李奇萌，陳運澤，趙國成，楊璟，張國財

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040；2.貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550018；3.賓縣太平山林場,黑龍江 賓縣 150424；4.貴州大學(xué)林學(xué)院,貴州 貴陽 550025）

舞毒蛾Lymantria disparLinnaeus，隸屬鱗翅目Lepidoptera 毒蛾科Lymantriidae，是一種雜食性食葉害蟲，在我國分布范圍廣泛，能夠危害楊樹、柳樹及榆樹等500 多種寄主植物，危害重且經(jīng)常周期性發(fā)生，對林木生長造成嚴(yán)重影響，給我國林業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，舞毒蛾的防治大多采用化學(xué)防治方法，由于化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用，“3R”問題愈演愈烈。植物源農(nóng)藥的有效成分是植物次生代謝物質(zhì)，其來源于植物體內(nèi)，具有易降解、安全性較高、昆蟲不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點[2]；植物次生代謝物質(zhì)不僅具有殺蟲作用，還具有抗真菌作用[3]。因此，開發(fā)利用植物源農(nóng)藥防治有害生物能夠降低化學(xué)藥劑引起的系列問題。

α-三聯(lián)噻吩（α-terthienyl，α-T），作為一種重要的植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于萬壽菊Tagetes erecta、孔雀草Tagetes patula、鱧腸Eclipta prostrata等菊科植物中[4]，對煙草天蛾Manduca sexta和歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis及合毒蛾Orgyia leucostigma等農(nóng)林害蟲具有較強(qiáng)的殺蟲活性[5]，亞致死劑量的α-T 能夠誘導(dǎo)棉鈴蟲Helicoverpa armigera和亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis中腸細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變[6]。蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪是昆蟲生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)成分和能量來源，昆蟲能夠通過調(diào)節(jié)自身特定的代謝途徑，將其轉(zhuǎn)化成為能夠保障生命活動所需的各種營養(yǎng)和能量，以維持其正常的生命活動[7]。當(dāng)受到不良脅迫時，昆蟲自身會產(chǎn)生一系列生理反應(yīng)，體內(nèi)原有的營養(yǎng)積累和組分發(fā)生變化起到保護(hù)昆蟲有機(jī)體的作用[8]。在重金屬脅迫下，舞毒蛾幼蟲的營養(yǎng)取食和營養(yǎng)成分均受到影響，舞毒蛾幼蟲通過提升自身抗氧化力來應(yīng)對重金屬的脅迫[9]。昆蟲的抗氧化系統(tǒng)主要由包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、過氧化氫酶（catalase,CAT）、過氧化物酶（peroxidase,POD）等抗氧化酶和抗氧化劑構(gòu)成[10]，在昆蟲受到外界不良因素的危害時，起到保護(hù)昆蟲正常生長發(fā)育、生理功能正常發(fā)揮的防御作用[11]。熒蒽能夠提高舞毒蛾幼蟲中腸中SOD 和CAT 活性，隨著熒蒽濃度的變化，SOD和CAT 活性也有所不同[12]。昆蟲抗氧化酶活性受到抑制，會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[13]。中腸是昆蟲食物消化和營養(yǎng)吸收的主要器官，對昆蟲的生長發(fā)育有著至關(guān)重要的影響[14]。昆蟲中腸上皮細(xì)胞分泌消化酶，可以作用于蛋白質(zhì) 、碳水化合物和脂肪等基質(zhì)[15]。

α-T 對16 種陸生昆蟲均有殺蟲活性，鱗翅目幼蟲除黑行軍蟲Actebia fennica具有高度耐受性外，均為敏感昆蟲，α-T 對舞毒蛾2 齡幼蟲具有毒殺作用，但α-T 對舞毒蛾幼蟲生理生化的影響尚不明確[16]。筆者以舞毒蛾3 齡幼蟲為供試?yán)ハx，測定α-T 對舞毒蛾3 齡幼蟲的生物殺蟲活性，對其生長發(fā)育、基本營養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化酶（SOD、CAT 和POD）酶活性以及對中腸結(jié)構(gòu)的影響，旨在為α-T 的開發(fā)利用和舞毒蛾的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

純度大于97% 的分析純α-三聯(lián)噻吩（α-terthienyl），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；分析純二甲基亞砜（DMSO），天津市永大化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶酶活性試劑盒（貨號分別為G0105W、G0101W、G0107W，說明書均可在官網(wǎng)上查到），蘇州格銳思生物科技有限公司。

舞毒蛾卵塊采自東北林業(yè)大學(xué)哈爾濱實驗林場，采回后放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。舞毒蛾飼料購于中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所。將舞毒蛾蟲卵放入10%甲醛溶液中浸泡30 min 后，用流水將蟲卵表面的甲醛沖凈，置于溫度（25 ± 1）℃，光周期16L∶8D，相對濕度（75 ±1）%的人工培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)；隨機(jī)挑選大小一致、饑餓12 h 的3 齡幼蟲，用于測定[17]。

1.2 α-T 對舞毒蛾3 齡幼蟲的毒力測定

根據(jù)飼料混藥法[18]，將α-T 溶于體積含量為10%的DMSO 溶液中形成α-T 母液，用蒸餾水將此母液對半稀釋，配制成質(zhì)量濃度為1 000，500，250，125，62.50，31.25 μg/mL 的藥液，置于黑光燈下（功率15 W，燈管與桌面距離為17 cm）光照3 h。選取體型相近的舞毒蛾3 齡幼蟲，饑餓處理12 h，每個質(zhì)量濃度的α-T 處理30 頭幼蟲，重復(fù)3 次，以10%DMSO溶液處理為對照，于處理后72 h 統(tǒng)計死亡蟲數(shù)，計算死亡率和校正死亡率，利用SPSS19.0軟件計算α-T 對舞毒蛾3 齡幼蟲處理72 h 的亞致死濃度（LC20）和致死中濃度（LC50）。

死亡率（%）=死亡蟲數(shù)/供試蟲數(shù)×100；校正死亡率（%）=(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)×100。

1.3 α-T 對舞毒蛾3 齡幼蟲生長發(fā)育影響的測量

根據(jù)毒力測定結(jié)果，采用LC20和LC50的α-T處理舞毒蛾3 齡幼蟲，以10% 的DMSO 溶液處理為對照組，每處理組30 頭幼蟲，重復(fù)3 次；分別在0，12，24，48，72 h 稱量幼蟲體質(zhì)量、飼料和糞便的質(zhì)量，參考鄒傳山 等[19]的方法，校正飼料的自然失水率，計算體質(zhì)量增長量、取食量和糞便量。

1.4 α-T 對舞毒蛾3 齡幼蟲基本營養(yǎng)物質(zhì)含量影響的測定

采用LC20和LC50的α-T 處理舞毒蛾3 齡幼蟲，以10% DMSO 溶液處理為對照組，每組30 頭幼蟲，重復(fù)3 次，分別于24，48，72 h 將試蟲液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。用液氮對試蟲進(jìn)行充分研磨后，取0.1 g樣品，加入1 mL 的生理鹽水冰浴勻漿，4 ℃條件下12 000 r/m 離心10 min，取上清液作為蛋白質(zhì)、碳水化合物和海藻糖含量的測定樣品。蛋白質(zhì)含量的測定采用Bradford 考馬斯亮藍(lán)G-250 法[20]，碳水化合物含量的測定參考Roe[21]的方法，海藻糖含量的測定采用雷芳 等改進(jìn)的蒽酮法[22]，脂質(zhì)含量的測定采用石中斌 等的方法測定[23]。

1.5 α-T 對舞毒蛾3 齡幼蟲中腸抗氧化酶活性的測定

挑選舞毒蛾3 齡幼蟲，用LC20和LC50的α-T處理，以10% 的DMSO 溶液處理為對照組，每組30 頭幼蟲，重復(fù)3 次，分別于24，48，72 h 時解剖舞毒蛾幼蟲，中腸取出后放入PE 管分裝液氮速凍，放入-80 ℃冰箱備用，根據(jù)曾健勇 等[24]的方法，采用分光光度法進(jìn)行測定。

1.6 α-T 對舞毒蛾3 齡幼蟲中腸組織影響的觀察

以10%DMSO 溶液處理為對照組，LC50的α-T為處理組處理舞毒蛾3 齡幼蟲72 h 后解剖，采用HE 染色法[25]，將中腸組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定12 h，制作石蠟切片并于光學(xué)顯微鏡200 倍下觀察。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計分析舞毒蛾幼蟲死亡率、取食量、體質(zhì)量增長量、糞便量，體內(nèi)糖、脂及蛋白含量，抗氧化酶活性，并進(jìn)行單因素方差分析，采用獨立樣本t檢驗的方法比較對照組與處理組的差異顯著性，并計算相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-T 對舞毒蛾3 齡幼蟲的殺蟲活性

不同質(zhì)量濃度α-T 處理舞毒蛾3 齡幼蟲72 h后，表現(xiàn)出良好的殺蟲活性（表1）。隨著質(zhì)量濃度增加，舞毒蛾3 齡幼蟲的死亡率呈上升趨勢，在質(zhì)量濃度1 000 μg/mL 時，舞毒蛾3 齡幼蟲的校正死亡率達(dá)到（68.97 ± 7.18）%。α-T 處理舞毒蛾3 齡幼蟲72 h 的毒力回歸方程為y=-2.011 + 0.894x，R2=0.990，卡方檢驗值χ2=6.98，亞致死濃度（LC20）為20.37 μg/mL，置信區(qū)間2.76～46.23 μg/mL，致死中濃度（LC50）為178.13 μg/mL，置信區(qū)間97.89～322.70 μg/mL。

表1 不同質(zhì)量濃度α-三聯(lián)噻吩處理72 h 后舞毒蛾幼蟲死亡率Tab.1 Mortality rate of L.dispar larvae treated with different mass concentrations of α-T after 72 hours

2.2 α-T 對舞毒蛾幼蟲生長發(fā)育的影響

LC20和LC50的α-T 處理72 h 后，舞毒蛾幼蟲的體質(zhì)量增長量、取食量、糞便量均顯著低于對照組（P<0.05），生長抑制率分別為44.26% 和62.29%，取食量分別降低了35.25%和48.55%，糞便量分別降低了44.71%和63.82%（表2）。

表2 α-三聯(lián)噻吩對舞毒蛾幼蟲生長發(fā)育的影響Tab.2 Effects of α-T on the growth and development of L.dispar larvae

2.3 α-T 對舞毒蛾幼蟲營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

α-T 處理72 h 后，LC20和LC50處理組舞毒蛾3齡幼蟲體內(nèi)的可溶性蛋白含量分別為對照組的69.46%和64.87%，顯著低于對照組幼蟲可溶性蛋白的含量（F=21.514，df=8，P<0.05）；LC20與LC50處理組舞毒蛾幼蟲體內(nèi)碳水化合物含量，分別為對照組的75.95% 和65.88%，均顯著低于對照組幼蟲的含量（F=95.688，df=8，P<0.01）；LC20與LC50的α-T處理組舞毒蛾幼蟲體內(nèi)的海藻糖含量分別為對照組的87.64%和82.54%，均顯著低于對照組（F=8.519，df=8，P<0.05）；LC20與LC50處理組舞毒蛾幼蟲體內(nèi)脂質(zhì)含量分別為對照組的67.77%和62.68%，顯著降低了舞毒蛾幼蟲體內(nèi)脂質(zhì)的含量（F=42.237，df=8，P<0.01）。見表3。

表3 α-三聯(lián)噻吩對舞毒蛾幼蟲體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響Tab.3 Effects of α-T on nutrient contents of L.dispar larvae

2.4 α-T 對舞毒蛾幼蟲中腸抗氧化酶活性的影響

LC50的α-T 處理舞毒蛾3 齡幼蟲中腸72 h 后，CAT 活性顯著降低，僅為對照組的82.78%，SOD 活性顯著降低，為對照組的70.68%，α-T 對CAT，SOD 活性具有抑制作用；舞毒蛾3 齡幼蟲中腸經(jīng)過α-T 處理72 h 后，POD 酶活性和對照組幼蟲相比差異顯著，LC50處理組的POD 酶活性顯著降低，為對照組的86.67%，LC20處理組的POD 酶活性顯著提高，為對照組的1.13 倍。見表4。

2.5 α-T 對舞毒蛾幼蟲中腸組織的影響

對照組10%DMSO 溶液處理的舞毒蛾3 齡幼蟲中腸細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞間排列緊密，腸絨毛分布密集且完整（圖1A）；LC50的α-T 處理72 h后，舞毒蛾3 齡幼蟲中腸組織損傷明顯，柱狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，杯狀細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，腸腔內(nèi)可見細(xì)胞碎片，腸絨毛頂端空泡變性（圖1B）。

圖1 α-三聯(lián)噻吩處理對舞毒蛾幼蟲中腸組織的影響 （A.對照組；B.LC50 處理組）Fig.1 Effects of LC50 α-T on midgut tissue of L.dispar larvae (A.Control group;B.LC50 exposure group)

3 結(jié)論與討論

植物體內(nèi)含有多種活性物質(zhì)，受到昆蟲侵襲時，植物會主動釋放活性物質(zhì)來抵御昆蟲。噻吩類化合物作為植物體內(nèi)一種重要的活性物質(zhì)，能夠影響昆蟲的正常生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致昆蟲死亡[26]。潘忠玉[27]研究發(fā)現(xiàn)，植物次生代謝物槲皮素、綠原酸及1-脫氧野尻霉素能夠抑制美國白蛾5 齡幼蟲的取食和生長發(fā)育，并能通過破壞美國白蛾幼蟲中腸及脂肪體細(xì)胞而產(chǎn)生毒性，處理3 d 后美國白蛾幼蟲開始出現(xiàn)死亡個體，死亡高峰期出現(xiàn)在第3～5 天。本研究中，α-T 作為一種植物次生代謝物質(zhì)，對舞毒蛾3 齡幼蟲具有良好的殺蟲活性，能夠影響幼蟲生長發(fā)育，經(jīng)過α-T 處理過的舞毒蛾幼蟲體內(nèi)可溶性蛋白含量、碳水化合物含量、海藻糖含量和脂質(zhì)含量均有不同程度的下降。Nath 等[28]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷殺蟲劑能夠影響家蠶脂肪體中的蛋白質(zhì)、碳水化合物的含量，從而改變它們的代謝功能，以滿足殺蟲劑脅迫下所需要的能量需求。當(dāng)舞毒蛾幼蟲受到酸堿脅迫時，碳水化合物含量下降30.03%，海藻糖含量和脂質(zhì)含量均顯著降低，同時舞毒蛾幼蟲的抗氧化系統(tǒng)被激活[29]。昆蟲的抗氧化系統(tǒng)主要由抗氧化酶（SOD、CAT 及POD 等）和小分子化合物組成。昆蟲的SOD 主要存在于中腸、血淋巴、脂肪體及體壁等組織中，SOD 能將超氧陰離子如O2-轉(zhuǎn)化為H2O2[30]，然后通過CAT 的催化將過氧化氫分解為水和氧氣[31]。高濃度熒蒽可以提高蚯蚓體內(nèi)的CAT活性，從而導(dǎo)致蚯蚓的急性應(yīng)激反應(yīng)[32]。香芹酚能夠顯著提高舞毒蛾幼蟲體內(nèi)SOD、CAT 的酶活性，舞毒蛾體內(nèi)SOD 活性增加是為了消除由香芹酚引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)[33]。本研究中，低質(zhì)量濃度α-T能夠激活舞毒蛾幼蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化物酶等抗氧化酶活性，而高質(zhì)量濃度的α-T 能夠抑制抗氧化酶活性，表明α-T 能夠通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性引起氧化應(yīng)激反應(yīng)造成對舞毒蛾幼蟲中腸組織的損傷。這與章杰 等[34]研究α-T 對埃及伊蚊Aedes aegypti4 齡幼蟲影響的結(jié)果相吻合。

消化和吸收是中腸的主要功能，中腸是消化道最活躍的區(qū)域，對于昆蟲來說是不可或缺的[35]。本研究中，通過HE 染色法，觀察到α-T 對舞毒蛾3 齡幼蟲中腸組織細(xì)胞具有損傷作用。中腸異?？赡軙?dǎo)致舞毒蛾幼蟲蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收功能的紊亂。因此，中腸可能是α-T 作用的主要部位。

α-T 能夠抑制舞毒蛾3 齡幼蟲體內(nèi)抗氧化酶活性，誘發(fā)中腸組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，并對幼蟲中腸細(xì)胞造成損傷，從而嚴(yán)重影響舞毒蛾幼蟲營養(yǎng)代謝過程，導(dǎo)致舞毒蛾幼蟲的生長發(fā)育受到抑制，進(jìn)而產(chǎn)生毒性。推測α-T 對舞毒蛾幼蟲的主要作用部位可能是中腸，但α-T 對舞毒蛾幼蟲mRNA 表達(dá)水平上的影響尚不明確，下一步將基于mRNA 表達(dá)水平測定α-T 對舞毒蛾3 齡幼蟲中腸的影響，為植物源農(nóng)藥的開發(fā)利用及舞毒蛾無公害防治提供理論依據(jù)。