chǎn)生不同程度的影響。因此，通過(guò)了解葡萄原料的多酚物質(zhì)，進(jìn)而科學(xué)地判斷葡萄果實(shí)的成熟度及最佳采收期至關(guān)重要[17-20]。

酚類(lèi)化合物是體現(xiàn)葡萄果實(shí)品質(zhì)的重要物質(zhì)，且葡萄酒的風(fēng)味和品質(zhì)與酚類(lèi)物質(zhì)有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)度[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，‘北玫’和‘北全’兩品種成熟期間單寧和花色苷的積累趨勢(shì)接近，單寧呈先降后升趨勢(shì)，花色苷隨著成熟逐漸升高，與前人研究一致[23]，總酚含量積累趨勢(shì)兩者有所不同，其中采收期總酚、單寧和花色苷含量無(wú)顯著差異。

酚類(lèi)物質(zhì)是葡萄生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的次生代謝產(chǎn)物，可以體現(xiàn)葡萄果實(shí)品質(zhì)，并且具有一定的抗氧化性[25]，葡萄果實(shí)中黃烷醇類(lèi)化合物主要分布于種子和果皮中，占葡萄總酚含量的13%～30%。單體酚類(lèi)主要體現(xiàn)在黃烷醇上，且在種間存在差異[23,26]。本試驗(yàn)中兩個(gè)品種在采收期黃烷醇、酚酸、黃酮醇類(lèi)化合物總量差異顯著，均是‘北全’高于‘北玫’，分別是1.18倍、1.13倍和1.32倍，其主要成分為兒茶素、綠原酸和蘆丁，這與前人研究較為一致[23]；白藜蘆醇含量在成熟期達(dá)到最高值，且在‘北全’中高于‘北玫’。本研究應(yīng)用主成分分析法和正交偏最小二乘判別分析法結(jié)合采收期葡萄果實(shí)的17個(gè)單體酚含量進(jìn)行差異分析和篩選，其中兒茶素沒(méi)食子酸酯、桑色素、楊梅素為‘北玫’主要特征物質(zhì)；兒茶素、蘆丁、白藜蘆醇、沒(méi)食子酸、柚皮苷、阿魏酸為‘北全’主要特征物質(zhì)。進(jìn)一步篩選出黃烷醇類(lèi)化合物為主要差異物質(zhì)，與前人研究結(jié)果一致[27]。此外，白藜蘆醇指標(biāo)成熟過(guò)程中，成熟期至采收期含量快速下降與前人研究有所不同，這可能與品種和地方表現(xiàn)相關(guān)。

綜上所述，兩個(gè)釀酒葡萄品種的酚類(lèi)物質(zhì)含量存在差異，黃烷醇類(lèi)含量最高，酚酸類(lèi)次之，黃酮醇和芪類(lèi)含量較低。其中采收期黃烷醇、酚酸、黃酮醇類(lèi)化合物總量差異顯著，均是‘北全’高于‘北玫’，其主要成分分別為兒茶素、綠原酸和蘆丁。結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析，初步確定‘北全’較‘北玫’發(fā)展?jié)摿Ω浞帧?/p>