劉俊妤，郭方圓，孫悅*

（寧夏大學(xué)葡萄酒與園藝學(xué)院，寧夏銀川 750021）

近年來，葡萄種植模式對(duì)釀酒微生物和葡萄酒品質(zhì)的影響逐漸成為研究熱點(diǎn)。由于消費(fèi)者對(duì)食品安全和健康問題的關(guān)注度增加，“可持續(xù)性”理念將成為葡萄酒進(jìn)入市場(chǎng)的先決條件[1]，有機(jī)葡萄酒市場(chǎng)在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[2]，葡萄種植者和消費(fèi)者均對(duì)有機(jī)葡萄酒，尤其是生物動(dòng)力葡萄酒的生產(chǎn)表現(xiàn)出越來越高的興趣[3-4]。

目前，葡萄的種植方式有常規(guī)種植、有機(jī)種植和生物動(dòng)力種植。常規(guī)種植中，一般使用合成化肥、殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等進(jìn)行田間管理[5]。有機(jī)種植則限制了這些合成制品的使用，種植過程中避免使用合成化肥和農(nóng)藥、轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)物和其他合成添加劑，主要依靠堆肥、有機(jī)肥、菌肥等方法來提高葡萄園的土壤活力和生態(tài)多樣性[6]。生物動(dòng)力種植強(qiáng)調(diào)葡萄園的整體性和生物多樣性，在各項(xiàng)田間管理的時(shí)間上使用特定的生物動(dòng)力制劑，刺激土壤養(yǎng)分循環(huán)，采用特定的天文學(xué)日歷進(jìn)行施肥、修剪、播種等活動(dòng)[7-8]。在有機(jī)葡萄酒和生物動(dòng)力葡萄酒中，適應(yīng)環(huán)境條件的本土酵母非常重要，它們直接影響葡萄酒的風(fēng)土特征[9-10]，促進(jìn)微生物多樣性的形成，使葡萄酒保留典型的感官特征，并具有更復(fù)雜的風(fēng)味[11]。

不同種植模式影響葡萄表面及葡萄園中的酵母菌群結(jié)構(gòu)[12]。研究表明，有機(jī)葡萄栽培提高了葡萄和葡萄園的微生物群落多樣性[13-14]。Hendgen等[15]在德國的長期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)葡萄栽培中，采用覆蓋植被等措施會(huì)影響表層土壤的真菌群落組成，使表土細(xì)菌生物多樣性增加，而不會(huì)影響其物種豐富度。Radi?等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)管理相比，有機(jī)管理下葡萄藤和相關(guān)雜草根器官的真菌內(nèi)生菌定殖、物種豐富度、多樣性指數(shù)更高。Setati等[17]從南非傳統(tǒng)種植和生物動(dòng)力種植相鄰的葡萄園中采集葡萄樣品，發(fā)現(xiàn)生物動(dòng)力葡萄園展示了獨(dú)特的生物多樣性和豐富的物種構(gòu)成。然而，我國葡萄酒行業(yè)的有機(jī)栽培和生物動(dòng)力法栽培剛剛起步，這些種植模式對(duì)本土葡萄酒微生物的影響鮮見報(bào)道，因此研究不同種植模式下酵母菌多樣性差異對(duì)葡萄酒質(zhì)量的提高具有重要意義。

本研究采用WLN培養(yǎng)基形態(tài)學(xué)鑒定和26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，以賀蘭山東麓銀川產(chǎn)區(qū)有機(jī)種植、生物動(dòng)力種植和常規(guī)種植模式下的‘赤霞珠’葡萄為原料，分析其自然發(fā)酵過程中酵母菌群的動(dòng)態(tài)變化，旨在明確不同種植模式對(duì)葡萄酒發(fā)酵過程中酵母菌群的影響，以期為葡萄種植模式的選擇和本土酵母菌株的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料來自寧夏賀蘭山東麓銀川產(chǎn)區(qū)2020年份的‘赤霞珠’葡萄，設(shè)置有機(jī)種植（ORG）及常規(guī)種植對(duì)照組（ORGc），生物動(dòng)力種植組（BND）及常規(guī)種植對(duì)照組（BNDc）。因有機(jī)種植（106°27′E，38°06′N）和生物動(dòng)力（106°26′E，38°31′N）種植園區(qū)相距較遠(yuǎn)，故每種模式都設(shè)有對(duì)照。常規(guī)種植葡萄園按照產(chǎn)區(qū)葡萄園管理規(guī)范進(jìn)行管理，如使用殺蟲劑等預(yù)防葡萄疾病，施用化肥，采用清耕法除草等；有機(jī)種植近5年來按照國家“有機(jī)產(chǎn)品”標(biāo)準(zhǔn)[18]要求進(jìn)行管理；生物動(dòng)力種植近五年來按照“Demeter生物動(dòng)力認(rèn)證”[19]要求進(jìn)行管理。

培養(yǎng)基及主要試劑：WLN營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；引物NL1和NL4（上海生工生物工程股份有限公司）；DNA裂解液（2% Titiov 1% SDS、10 mmol Tris、1 mmol EDTA、100 mmol NaCl）；TE緩沖液；IMTris（pH=7.5）；0.5 mol·L-1EDTA（pH=8.0）；RNase；10×PCR Buffer（含Mg2+）；Taq Plus DNA聚合酶；50×TAE。

主要儀器：高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-50FBS），上海申安醫(yī)療器械廠；電泳儀（DYY-6C），北京六一生物科技有限公司；電泳槽凝膠成像儀（DYCP-32B），北京六一儀器廠；PCR儀（844-0069），德國耶拿分析儀器股份公司；全自動(dòng)凝膠成像儀（Champ Gel 15000），北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄汁發(fā)酵試驗(yàn)

每個(gè)葡萄園隨機(jī)采集45 kg健康、無破損的葡萄，并在采集當(dāng)天置于冷凍盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在無菌環(huán)境下破碎后，每15 kg放于10 L發(fā)酵罐（發(fā)酵體積為8 L）中進(jìn)行發(fā)酵，添加60 mg·L-1焦亞硫酸鉀、30 mg·L-1果膠酶，5～6 ℃浸漬48 h，然后26～28 ℃控溫發(fā)酵，采用CO2失重法監(jiān)控發(fā)酵過程（連續(xù)兩天失重為0.1 g視為發(fā)酵結(jié)束）。3個(gè)發(fā)酵重復(fù)。

1.2.2 酵母菌分離、純化與保藏

在破碎的第0、2、4、6、8天（發(fā)酵結(jié)束）5個(gè)時(shí)期取樣，根據(jù)不同時(shí)期選用各自合適的稀釋梯度在WLN培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，添加青霉素抑制細(xì)菌生長，于28 ℃培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)菌落的菌株形態(tài)選取50～60個(gè)酵母單菌落進(jìn)行純化；純化后的酵母菌使用YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化菌液置于20%的無菌甘油中，-80 ℃條件下保藏備用。

1.2.3 酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)分子鑒定

酵母菌DNA的提取采用石英砂破壁法。酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)序列擴(kuò)增參考Wang等[20]的方法進(jìn)行，具體的PCR擴(kuò)增體系與擴(kuò)增程序如下。

PCR 擴(kuò)增體系（ 25 μL ） ： 引 物N L 1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）各0.5 μL，10×Easy Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，10×Easy Taq Buffer Polymerase 0.25 μL，酵母菌DNA模板1 μL，加ddH2O至25 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min ，72 ℃延伸80 s，循環(huán)36次；72 ℃保溫8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（電壓110 V，電流90 mA，時(shí)間約40 min）進(jìn)行檢驗(yàn)。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工（上海）生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性對(duì)比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪圖使用軟件Origin 2021。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本理化指標(biāo)

按照葡萄酒國家標(biāo)準(zhǔn)[21]測(cè)定了未發(fā)酵葡萄醪及其發(fā)酵結(jié)束時(shí)樣品的基本理化指標(biāo)（表1）。由表1可知，4組樣品葡萄醪的含糖量分別為223.00、224.67、226.33、223.00 g·L-1，且BND的含糖量最高，ORG和BNDc的含糖量最低。4組樣品發(fā)酵結(jié)束時(shí)的含糖量均低于4.0 g·L-1，表明樣品均已完成酒精發(fā)酵，ORGc酒精度最高（13.68%），BND的酒精度（12.85%）最低。BND的糖-酒精轉(zhuǎn)化率明顯低于其他組，推測(cè)其發(fā)酵過程中副產(chǎn)物占比較大，有篩選出低產(chǎn)乙醇酵母的可能，后續(xù)可以做其釀酒特性的相關(guān)研究。葡萄醪的總酸總體在4.09～4.50 g·L-1，pH在3.50～3.90。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，ORG和ORGc的總酸有較為明顯的升高，BND和BNDc的總酸變化較小，pH總體在3.80～3.95。

表1 葡萄醪及其發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄酒的基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physicochemical indexes of grape must and final wine

2.2 酵母菌WLN形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

本研究于不同種植模式、不同發(fā)酵時(shí)期共分離出1075株酵母菌。根據(jù)WLN瓊脂培養(yǎng)基上所表現(xiàn)出的特點(diǎn)，將所有酵母菌初步分為16個(gè)類型（I～XⅥ），結(jié)果見圖1，菌株菌落形態(tài)及數(shù)量統(tǒng)計(jì)見表2。

圖1 WLN培養(yǎng)基上酵母菌種的不同形態(tài)Figure 1 Different morphologies of yeasts on WLN medium

表2 酵母菌的WLN形態(tài)特征及分類結(jié)果Table 2 WLN morphological characteristics and classification results of yeast

在不同種植模式下分離出的酵母菌的WLN類型及其數(shù)量差異較大。由表2可知，ORG共有264個(gè)菌落，其中類型Ⅷ和Ⅻ的數(shù)量最多，均是51株，分別占分離自O(shè)RG總菌株的19.32%；類型Ⅵ和XⅣ數(shù)量最少，分別是1株和2株。ORGc共有276個(gè)菌落，其中類型Ⅸ的數(shù)量最多，共56株酵母菌，占分離自O(shè)RGc總菌數(shù)的20.29%；數(shù)量最少的是類型XⅢ，只有2株。BND共有264個(gè)菌落，其中類型Ⅸ的數(shù)量最多，共47株酵母菌，占分離自BND總菌數(shù)的17.80%；數(shù)量最少的是類型Ⅳ、XⅢ和XⅥ，均有1株。BNDc共有271個(gè)菌落，其中類型Ⅺ的數(shù)量最多，共50株酵母菌，占分離自BNDc總菌數(shù)的18.45%；數(shù)量最少的是類型XⅣ，只有1株。

2.3 26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析

對(duì)W L N 形態(tài)鑒定出來的1 6 個(gè)類型，在不同種植條件下自然發(fā)酵的各時(shí)期隨機(jī)選取1～3株代表菌株進(jìn)行26S rDNA的D1/D2區(qū)測(cè)序鑒定。結(jié)果表明，測(cè)序菌株P(guān)CR片段大小為486～626 bp。經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析被歸為8屬9種（表3），分別為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）、假絲酵母（Candida zemplinina）、拜爾接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、桃梅奇酵母（Metschnikowia fructicola）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、隱球酵母（Cryptococcus saitoi）、庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、單孢釀酒酵母（Kazachstania bulderi）。其中，釀酒酵母在WLN培養(yǎng)基上表現(xiàn)出6種菌落形態(tài)（分別為Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、X、Ⅺ、XⅡ），葡萄汁有孢漢遜酵母和隱球酵母在WLN培養(yǎng)基上表現(xiàn)出2種菌落形態(tài)（分別為I、Ⅱ和XⅢ、XⅣ），而C.zemplinina、Z.bailii、M.pulcherrima、M.fructicola、P.kudriavzevii和K.bulderi這6種酵母菌均只表現(xiàn)出1種形態(tài)（分別對(duì)應(yīng)WLN類型中的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、XⅤ、XⅥ）。

表3 測(cè)序菌株片斷大小及與相關(guān)菌株的序列相似性Table 3 Size of the fragment and sequence similarity to related strains

2.4 自然發(fā)酵各階段酵母群落結(jié)構(gòu)演替及差異比較

由圖2 可見，在未發(fā)酵的葡萄醪中，O RG 有6種酵母菌，其中H.uvarum為優(yōu)勢(shì)酵母，占酵母總數(shù)的33.33%；而S.cerevisae、C.zemplinina、M.pulcherrima、M.fructicola、C.saitoi占比分別為16.67%、12.50%、12.50%、4.17%和20.83%。ORGc有7種酵母菌，其中H.uvarum為優(yōu)勢(shì)酵母，占酵母總數(shù)的33.33%；而Z.bailii、C.saitoi、M.fructicola、M.pulcherrima、C.zemplinina、S.cerevisiae占比分別為2.78%、13.89%、8.33%、19.44%、11.11%和11.11%。BND有6種酵母菌，H.uvarum、S.cerevisiae兩種酵母占比最高，均占酵母總數(shù)的25.00%；而Z.bailii、C.saitoi、C.zemplinina、M.pulcherrima占比分別為4.17%、4.17%、20.83%和20.83%。BNDc有6種酵母菌，H.uvarum占酵母總數(shù)的25.81%為優(yōu)勢(shì)酵母；P.kudriavzevii、M.pulcherrima、C.saitoi、C.zemplinina、S.cerevisiae占比分別為19.35%、9.68%、12.90%、22.85%和9.68%。

圖2 不同種植模式處理下不同時(shí)期酵母菌種屬占比Figure 2 Proportion of yeast species in different periods under different vineyard managements

在葡萄酒發(fā)酵過程中，不同酵母菌種屬的比例表現(xiàn)出較大差異。ORG在第0天以非釀酒酵母為主，從第2天開始，釀酒酵母菌株開始占據(jù)主導(dǎo)地位，H.uvarum還有一定占比，第4、6、8天以釀酒酵母占據(jù)絕大多數(shù)，完全取代非釀酒酵母；ORGc在第0天以非釀酒酵母為主，在第2天釀酒酵母占比上升到43.3%，非釀酒酵母菌占比明顯高于ORG，從第4天到第8天，釀酒酵母為優(yōu)勢(shì)酵母，第4天占比90%以上，第6天、第8天占比達(dá)到100%；BND在第0天、第2天均以非釀酒酵母為主，在第4天釀酒酵母占主導(dǎo)地位，但是非釀酒酵母仍有21.7%的占比，第6天、第8天釀酒酵母占比達(dá)到100%；BNDc在第0天、第2天均以非釀酒酵母為主，在第4天，釀酒酵母占主導(dǎo)地位，非釀酒酵母只有13.3%的占比，第6天釀酒酵母占比達(dá)到100%，第8天釀酒酵母占比98.3%。

3 討論與結(jié)論

本研究從寧夏賀蘭山東麓銀川產(chǎn)區(qū)的有機(jī)種植、生物動(dòng)力種植與常規(guī)種植模式的‘赤霞珠’葡萄自然發(fā)酵樣品中共分離到1075株酵母菌，采用WLN培養(yǎng)基形態(tài)分類和26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析進(jìn)行了菌種鑒定。將其歸為8屬9種，分別是H.uvarum、C.zemplinina、Z.bailii、M.pulcherrima、M.fructicola、S.cerevisae、C.saitoi、P.kudriavzevii、K.bulderi。值得關(guān)注的是，與此前該產(chǎn)區(qū)分離出的酵母結(jié)果相比[22-23]，有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、酵母屬（Saccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、假絲酵母屬（Candida）較為常見，而拜爾接合酵母（Z.bailii），以及單孢釀酒酵母（K.bulderi）鮮見報(bào)道。在常規(guī)種植模式下，葡萄醪中發(fā)現(xiàn)的Z.bailii酵母通常對(duì)許多不利條件具有極強(qiáng)的耐受性，例如高滲透壓、低pH和各種食品防腐劑[24]，有較大可能性存活于使用化學(xué)合成試劑的常規(guī)種植模式，因其對(duì)乙醇更敏感[25]，所以在酒精發(fā)酵過程中減少，釀酒酵母成為優(yōu)勢(shì)菌種。相關(guān)研究表明，在生物動(dòng)力種植模式下，葡萄發(fā)酵第4天新增的酵母菌K.bulderi能夠在低pH條件下依靠葡萄糖和δ-葡萄糖酸內(nèi)酯有效生長，這種獨(dú)特性使K.bulderi成為低pH發(fā)酵過程的理想菌種[26]。

與陳學(xué)蓮等[27]研究相比，在同一生物動(dòng)力種植模式下，兩研究均分離出了9種酵母菌，酵母菌多樣性水平相近，但除H.uvarum和S.cerevisae外，其他7種酵母均不相同，表明酵母菌種類在兩年份之間存在較大差異。在常規(guī)種植模式下，本研究分離出6種酵母菌，比陳學(xué)蓮等[27]的結(jié)果少1種，但M.pulcherrima、H.uvarum和S.cerevisae酵母菌均被分離出，表明常規(guī)種植模式下，兩年份之間酵母菌種類差異小。

本研究中，不同種植模式下的葡萄自然發(fā)酵中的酵母群落結(jié)構(gòu)有一定的差異，尤其是生物動(dòng)力種植模式對(duì)‘赤霞珠’葡萄酒發(fā)酵中的酵母多樣性具有積極影響。生物動(dòng)力種植組的酵母菌多樣性最高，該種植模式下的葡萄酒自然發(fā)酵過程中出現(xiàn)了7屬7種酵母菌，即S.cerevisiae、H.uvarum、C.zemplinina、M.pulcherrima、C.saitoi、Z.bailii和K.bulderi。Bagheri等[28]也發(fā)現(xiàn)，生物動(dòng)力種植中分離出的酵母多樣性更高，與本研究結(jié)果類似。

本文探究了寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)3種種植模式下的‘赤霞珠’葡萄在自然發(fā)酵過程中的酵母菌群演替，為利用有機(jī)種植、生物動(dòng)力種植葡萄酒的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。后續(xù)可進(jìn)一步研究有機(jī)種植模式和生物動(dòng)力種植模式對(duì)‘赤霞珠’葡萄酒的酵母菌代謝產(chǎn)物和香氣成分等發(fā)酵特性的影響，為葡萄種植模式的選擇和本土酵母的開發(fā)利用提供更多依據(jù)。