李紅玉，賀艷楠，李毅麗*

（1.中糧華夏長(zhǎng)城葡萄酒有限公司，河北昌黎 066600；2.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北石家莊 050000；3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院質(zhì)量檢測(cè)與管理系，河北石家莊 050000 ）

釀酒酵母是葡萄酒酒精發(fā)酵的主要微生物，而非釀酒酵母參與到發(fā)酵過(guò)程中，能夠使葡萄酒產(chǎn)生多種酯類、醇類和酸類等復(fù)雜的風(fēng)味化合物，并能提高釀酒酵母的代謝性能，從而對(duì)葡萄酒的色澤、香氣及產(chǎn)品風(fēng)格產(chǎn)生重要影響[1]。利用一些天然存在于葡萄中的具有優(yōu)良釀酒特性的本土非釀酒酵母，與釀酒酵母同時(shí)參與到葡萄酒的酒精發(fā)酵過(guò)程中，有利于促進(jìn)葡萄酒風(fēng)味多樣性的形成，塑造我國(guó)葡萄酒產(chǎn)區(qū)和地域典型性[2]。

混菌發(fā)酵不是兩種微生物的簡(jiǎn)單混合，不同產(chǎn)區(qū)、不同的葡萄品種，所適合的非釀酒酵母、釀酒酵母與非釀酒酵母的混合比例與接種順序具有很大差異，發(fā)酵后的葡萄酒品質(zhì)也各有特色[3-4]。Prior等[5]將克魯維畢赤酵母（P.kluyveri）和釀酒酵母（S.cerevisiae）混合接種，提高了葡萄酒中高級(jí)醇和乙基酯的含量；Renault等[6]將戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）用于混菌發(fā)酵，增強(qiáng)了葡萄酒中乙酯的含量；Anfang等[7]將P.kluyveri與S.cerevisiae以1∶9比例混合發(fā)酵，會(huì)使葡萄酒中果香硫醇的含量增加；楊詩(shī)妮等[8]將Torulaspora delbrueckii和S.cerevisiae以20∶1的比例順序接種混合發(fā)酵，降低了葡萄酒中揮發(fā)酸的含量；還有研究表明，釀酒酵母和非釀酒酵母同時(shí)接種可增加葡萄酒乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯等成分的含量，賦予葡萄酒更豐富的水果香氣[9-10]。

東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）均為葡萄中廣泛存在的非釀酒酵母。東方伊薩酵母不僅具有較好的耐熱能力和耐酒精能力，而且高產(chǎn)乙醇和酯類物質(zhì)，對(duì)于葡萄酒香氣的形成具有重要貢獻(xiàn)[11-12]。葡萄汁有孢漢遜酵母在發(fā)酵過(guò)程中具有較高的β-葡萄糖苷酶活性，這有利于果實(shí)中糖苷結(jié)合態(tài)香氣成分的釋放，增加葡萄酒的香氣復(fù)雜度[13]。目前的研究更關(guān)注的是東方伊薩酵母[12]或葡萄汁有孢漢遜酵母[14]分別與釀酒酵母混合接種，而對(duì)于二者與釀酒酵母特別是國(guó)產(chǎn)安琪酵母的混和發(fā)酵對(duì)紅葡萄酒品質(zhì)影響的研究較為少見(jiàn)。

本研究利用課題組分離純化的天然東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母兩種菌株，在探索了混菌發(fā)酵對(duì)昌黎產(chǎn)區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒品質(zhì)影響的基礎(chǔ)上，以懷來(lái)產(chǎn)區(qū)‘美樂(lè)’和‘赤霞珠’葡萄為原料，繼續(xù)研究混菌發(fā)酵對(duì)葡萄酒香氣成分的影響。通過(guò)檢測(cè)不同樣品的香氣成分組成及含量，計(jì)算關(guān)鍵揮發(fā)性香氣成分的OAV值，同時(shí)進(jìn)行香氣輪廓特征分析和主成分分析，充分探討對(duì)懷來(lái)產(chǎn)區(qū)不同葡萄品種進(jìn)行混菌發(fā)酵時(shí)，所采用的菌株及其比例不同時(shí)，分別呈現(xiàn)出的典型風(fēng)格。這為國(guó)產(chǎn)酵母的應(yīng)用及懷來(lái)產(chǎn)區(qū)葡萄酒特有產(chǎn)品特色的挖掘開(kāi)辟新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料‘赤霞珠’和‘美樂(lè)’均于2021年9月25日采自河北懷來(lái)產(chǎn)區(qū)?！嘞贾椤偺呛繛?14.00 g·L-1，可滴定酸含量為5.63 g·L-1，pH為3.48；‘美樂(lè)’葡萄總糖含量為237.50 g·L-1，可滴定酸含量為5.63 g·L-1，pH為3.47。兩品種衛(wèi)生狀況良好。

酵母菌株：東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）為河北科技大學(xué)飲料酒釀造研究室于2008、2009、2010年分別從河北省昌黎和沙城兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的葡萄園土壤、葡萄果實(shí)表面，以及‘赤霞珠’和‘龍眼’葡萄的自然發(fā)酵過(guò)程中分離、純化的自選酵母菌。安琪釀酒酵母為商品酵母，購(gòu)于安琪酵母股份有限公司。

試劑：葡萄糖、氫氧化鈉、氯化鈉、重亞硫酸鉀（分析純），天津市永大化學(xué)試劑有限公司；3-辛醇（色譜純），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；果膠酶，煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；斐林試劑、次甲基藍(lán)指示劑、酚酞指示劑等按照GB/T 603—2002進(jìn)行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

7820-5975 GC-MS聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取頭、萃取手柄，美國(guó)Supelco公司；T09-1S恒溫磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器有限公司；DHP-520電熱恒溫培養(yǎng)箱，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；雷磁pHS-3C pH計(jì)，上海儀電儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)處理

‘美樂(lè)’葡萄發(fā)酵組：接種安琪釀酒酵母的酒樣（MA）為對(duì)照組；東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母以1∶1的比例同時(shí)接種發(fā)酵所得酒樣（MIA）、葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母以1∶1的比例同時(shí)接種發(fā)酵所得酒樣（MHA）為試驗(yàn)組。

‘赤霞珠’葡萄發(fā)酵組：接種安琪釀酒酵母的酒樣（CA）為對(duì)照組；東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母以1∶1的比例同時(shí)接種（CIA）、有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母以1∶1的比例同時(shí)接種發(fā)酵（CHA）為試驗(yàn)組。

1.3.2 葡萄酒接種與發(fā)酵

將葡萄采收后經(jīng)除梗、破碎、混勻，轉(zhuǎn)入徹底滅菌的10 L玻璃發(fā)酵罐，加入偏重亞硫酸鉀50 mg·L-1、果膠酶30 mg·L-1，混勻后靜置過(guò)夜，以200 mg·L-1的總酵母用量按1.3.1中所述的酵母比例活化后同時(shí)接種，以25～27 ℃的溫度進(jìn)行發(fā)酵。殘?zhí)堑陀? g·L-1后，結(jié)束酒精發(fā)酵，分離得到發(fā)酵原酒。之后，采用控溫啟動(dòng)自然發(fā)酵的方式進(jìn)行蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵，完成后加入50 mg·L-1SO2終止發(fā)酵并滿罐密封貯存，靜置1個(gè)月分離沉淀，陳釀3個(gè)月后對(duì)各發(fā)酵組取樣進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 理化指標(biāo)檢測(cè)

葡萄和葡萄酒中總糖、可滴定酸、pH等理化指標(biāo)的測(cè)定參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.4 香氣成分的檢測(cè)

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HSSPME-GC-MS）技術(shù)檢測(cè)葡萄酒中的香氣成分[15]。

香氣成分的萃?。喝?.0 g NaCl、5.0 mL酒樣、及0.5 mL質(zhì)量濃度為0.3 g·L-1的內(nèi)標(biāo)物3-辛醇，依次放入20 mL頂空瓶中，放入轉(zhuǎn)子，插入萃取頭，置于50 ℃水浴中以1000 r·min-1的轉(zhuǎn)速平衡15 min，推出萃取頭吸附30 min。進(jìn)樣時(shí)要在進(jìn)樣口解析3 min。每個(gè)樣品做3個(gè)獨(dú)立重復(fù)。

色譜條件的設(shè)置：Agilent J&W HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣（99.999 %），流速1.0 mL·min-1；升溫程序：40 ℃保持12 min，以10 ℃·min-1的速率升至120 ℃后保持12 min，再以3 ℃·min-1升至250 ℃保持5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃。MS條件：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子電離源，電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍45～550 u。

香氣成分的定性分析：提取香氣成分質(zhì)譜圖，與NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢索，并參考C8～C20烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，用保留指數(shù)法（Retention Index，RI）對(duì)香氣成分進(jìn)行定性分析。

香氣成分的定量分析[16]：采用內(nèi)標(biāo)半定量法進(jìn)行定量分析，即根據(jù)內(nèi)標(biāo)物與樣品中各香氣成分的峰面積比值，計(jì)算待測(cè)成分的相對(duì)濃度，見(jiàn)公式（1）：

式中：C1為待測(cè)成分的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；f為相對(duì)校正因子，f=1；A1為待測(cè)成分的峰面積；A0為內(nèi)標(biāo)物3-辛醇的峰面積；C0為內(nèi)標(biāo)3-辛醇的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；V0為加入內(nèi)標(biāo)3-辛醇的體積，mL；V1為測(cè)定酒樣的體積，mL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2019、Origin 2018進(jìn)行匯總與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品香氣成分分析

葡萄酒中的香氣成分主要由醇類、酯類、酸類和醛酮類等物質(zhì)構(gòu)成。對(duì)發(fā)酵酒樣進(jìn)行香氣成分分析，如表1所示，所有樣品共檢測(cè)出香氣成分77種，其中包括酯類21種，醇類12種，酸類8種，醛酮類4種，萜烯類10種及其它化合物22種。

表1 酒樣中香氣成分種類及含量Table 1 Types and contents of aroma compounds in wine samples

在香氣物質(zhì)方面，CHA含量最高，為53 243.98 μg·L-1，其次是MHA含量，為44 050.57 μg·L-1，分別比對(duì)照CA組和MA組提高48.40%和51.42%。

2.1.1 酯類組分比較

酯類化合物是葡萄酒的典型香氣成分，大多數(shù)具有鮮花或水果的香氣，主要形成于酒精發(fā)酵過(guò)程和葡萄酒的陳釀過(guò)程[17]?！罉?lè)’樣品中，MIA組酯類物質(zhì)在所有樣品中是最多的，為14種，含量比MA組提高了96.90%；而‘赤霞珠’葡萄發(fā)酵組中CIA和CHA中酯類成分種類和含量均低于對(duì)照組。

發(fā)酵后樣品中共有且含量最高的酯類成分是乙酸乙酯。乙酸乙酯是葡萄酒中最主要的酯類物質(zhì)之一，具有典型的水果香味。MIA中乙酸乙酯含量最多，比對(duì)照組增加123.49%。發(fā)酵后樣品中共有的酯類還有辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯和正己酸乙酯，MHA和CHA中辛酸乙酯、癸酸乙酯含量均高于對(duì)照組。

2.1.2 醇類組分比較

醇類主要是酒精發(fā)酵過(guò)程中氨基酸或糖代謝的產(chǎn)物，是葡萄酒發(fā)酵香氣的最主要成分[16]。由圖1可知，發(fā)酵樣品中醇類物質(zhì)的總含量為16 071.17～40 215.65 μg·L-1，能夠賦予葡萄酒復(fù)雜、濃郁的香氣。MHA和CHA組醇類的總含量最高，為香氣物質(zhì)總含量的74.09%和75.53%，所有醇類中苯乙醇含量最高，分別比對(duì)照組增加107.10%和107.30%，占樣品中高級(jí)醇總含量的99.44%和99.63%；而MIA和CIA組醇類含量雖低于MHA和CHA組，但種類增加。

圖1 酒樣中各類香氣物質(zhì)的比例Figure 1 The proportions of various classes of aroma substances in wine samples

2.1.3 酸類組分比較

發(fā)酵樣品中的酸類物質(zhì)包括乙酸、己酸、異丁酸等8種，其中MIA組中種類最多，含量也最高。樣品中共有的酸類組分有己酸、辛酸、癸酸。辛酸作為C8～C10的低級(jí)脂肪酸，含量大于20 mg·L-1時(shí)具有不良風(fēng)味，低含量時(shí)具有干酪味和粗獷味，能夠抑制芳香酶的水解，維持葡萄酒的香氣平衡。辛酸含量為333.37～1199.34 μg·L-1，其中CHA中含量最多，這會(huì)對(duì)葡萄酒整體香氣產(chǎn)生良好作用。

2.2 關(guān)鍵揮發(fā)性香氣成分的OAV

為了更準(zhǔn)確地區(qū)別不同酒樣中揮發(fā)性香氣成分的差異，查找相關(guān)香氣成分的閾值，計(jì)算得到OAV值[18]。表2中顯示，OAV值大于1的香氣物質(zhì)有13種，這些香氣成分對(duì)酒樣整體香氣有重要貢獻(xiàn)，是組成葡萄酒典型香氣特征的主要成分，其中含量最多的是酯類，是酒樣中特征香氣物質(zhì)。樣品MHA和CHA中酯類物質(zhì)的OAV值分別增加216.82%和169.91%，表明葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)于提高酯類的OAV值效果顯著。

表2 不同處理葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)的OAV（OAV＞1）Table 2 OAV Volues of volatile compounds in the wines obtained by different treatments (OAV＞1)

2.3 關(guān)鍵揮發(fā)性香氣成分的香氣輪廓特征分析

香氣物質(zhì)的感官屬性可通過(guò)香韻（香氣特征類型）和香勢(shì)（香氣活度）來(lái)描述，這是評(píng)價(jià)香氣物質(zhì)香氣質(zhì)和香氣量的重要參數(shù)[19]。葡萄酒中香氣物質(zhì)按照其氣味特征可分為9種香韻類型[20]：1-果香，2-花香，3-植物味，4-堅(jiān)果香，5-焦糖味，6-土腥味，7-化學(xué)味，8-脂肪味，9-烘烤味。計(jì)算各組酒樣中OAV大于1的香氣物質(zhì)的總和，分別歸入果香、花香、脂肪味、焦糖味、化學(xué)味、植物味6種香氣類型。

由圖2可知，MA和CA樣品中果香、花香、植物味、脂肪味較為突出，經(jīng)過(guò)混菌發(fā)酵，酒樣中脂肪味顯著增加，香韻結(jié)構(gòu)比例發(fā)生變化，香韻次序調(diào)整為果香＞脂肪味＞花香＞植物味＞化學(xué)味＞焦糖味，這有利于賦予葡萄酒更為豐富的發(fā)酵香。其中，MHA和CHA樣品中果香和脂肪味的香氣量大幅增加，成為整體香氣的主要貢獻(xiàn)者。

圖2 兩個(gè)品種不同處理的葡萄酒樣品感官香氣輪廓圖Figure 2 Sensory aroma profile of different treaments of two sample wines

2.4 關(guān)鍵揮發(fā)性香氣成分的主成分分析

對(duì)所有OAV大于1的13種揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行PCA分析結(jié)果如圖3（其中得分圖是對(duì)每個(gè)樣品的三組平行試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行的分析，分別標(biāo)注為1，2，3）所示，PC1、PC2和PC3占數(shù)據(jù)總體方差的42.1%、30.5%和12.9%，總貢獻(xiàn)率為85.5%。MHA和CHA組，主要位于PC1的正方向上，香氣特征物質(zhì)為苯乙醇、正己酸乙酯、辛酸乙酯、辛酸等，葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪酵母混合發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵酒樣中香氣成分含量影響較大。CIA與CA接近，MIA與MA在PC1和PC2的方向較為接近，說(shuō)明東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)香氣成分含量的影響不明顯。

圖3 樣品中OAV大于 1 的香氣成分主成分分析的得分圖和載荷圖Figure 3 Principal component analysis (PCA) for aroma compounds (OAV＞1) in samples

3 討論與結(jié)論

在葡萄酒的發(fā)酵過(guò)程中，酵母形成一個(gè)復(fù)雜的體系，不同種群之間進(jìn)行著競(jìng)爭(zhēng)作用或其他相互作用。有研究表明，與單一菌株發(fā)酵的葡萄酒相比，有效利用非釀酒酵母與釀酒酵母的相互作用，可以顯著增加葡萄酒感官質(zhì)量的復(fù)雜性[13]。目前的研究大多集中在分析不同來(lái)源、不同種類的非釀酒酵母的增香特性方面[21]。

本文利用從葡萄生長(zhǎng)環(huán)境中分離所得東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母兩株非釀酒酵母與國(guó)產(chǎn)釀酒酵母菌株進(jìn)行混合發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，東方伊薩酵母參與葡萄酒酒精發(fā)酵，能增加‘美樂(lè)’葡萄酒中酯類、醇類和酸類成分的種類；葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母混菌發(fā)酵，顯著地提高‘美樂(lè)’和‘赤霞珠’葡萄酒中香氣成分的含量，特別是醇類物質(zhì)增加明顯。由此可知，非釀酒酵母可賦予葡萄酒豐富的花香和果香，但非釀酒酵母種類不同，葡萄品種不同，混菌發(fā)酵所得的葡萄酒品質(zhì)有很大差異。試驗(yàn)證實(shí)非釀酒酵母促進(jìn)了‘美樂(lè)’葡萄酒中酯類成分種類和含量的增加，促進(jìn)了‘赤霞珠’葡萄酒中辛酸乙酯、癸酸乙酯的生成，這兩種中鏈脂肪酸乙酯在葡萄酒中起到協(xié)同增香的作用[22]。與東方伊薩酵母相比，葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母的混合發(fā)酵，更有利于增加醇類，特別是苯乙醇的含量，由于苯乙醇是發(fā)酵樣品中共有的高級(jí)醇，也是葡萄酒中最典型的醇類成分，能夠賦予葡萄酒蜂蜜、玫瑰、丁香花等宜人的香味[23]，因此能夠顯著提高‘美樂(lè)’葡萄酒中香氣復(fù)雜性。相比而言，東方伊薩酵母可顯著增加葡萄酒中的乙酸、己酸、異丁酸等酸類物質(zhì)的種類和含量，這些酸類物質(zhì)主要為有機(jī)酸，來(lái)源于發(fā)酵副產(chǎn)物和葡萄漿果，對(duì)于保持酒體平衡和口感清爽具有重要作用。

本試驗(yàn)主要探討了東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母分別與安琪釀酒酵母以1∶1的比例同時(shí)接種發(fā)酵對(duì)葡萄酒香氣成分的影響，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步探索接種比例及接種順序?qū)Σ煌贩N葡萄酒的影響，為推動(dòng)混菌發(fā)酵在實(shí)際生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。